一种溶酶体pH变化检测试剂及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种溶酶体pH变化检测试剂及其应用。

背景技术：

细胞器特异的pH对细胞的自体平衡十分重要，并处于精巧的控制之下，但容易受到病理性诱导剂的影响。溶酶体是细胞内主要的酸性囊腔，其酸性对从细胞自噬、细胞死亡到免疫等不同的生物学事件均十分关键。异常的溶酶体pH能在各种疾病中观察到，举例来说，溶酶体在免疫细胞成熟和炎症反应中能被酸化，而其pH在衰老和溶酶体贮积症中会缓慢的提高。像这样，定义病理性诱导剂的介导的溶酶体pH变化对于了解溶酶体在疾病中的角色是有一定作用的。

比率荧光成像能够通过消除伴随单强度荧光探针的不确定性来提高准确度，这些不确定性包括不均一的探针分布。因此，双发射纳米颗粒已经被广泛的应用于细胞内pH成像。由于每个溶酶体的pH具有不同的pH和亚细胞位置，纳米探针在溶酶体成像中的应用中的主要问题在于这些探针常分布在溶酶体之外，或者由于纳米颗粒被分泌型溶酶体吞入而仅集中在一小部分溶酶体中。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种溶酶体pH变化检测试剂及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种溶酶体pH变化检测试剂，其有效成分包括CM-ROX，该CM-ROX的结构式为：

在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为CM-ROX。

CM-ROX在检测溶酶体pH变化中的应用，该CM-ROX的结构式为：

本发明的有益效果：本发明的CM-ROX具有通过二亚乙基三胺连接在一起的一总是发出蓝色荧光的香豆素部分和一在酸性环境中发射红色荧光的罗丹明-X-内酰胺部分，能够在特异性的聚集在溶酶体中，同时能够根据比率荧光精确检测溶酶体中的pH变化。

附图说明

图1为本发明实施例1中的CM-ROX的由pH介导的比率荧光原理及结果图。

图2为本发明实施例2中的CM-ROX处理表达Lamp2-GFP的海拉细胞的结果图。

图3为本发明实施例3中的CM-ROX处理不同细胞株后，不同细胞株的溶酶体pH的共聚焦荧光显微图像。

图4为本发明实施例3中的CM-ROX处理不同细胞株后，不同细胞株的溶酶体pH的流式细胞仪监测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：

CM-ROX的制备方法参见《Responsive hetero-organelle partition conferred fluorogenic sensing of mitochondrial depolarization》Zhongwei Xue，Hu Zhao，Jian Liu，Jiahuai Hanb and Shoufa Hah，Chem.Sci，2016。

如图1A所示，本发明中的CM-ROX具有通过二亚乙基三胺连接在一起的一总是发出蓝色荧光的香豆素部分和一在酸性环境中发射红色荧光的罗丹明-X-内酰胺部分，能够经质子化介导而导向聚集在溶酶体，同时保证在受压细胞中报告溶酶体pH的变化。如图1B和C所示，CM-ROX的滴定曲线显示罗丹明荧光在酸性介质中峰值为615nm，并且随着pH值的降低而加强，而在pH7.0～9.0的条件下的荧光强度是忽略不计的，这与图1A中的质子化介导的罗丹明的荧光发射相一致。在酸性的pH条件下，罗丹明的荧光信号显著的增强，同时随着pH的降低，如图1B所示，CM-ROX的香豆素部分的荧光强度较为缓慢的下降。如图1D所示，CM-ROX的罗丹明-X-内酰胺部分和香豆素部分的比率荧光可以对pH4.5～6.0范围内的细小变化进行成像。

实施例2

在本实施例中，用3uM的CM-ROX来处理表达Lamp2-GFP(GFP标记的溶酶体相关膜蛋白)的Hela细胞30min，然后用共聚焦荧光显微镜来捕捉伴随GFP信号(图2A)的罗丹明荧光信号(图2B)，结果显示，GFP信号与罗丹明信号和香豆素信号均在同一区域内，也就是说CM-ROX特异性的进入Hela细胞中的各溶酶体中。

为了确认探针的活化对溶酶体中酸度的依赖性，用CM-ROX和巴佛洛霉素A1(BFA，一种ATP-H1泵抑制剂，能够中和溶酶体的pH值)对Hela细胞进行共同染色，结果显示，罗丹明荧光在没有BFA的对照组细胞中出现，而在BFA处理的细胞中消失，由此证明了细胞内的CM-ROX的活化是有溶酶体的酸度介导的。

实施例3

在本实施例中，将L929、Hela、CHO和MCF-7细胞株分别置于含有2uM的CM-ROX的DMEM中培养30min，然后通过共聚焦荧光显微镜来捕捉荧光信号，结果如图3所示，CM-ROX的双发射荧光能够在上述所有细胞中观察到，CM-ROX的比率荧光强度(I_RoX/I_CM)可用于定量指示不同细胞株中的溶酶体pH，具体如下：

在上述每种细胞株中选取5个细胞，每个细胞选取10个溶酶体进行观察，结果如图3A所示，同一细胞中的不同的溶酶体的pH值是不同的，但溶酶体平均pH值与细胞株的种类相关。举例来说，如图3B所示，Hela细胞中的溶酶体pH值显著高于L929、CHO和MCF-7，此外，在上述每种细胞株中选取5个细胞，每个细胞选取10个溶酶体通过流式细胞仪监测，如图4所示，这些细胞株的全局的溶酶体pH值与通过共聚焦荧光显微镜观察到的结果是相互关联的。这些结果显示，CM-ROX可应用于区分不同溶酶体的pH值以及不同细胞群的溶酶体pH状况。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。