侧柏炭的质量控制方法与流程

本发明涉及中药饮片质量控制领域，具体涉及一种侧柏炭的质量控制方法。

背景技术：

中药制炭后用于止血距今已有两千年的历史，因其功效显著，至今仍广泛用于临床。“炒炭存性”最早记载于《金匮要略方论》，曰：“烧灰存性，勿令灰过”。宋元时代，开始用炒法和煅法来控制存性程度。近现代认为炭药既保存了原药的部分功效，又具有止血及其它治疗作用，方可谓之存性。侧柏炭为我国常用中药饮片，味苦涩，性微寒，入肺、肝、脾经；专于收涩止血，用于邪热不盛的各种出血证，如吐血、衄血、便血、咯血、崩漏下血等，止血效果好于生侧柏。

侧柏炭临床应用广泛，适用于多种出血症，但目前尚无统一的质量控制方法，难以保证其临床疗效的稳定性，所以炭药质量的控制是临床用药的重要保障。有研究认为鞣质是炭药的止血成分，但侧柏炭炮制前后的鞣质含量测定研究发现，炮制后鞣质含量减少(曾祥丽,丁安伟,单鸣秋.侧柏叶炮制前后鞣质的含量测定[J].中国中医药信息杂志,2008,15(4):45-46.)，此结果与侧柏炒炭后止血作用显著增强的变化不一致。侧柏炭由于缺少好的质量控制方法，难以保证其临床疗效的稳定性。

本发明中槐花炭加热产物中产生的两种化合物是主要止血成分，其化学结构(见下图)，

被命名为Huaicarbon B、Cecarbon(文献1：Chen QY,Yu HL,Wu H,Pan YZ,Wang KL,Liu LP,Jin YP,Zhang CCA novel reduplicate strategy for tracing hemostatic compounds from heating products of the flavonoid extract in Platycladi cacumen by spectrum-effect relationships and column chromatography Molecules,2015,20,16970-16986)。采用高效液相色谱法同时测定该药中Huaicarbon B、Cecarbon两种具有止血功效的指标性成分的含量，解决了侧柏炭质量控制的难题，本发明针对侧柏炭提供了一种实用的质量控制方法。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对现有技术尚无统一的侧柏炭质量控制方法，本发明提供一种侧柏炭的质量控制方法。

技术方案：黄酮类止血成分Huaicarbon B和Cecarbon在侧柏炭质量控制中的应用。

所述应用的具体方法为通过测定侧柏炭中黄酮类止血成分Huaicarbon B和Cecarbon的含量来控制侧柏炭的质量。

具体测定方法为照高效液相法色谱法测定：

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％甲酸的水溶液为流动相梯度洗脱；双波长检测：Huaicarbon B的检测波长254nm，Cecarbon的检测波长为306nm；梯度洗脱程序：0～10min，48wt.％甲醇；10～15min，48wt.％甲醇～60wt.％甲醇；15～25min，60wt.％甲醇；25～30min，60wt.％～80wt.％甲醇；30～40min，80wt.％甲醇；

对照品溶液的制备：分别取相同重量的Huaicarbon B、Cecarbon对照品各2.0～10.0mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作为单标母液；精密移取Huaicarbon B和Cecarbon单标母液混合，体积比1:2，并定容至10mL容量瓶中，配制为混标溶液，备用；

供试品溶液的制备：取侧柏炭粉末0.5～20g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20mL浸泡，称定重量，超声处理30min，补足减失的重量，滤过，得供试品溶液；

含量测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得侧柏炭中Huaicarbon B、Cecarbon含量。

上述槐花炭中Huaicarbon B的含量不低于0.007％，Cecarbon的含量不低于0.018％。

有益效果：本发明对侧柏炭建立了质量控制方法，该方法提供了利用高效液相色谱法同时测定侧柏炭中Huaicarbon B、Cecarbon两种止血指标性成分含量的质量控制方法，该质量标准简便，且能更好地控制药品的质量。本发明的质量控制方法，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现体现药品安全有效、质量可控。

附图说明

图1为混合对照品及侧柏及其6个炮制品的甲醇提取物的HPLC色谱图；

图2为不同批次侧柏炭鼠尾出血时间示意图，注：*数据以平均值±SD表示，n＝6。与空白组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；市售炭品组与相应的自制炭品组比较，#p＜0.05。

具体实施方式

结合具体实施方式，对本发明进一步说明如下：

实施例1

1.两种成分同时测定的含量测定方法为：

1.1药材、仪器与试剂

自制的侧柏炭(PCC)：称取100g侧柏(PC)饮片，待锅面温度达到250℃开始投药，不断均匀翻炒5min(PCC1)、7min(PCC2)、9min(PCC3)，至药物表面呈黑褐色，内部焦黄色。市售的侧柏炭1(PCCP1，130519)，购自亳州市永刚饮片产有限公司；侧柏炭2(PCCP2，150715)，购自亳州清逸中药物科技有限公司；侧柏炭3(PCCP3，121216)，购自南京海源中药饮片有限公司。

Waters 2695-2489PDA高效液相色谱系统；Milli-Q纯水仪；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-500DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

分析用对照品：杨梅苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、穗花双黄酮，纯度均大于98％，购自中国食品药品检定研究院。Huaicarbon B、Cecarbon自制(依照文献1)，度大于92％。HPLC用甲醇、乙腈及甲酸均为色谱纯，超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件

色谱条件Waters 2695-2489PDA高效液相色谱；色谱柱：Dubhe C18(250mm×4.6mm，5.0μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸的水溶液梯度洗脱；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。双波长检测：Huaicarbon B的检测波长为254nm，Cecarbon的检测波长为306nm。梯度洗脱程序：梯度洗脱程序：0～10min，48wt.％甲醇；10～15min，48wt.％甲醇～60wt.％甲醇；15～25min，60wt.％甲醇；25～30min，60wt.％～80wt.％甲醇；30～40min，80wt.％甲醇。

1.2.2对照品溶液的制备

分别取杨梅苷6mg、异槲皮苷2mg、槲皮苷5mg、槲皮素8mg、Huaicarbon B 3mg、山奈酚3mg、异鼠李素3mg、Cecarbon 3mg、穗花双黄酮3mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作为单标母液。精密移取各药物单标母液，Huaicarbon B与Cecarbon单标母液混合，体积比1:2，并定容至10mL容量瓶中，配制为混标溶液，备用。

1.2.3供试品溶液的制备

取侧柏炭0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20mL浸泡，称定重量，超声处理30min，补足减失的重量，滤过，得供试品溶液。

1.2.4线性关系考察

取1.2.2项下的混合对照品溶液，精密稀释至母液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，制备6个浓度水平的对照品溶液，进样分析，以峰面积和进样浓度建立每个目标分析物的回归方程。结果见表1，所有化合物在检测范围内有较好的线性。线性回归分析结果表明标准曲线的相关系数值>0.9990。数据呈现良好的重现性。

1.2.5最低检测限和最低定量限

取1.2.2项下的混合对照品溶液，加入各药物分析用的起始流动相，稀释成一系列浓度由高到低的溶液，取信噪比为(S/N)3及10时的对照品浓度为最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)。结果见表1，LOD值在0.17～0.72μg/mL，LOQ值在0.60～2.5μg/mL。

表1侧柏叶各标准品的线性回归方程、相关系数、线性范围、最低检测限及最低定量限

1.2.6精密度试验

精密吸取1.2.2项下的混合对照品溶液10μL，连续进样6次，考察日内精密度，连续分析3天，考察日间精密度。用于目标分析物定量的精密度结果见表2，结果显示所有的相对标准差(RSD)值不超过5.0％。

1.2.7稳定性和重复性试验

精密吸取1.2.3项下制备的供试品溶液适量，于0h、4h、8h、12h、24h及48h测定样品，考察定量分析的稳定性。按照1.2.3项下供试品制备的方法制备6份样品，分别进样，考察定量分析的重复性。用于目标分析物定量的重复性、稳定性结果见表2，结果显示所有的相对标准差(RSD)值不超过5.0％。

1.2.8加样回收率

取已知被测成分含量的样品6份，精密称定，分别精密加入一定量的被测成分对照品(加入量与所取样品含量之比为1:1)，按1.2.3项下的方法制备样品后进样。按回收率(％)＝(加标样品测定值-样品测定值)/加标量×100％计算回收率。结果见表2，所有待测成分的回收率值在95.32％～103.29％范围内，符合要求。

表2侧柏叶各标准品重复性、稳定性、精密度及加样回收率的测定结果

1.2.9样品含量测定

取1.2.2项下各药物的混合对照品溶液及1.2.3项下各药物供试品溶液，进样10μL，各批次侧柏炭色谱图见图1。将得到的各药物中待测成分的峰面积代入线性方程中计算含量，结果见表3。

表3侧柏及侧柏炭中黄酮类成分定量分析结果

从结果可见，生品中含有多种黄酮类成分，炒炭后黄酮苷类均减少，而黄酮苷元增加，并且生成了huaicarbon B和cecarbon。黄酮苷元未见有止血作用的报道，而huaicarbon B和cecarbon被认为具有显著的止血作用(见文献1)。

2.不同批次炭药及huaicarbonB的止血作用差异

2.1分组及给药

取大鼠30只，随机分为空白组、阳性药组、PCC2组、PCCP2组、huaicarbonB组，每组6只。按等效给药剂量＝临床剂量/60kg×6.3，再折算成生药剂量为1.05g/kg，0.5％CMC-Na溶液作空白，云南白药(YNBY)作阳性对照药(0.3g/kg)；动物适应性饲养一段时间后开始灌胃，一天两次，药物的灌胃给药体积为1.0mL/100g。于第4天灌胃后的30min开始指标测定。

2.2鼠尾出血时间(Bleeding Time，BT)测定

用1％戊巴比妥钠(40mg/kg，腹腔注射)将大鼠麻醉。先将鼠尾沉浸在37℃生理盐水中预温2min，距鼠尾1mm处用干净的手术刀剪断诱导出血。出血时间是从剪断开始出血到停止出血所需时间，待血流停止30s为停止出血。

2.3结果

由见图2结果显示。与空白组比较，自制侧柏炭2(PCC2)及huaicarbon B能极显著缩短出血时间，说明他们均有止血作用。

与不含huaicarbon B及cecarbon的市场购买炭品(PCCP2)比较，自制炭品(PCC2)止血作用显著强于PCCP2，因huaicarbon B、cecarbon具有止血作用(文献1)，表明huaicarbon B、cecarbon可能是侧柏炭的主要止血活性成分，也说明炒炭的炮制工艺会显著影响炭品的体内药效。huaicarbon B、cecarbon的存在与否，将显著影响侧柏炭的止血作用。各批次侧柏炭鼠尾出血时间见图2。