本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒以及农药残留检测方法，更具体地说，是一种利用酶联免疫分析技术检测水果盒蔬菜中嘧霉胺的残留，属于酶联免疫检测（elisa）技术领域。
技术背景
嘧霉胺（pyrimethanil）是近年来开发的一种苯胺基嘧啶类广谱低毒杀菌剂，对果蔬中的枯萎病以及草莓、黄瓜等作物的灰霉病等具有极好的防治效果，此外，在果蔬运输过程中可作为抑霉剂，从而起到保鲜防腐的作用。嘧霉胺具有独特的作用机理，可抑制病原菌中侵染酶的产生以阻止病原菌入侵，其具有叶片穿透及根部内吸活性，能迅速传递至作物体内各部位。随着农作物病虫害发生率的日益增长，农药的使用量也随之增加，农药残留问题由此获得国内外科研工作者的广泛关注。我国强制性国家标准规定水果和蔬菜中嘧霉胺的最高残留量为7mg/kg（柑橘类水果等）和3mg/kg（葱、菜豆等），另外日本等国家也对我国出口的果蔬中嘧霉胺的残留量制定了严格的标准。
目前报道的有关嘧霉胺残留的分析方法有气相色谱法（npd检测器）、高效液相色谱法、气（液）相色谱-质谱连用等，但这些方法都存在回收率低、检测样品前处理程序繁琐、检测周期长等缺点。因此，迫切需要一种快速简便的新方法来检测嘧霉胺。酶联免疫法（elisa）是一种敏感、快速且效率极高的检测分析方法与传统的检测方法相比，其具有样品处理简单、检测速度快、方法简便等优点。有关于果蔬中农药残留检测分析的elisa试剂盒方法的报道很多，但目前仍未见到利用酶联免疫方法检测嘧霉胺残留的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种检测水果和蔬菜中嘧霉胺残留的酶联免疫检测试剂盒以及检测方法，其中，嘧霉胺多克隆抗体为该试剂盒中最为主要的成分，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性等优点，可高效、快速检测果蔬中的嘧霉胺残留，能批量制作应用于农业生产实践中。
本发明提供的一种嘧霉胺多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将乙腈、2-氯-4,6-二甲基嘧啶、吡啶加至三口烧瓶中，将烧杯置于磁力搅拌器上，并于反应器内放置温度计，在50~60℃下滴加对氨基苯乙酸，反应后，tlc跟踪直至原料消失，然后降温至30℃，将反应产物过层析柱子，收集半抗原产物；将半抗原与载体蛋白进行偶联，得到嘧霉胺人工抗原；利用嘧霉胺人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的多克隆抗体即为嘧霉胺多克隆抗体。
其中，包被有嘧霉胺包被抗原的酶标板制备过程中所使用的包被抗原是嘧霉胺抗原与卵清蛋白的偶联复合物，包被缓冲液为0.05mol/lph9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，封闭液为1%的bsa/pbs缓冲液。
其中，洗涤液为ph4.7的pbst溶液，其配制步骤如下：取na2hpo4·12h2o68.8g，nah2po46.9g，nacl45g，加双蒸水至1000ml，ph调至7.4。
其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶为辣根过氧化物酶。
其中，底物显色液为tmb-过氧化氢脲溶液，配制步骤如下：底物液a：取无水乙酸钠8.2g，β-糊精2.5g，过氧化氢脲428.6mg，加双蒸水至1000ml，调节ph至5.0，4℃保存；底物液b：取100mgtmb溶于10mldmso中，棕色瓶保存；使用前取14.6ml底物液a和0.45ml底物液b混合15min。终止液为1.25mol/l的h2so4。
本发明提供的利用试剂盒检测嘧霉胺农药残留的方法，步骤如下：
1、称取果蔬中可食用部分10g放入研钵中，加入10ml提取液，充分研磨过滤，收集的滤液即为待测样品。
2、取待测样品和包被缓冲液加入孔内，并设置阳性对照（嘧霉胺标准品包被），37℃包被30min。洗涤，沥干，其中，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3、每孔加入0.4ml封闭液封闭30min，清洗后沥干。
4、每孔加入0.1ml嘧霉胺抗体，37℃孵育40min后洗涤3次。
5、每孔加入0.1ml酶标二抗羊抗兔（hrp）抗体，37℃孵育40min后洗涤3次。
6、每孔加入0.1ml底物显色液（现用现配）37℃孵育20min。
7、每孔加入0.05ml终止液。
8、利用酶标仪于450nm、655nm波长测定各孔od值。将嘧霉胺待测样品od值与标准品进行对比。
本发明试剂盒的分析原理是：
包被于微孔板上的嘧霉胺人工抗原与牛血清蛋白偶联形成偶联复合物，嘧霉胺待测样品与嘧霉胺人工抗原相结合，而后与酶标二抗（hrp）结合，形成“嘧霉胺人工抗原-嘧霉胺待测样品-酶标二抗”复合物，加入底物液，观察显色反应结果，当待测样品中嘧霉胺浓度较高时，其显色较深，酶标仪检测结果od值较高；反之，待测样品中嘧霉胺浓度较低时，其显色反应较浅，od值相对较低。
本发明的积极效果：能快速灵敏地检测果蔬中残留的嘧霉胺，样品前处理过程简单，处理时间少，并且方便同时检测大量样品，其成本低于传统高效液相色谱、气相色谱等方法。
具体实施方式
以下将结合具体的实施例对本发明做进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例1
嘧霉胺半抗原制备
分别取30ml的乙腈，1.5g的2-氯-4,6-二甲基嘧啶，3g的吡啶加入到三口烧瓶中，将烧杯置于磁力搅拌器上，并于反应器内放置温度计，在50~60℃下滴加1.9g对氨基苯乙酸，滴加完毕后回流反应5h，tlc跟踪直至原料消失，然后降温至30℃，将反应产物过层析柱子，收集后的产物经旋蒸后得纯净物质1.5g。
实施例2
嘧霉胺人工抗原制备
称取1.5g嘧霉胺半抗原，溶于2mldmf中，均匀搅拌，加入30μl三正丁胺，冰浴，加30μl溶解于dmf的氯甲酸异丁酯，搅拌1h。称取3.2gbsa，溶于5mlph9.60.1mol/l柠檬酸盐缓冲液中。将半抗原、dmf混合溶液逐滴加入bsa溶液中，4℃下搅拌5h，5000r/min离心20min后，弃掉沉淀，上清液透析三天，透析期间每隔8h更换一次透析液，最终得到嘧霉胺人工抗原。
实施例3
嘧霉胺多克隆抗体制备
取3mg嘧霉胺人工抗原溶于1ml生理盐水中，将稀释过后的嘧霉胺人工抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，随后利用皮下多点注射方法将乳化后的嘧霉胺人工抗原注射于新西兰大白兔体内，每只大白兔一次用量为0.5mg/kg。15天后，将同样用生理盐水稀释过的嘧霉胺人工抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，加强免疫，剂量为0.01mg/kg，15天后进行第三次使用稀释过嘧霉胺人工抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行加强免疫，从此次加强免疫开始，免疫7天后取血，并测定其抗血清效价，直到其效价达到一定数值，将制备好的多克隆抗体保存于-20℃备用。
实施例4
嘧霉胺酶联免疫吸附分析检测试剂盒，其包括以下组分：
（1）包被有嘧霉胺包被抗原的酶标板；
（2）嘧霉胺标准品；
（3）嘧霉胺多克隆抗体；
（4）辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；
（5）洗涤液：na2hpo4·12h2o68.8g，nah2po46.9g，nacl45g；
（6）底物液：底物液a：无水乙酸钠8.2g，β-糊精2.5g，过氧化氢脲428.6mg；底物液b：100mgtmb，10mldmso；
（7）反应终止液：1.25mol/l的h2so4；
（8）说明书一份。
实施例5
利用试剂盒检测嘧霉胺残留
（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10g放入研钵中，加入10ml提取液，充分研磨过滤，收集的滤液即为待测样品。
（2）取待测样品和包被缓冲液加入孔内，并设置阳性对照（嘧霉胺标准品包被），37℃包被30min。洗涤，沥干，其中，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
每孔加入0.4ml封闭液封闭30min，清洗后沥干。
（3）在包被有抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的嘧霉胺抗体及待测样品，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤3次。
（4）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1ml，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤3次。
（5）加入新鲜配制的底酶标板物显色液0.1ml，37℃孵育20min.
（6）加入终止液0.05ml终止反应。
（7）将酶标板置于酶标仪中，于490nm波长处测定检测结果。