本发明涉及到一种西洋参中人参皂苷类成分的含量测定方法，属中药技术领域，具体的，涉及一种西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1四种成分同时测定的含量测定方法。
背景技术：
西洋参(学名：Panax quinquefolius)是五加科人参属多年生草木植物，别名花旗参、洋参、西洋人参、American ginseng，原产于加拿大的大魁北克与美国的威斯康辛州，中国北京怀柔与长白山等地也有种植。西洋参性凉，味甘、微苦；可补气养阴，清热生津。用于气虚阴亏，内热，咳喘痰血，虚热烦倦，消渴，口燥喉干。西洋参益肺阴，清虚火，生津止渴。治肺虚久嗽，失血，咽干口渴，虚热烦倦。西洋参中主要成分为人参皂苷类，西洋参所含有效成分与人参单体皂苷类别基本相同，甚至所含皂苷元也完全一致，均系齐墩果酸、人参二醇和人参三醇。但由于人参二醇单体皂苷的Rb1的含量高于人参，因此，形成二者疗效和应用上的差异，各有特色不可互相替代。建立西洋参皂苷类成分的含量标准，有利于指导临床合理用药，目前尚没有西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1四种成分同时测定的含量测定方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1四种成分同时测定的含量测定方 法。
本发明含量测定方法采用超高效液相色谱法，该方法如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-6分钟，流动相A由18％渐变至21％；6-10分钟，流动相A由21％渐变至30％；10-18分钟，流动相A为30％渐变至35％；18-20分钟，流动相A为35％渐变至55％；蒸发光散射检测器，气压40psi，增益100，漂移管温度60℃，流速0.4ml/min；柱温为40℃；
对照品溶液的制备
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1适量，精密称定，加80％甲醇分别制成每1ml含人参皂苷Rg1为20μg、人参皂苷Re为800μg、拟人参皂苷F11为40μg、人参皂苷Rb1为900μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取西洋参，粉碎，过4号筛，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30-60min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
本发明含量测定方法中，供试品溶液制备中水浴回流提取时间优选为45min；测定法中分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液的量优选为2μl，注入液相色谱仪。
本发明含量测定方法最优的技术方案为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-6分钟，流动相A由18％渐变至21％；6-10分钟，流动相A由21％渐变至30％；10-18分钟，流动相A为30％渐变至35％；18-20分钟，流动相A为35％渐变至55％；蒸发光散射检测器，气压40psi，增益100，漂移管温度60℃，流速0.4ml/min；柱温为40℃；
对照品溶液的制备
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1适量，精密称定，加80％甲醇分别制成每1ml含人参皂苷Rg1为20μg、人参皂苷Re为800μg、拟人参皂苷F11为40μg、人参皂苷Rb1为900μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取西洋参，粉碎，过4号筛，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30-60min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证实验，以确保该含量测定方法可以用于西洋参的质量控制。
1仪器与试药
1.1仪器
超高效液相色谱仪：Acquity，美国沃特世(WATERS)；色谱柱：Acquity BEH C18(1.7μm，2.1mm×100mm)；电子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超纯水仪：Integral 10(MILLIPORE)。
1.2试药与试剂
对照品：人参皂苷Rg1(中检院提供，批号110703-201529，含量以95.0％计)、人参皂苷Re(中检院提供，批号110754-201525，含量以92.3％计)、人参皂苷Rb1(中检院提供，批号110704-201424，含量以93.7％计)及拟人参皂苷F11(中检院提供，批号110841-201406)。
试剂：乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
2方法确定
2.1色谱条件
2.1.1测定方式的选择
人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的测定波长通常采用紫外203nm，但是因拟人参皂苷F11无紫外吸收，故采用蒸发光散射检测器进行测定。皂苷类成分极性大，用高效液相色谱仪耗时长，故采用UPLC在20分钟内完成测定。
2.1.2流动相的选择
流动相选用乙腈-0.01％甲酸系统进行梯度洗脱，主要目标是将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re分离良好，拟人参皂苷F11及人参皂苷Rb1与杂质分离良好。经系统考察最终选定正文色谱条件，得到色谱图基线平稳，成分峰形对称、分离良好，见图1，依次为人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃。
2.2供试品溶液的制备
2.2.1提取方式的考察
取同一批样品适量，分别超声处理(功率400W，频率40kHz)45分钟、加热回流45分钟，按正文方法测定。结果表明加热回流比超声处理提取率略高。(结果见表1)。
表1 不同提取方式的含量测定结果
2.2.2提取时间的考察
取同一批样品适量，分别加热回流30、45、60min，按正文方法测定。结果表明加热回流30、45、60min含量基本无差别，为确保提取完全的同时节约资源，故选择提取时间为45分钟(结果见表2)。
表2 不同提取时间的含量测定结果
2.2.3提取溶剂的考察
取同一批样品适量，分别用50％甲醇、80％甲醇、甲醇为提取溶剂，按正文方法试验。结果表明不同浓度的甲醇对样品含量测定有影响，为确保提取率选用80％甲醇作为提取溶剂(见表3)。
表3 不同提取溶剂的含量测定结果
3方法学考察
3.1线性关系考察
精密量取适当浓度的混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，以对照品进样量(μg)的对数为横坐标，峰面积积分值的对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，人参皂苷Rg1在22.93μg～229.32μg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝1.508x+26.28(r＝1)；人参皂苷Re在110.80μg～886.38μg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝1.566x+26.62(r＝1)；拟人参皂苷F11在24.14μg～241.44μg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝1.573x+27.00(r＝0.999)；人参皂苷Rb1在0.144mg～1.152mg之间呈良好的线性关系，回归方程为y＝1.575x+26.90(r＝0.999)。实验结果见表4。
表4 线性关系考察结果
3.3重复性试验
取同一批样品，研细，取0.5g、1.0g、1.5g各三份，精密称定，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按正文方法测定。结果表明，本方法重复性良好(结果见表5-6)。
表5 重复性试验结果1
表6 重复性试验结果2
3.4回收率试验
取已知含量的样品(含量见重复性结果)粉末9份，每份约0.25g，精密称定，每三份为一组，分别加入用80％甲醇配制的低、中、高三个浓度的混合对照品溶液25ml，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液。按正文方法测定，计算回收率。结果见表7-10。表明本方法回收率较好。
表7 人参皂苷Rg1回收率试验结果
表8 人参皂苷Re回收率试验结果
表9 人参皂苷Rb1回收率试验结果
表10 拟人参皂苷F11回收率试验结果
3.5稳定性试验
取同一份供试品溶液，于0小时开始测定，以后间隔一段时间测定一次，记录峰面积。结果表明，供试品溶液至少在24小时内稳定(结果见表11)。
表11 供试品溶液稳定性试验结果
3.6样品测定
取收集到的西洋参药材共10批，依法测定，计算含量，结果见表12。
表12 西洋参样品含量测定结果
附图说明
图1西洋参中四种人参皂苷类成分含量测定色谱图(峰1人参皂苷Rg1、峰2人参皂苷Re、峰3拟人参皂苷F11、峰4人参皂苷Rb1)；
具体实施方式
实施例1
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-6分钟，流动相A由18％渐变至21％；6-10分钟，流动相A由21％渐变至30％；10-18分钟，流动相A为30％渐变至35％；18-20分钟，流动相A为35％渐变至55％；蒸发光散射检测器，气压40psi，增益100，漂移管温度60℃，流速0.4ml/min；柱温为40℃；
对照品溶液的制备
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1适量，精密称定，加80％甲醇分别制成每1ml含人参皂苷Rg1为20μg、人参皂苷Re为800μg、拟人参皂苷F11为40μg、人参皂苷Rb1为900μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取西洋参，粉碎，过4号筛，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流45min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
实施例2
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-6分钟，流动相A由18％渐变至21％；6-10分钟，流动相A由21％渐变至30％；10-18分钟，流动相A为30％渐变至35％；18-20分钟，流动相A为35％渐变至55％；蒸发光散射检测器，气压40psi，增益100，漂移管温度60℃，流速0.4ml/min；柱温为40℃；
对照品溶液的制备
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1适量，精密称定，加80％甲醇分别制成每1ml含人参 皂苷Rg1为20μg、人参皂苷Re为800μg、拟人参皂苷F11为40μg、人参皂苷Rb1为900μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取西洋参，粉碎，过4号筛，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。。
实施例3
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-6分钟，流动相A由18％渐变至21％；6-10分钟，流动相A由21％渐变至30％；10-18分钟，流动相A为30％渐变至35％；18-20分钟，流动相A为35％渐变至55％；蒸发光散射检测器，气压40psi，增益100，漂移管温度60℃，流速0.4ml/min；柱温为40℃；
对照品溶液的制备
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、拟人参皂苷F11和人参皂苷Rb1适量，精密称定，加80％甲醇分别制成每1ml含人参皂苷Rg1为20μg、人参皂苷Re为800μg、拟人参皂苷F11为40μg、人参皂苷Rb1为900μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取西洋参，粉碎，过4号筛，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流60min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。。
上述实施例均按照药典进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。