一种检测苄青霉素的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，具体涉及基于目标诱导的核酸适配体构象变化检测苄青霉素的方法。

背景技术：

苄青霉素是抗生素的一种，是由青霉菌提炼出来的，由于分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素对人体毒性较小，但是会引起严重的过敏反应，发生过敏的几率在5%-10%，症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体强直，最后惊厥，抢救不及时可造成死亡。而且过敏反应的发生与药物剂量大小无关，对青霉素过敏的患者，即使是微量也能引起休克。目前报道的检测苄青霉素的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光共振方法。这些方法有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测苄青霉素是至关重要的。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中检测苄青霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测苄青霉素的方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了4条dna链，其序列分别是：

hap1：5′-gcgggcggttgtatagcggttttttttttgcccgcatttagttt-3’（seqidno.1）

s1：5’-aaaagctgaggactatagc-3’(seqidno.2)

hap2：5’-tagtcctcagcttttgggttttgggttttgggttttgggacta-3’(seqidno.3)

s2：5’-gctatagtcctcaatctaataaactaaatgcg-3’(seqidno.4)

其中hap1的下划线部分是目标物苄青霉素的aptamer，hap2中下划线标注的内切酶nt.bbvci的识别切割序列。hap2中下划黑体部分是富含g的序列，通过富含g的序列形成g四联体，催化氧化双氧水和abts产生颜色变化来定量检测苄青霉素。

本发明中用到了两种酶：phi29dna聚合酶和nt.bbvci内切酶。phi29dna聚合酶在引物与模板的作用下，沿着模板链从5’端向3’端生长，聚合出与模板链碱基完全互补的系列。nt.bbvci可以在特异性位点实现对dna双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：cctcagc，切割位点是前面第二和第三个碱基之间。

本发明中苄青霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过两步循环的方式来实现信号的放大，从而实现苄青霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：hap1由两部分组成：aptamer，和与s2的3^，端互补序列。当有苄青霉素存在时，由于aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，可以将hap1打开，使hap1上和s2中3^，端的互补序列以单链的形式暴露在外面。随后均相中的s2的3^，端可以通过碱基互补配对与打开的hap1杂交成一定的双链。

s1和s2的5^，端碱基互补配对，杂交成一定的双链。在phi29dna聚合酶的作用下，s2的3^，端以打开的hap1为模板生长成完全互补的杂交双链，并释放出目标物苄青霉素，游离出来的苄青霉素可以继续打开别的hap1，然后重复上述过程。此为第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）。

同样在phi29dna聚合酶的作用下,打开的hap1以s2为模板生长成完全互补的杂交双链，并释放出s1，游离的s1可以打开更多的hap2，然后重复上述过程。此为第二步循环放大。这两步放大是同时进行的，phi29dna聚合酶同时产生作用。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是4h。

具体的检测步骤如下：

（1）对dna链进行预处理；

（2）在均相溶液中进行混合；

（3）将显色剂abts与混合溶液融和进行检测。

所述的制备方法，具体操作步骤如下：

（1）将装有dna链的离心管，放入离心机中12000r/min，离心10min，离心完毕后，按照离心管上的比例，加入适量的灭菌水，再放在振荡器中震荡30s，使链融和均匀；

（2）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、hap1和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（3）将步骤（2）中孵育的离心管拿出，再将s1和s2、phi29dna聚合酶，dntps加入这个离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（4）将步骤（3）中孵育的离心管拿出加入hap2和nt.bbvci内切酶于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（5）将步骤（4）中孵育的离心管拿出，加入氯化铁血红素于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h，孵育后加入h2o2和abts进行检测；

该发明的检测方式是比色检测，利用相应样品和空白样品的颜色变化来进行检测的。利用紫外分光光度计，可以对检测样品实现定量的检测。通过吸光度值的不同来实现定量检测，吸收峰的位置在415左右。本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29dna聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及g四联体的氧化还原特性构建了比色生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补苄青霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用苄青霉素的aptamer作为识别物质实现了对目标物苄青霉素的高特异性检测；

2、利用具有链置换功能的phi29dna聚合酶，实现了目标物和引物链的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；

3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，信号产生；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

5、检测原理的全部过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

6、制备方法简单，性能稳定，适用于食品安全中苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；

7、制作传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1辅助探针s1浓度优化检测结果图；

图3为实施例2目标特异性检测结果图；

图4为传感器检测的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对dna链进行预处理；

（2）在均相溶液中进行混合；

（3）将显色剂abts与混合溶液融和进行检测。

所述的制备方法，具体操作步骤如下：

（1）将装有dna链的离心管，放入离心机中12000r/min，离心10min，离心完毕后，按照离心管上的比例，加入适量的灭菌水，再放在振荡器中震荡30s，使链融和均匀。

（2）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、hap1和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（3）将步骤二中孵育的离心管拿出，再将s1和s2、phi29dna聚合酶，dntps加入这个离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（4）将步骤三中孵育的离心管拿出加入hap2和nt.bbvci内切酶于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

（5）将步骤四中孵育的离心管拿出，加入氯化铁血红素于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h，孵育后加入h2o2和abts进行检测；

该发明的检测方式是比色检测，利用相应样品和空白样品的颜色变化来进行检测的。利用紫外分光光度计，可以对检测样品实现定量的检测。通过吸光度值的不同来实现定量检测，吸收峰的位置在415左右。本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29dna聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及g四联体的氧化还原特性构建了比色生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补苄青霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。原理图如图1所示。

实施例1

具体操作过程的主要步骤如下：

a、将装有dna链的离心管，放入离心机中12000r/min，离心10min，离心完毕后，按照离心管上的比例，加入适量的灭菌水，再放在振荡器中震荡30s，使链融和均匀。

b、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、hap1（10μm）,待测目标物（10μm），加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h。

c、将b中孵育的离心管拿出，再将不同浓度的s1（2μm,5μm，10μm，15μm）和s2（5μm）、phi29dna聚合酶（2μl），dntps（2μl）加入这个离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

d、将（c）中孵育的离心管拿出，加入hap2（5μm）和nt.bbvci（2μl）内切酶于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

e、将d中孵育的离心管拿出，加入氯化铁血红素（1mm）于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h，孵育后加入h2o2(27μm)和abts(0.1μm)进行检测；

f、用紫外分光光度计来进行检测，检测峰值在420左右，根据吸光度的变化来定量检测目标物的含量。

10x的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

配置的超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的空白与响应信号随着s1的浓度在2-10μm区间内增大而增大，当浓度超过10μm后，空白信号也增强，造成空白和响应的信号吸收峰值的差距值变小。所以s1的最佳浓度为10μm。

实施例2

实验过程的主要步骤如下：

a、将装有dna链的离心管，放入离心机中12000r/min，离心10min，离心完毕后，按照离心管上的比例，加入适量的灭菌水，再放在振荡器中震荡30s，使链融和均匀。

b、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、hap1（10μm）,待测目标物苄青霉素（10μm），链霉素（10μm），土霉素（10μm），卡那霉素（10μm）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h。

c、将b中孵育的离心管拿出，再将不同浓度的s1（10μm）和s2（5μm）、phi29dna聚合酶（2μl），dntps（2μl）加入这个离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

d、将（c）中孵育的离心管拿出，加入hap2（5μm）和nt.bbvci（2μl）内切酶于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

e、将d中孵育的离心管拿出，加入氯化铁血红素（1mm）于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h，孵育后加入h2o2(27μm)和abts(0.1μm)进行检测；

f、用紫外分光光度计来进行检测，检测峰值在420左右，根据吸光度的变化来定量检测目标物的含量。

结果见图3，通过图像我们可以得知，只有加入苄青霉素的样品有明显的吸收峰，加入其它抗生素的样品的吸光度值与空白样品差距不大，所以此传感器具有特异性。

实施例3

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、将装有dna链的离心管，放入离心机中12000r/min，离心10min，离心完毕后，按照离心管上的比例，加入适量的灭菌水，再放在振荡器中震荡30s，使链融和均匀。

b、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、hap1（10μm）,不同浓度的待测目标物苄青霉素（100pm，1nm，10nm，100nm，1μm，10μm）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h。

c、将b中孵育的离心管拿出，再将不同浓度的s1（10μm）和s2（5μm）、phi29dna聚合酶（2μl），dntps（2μl）加入这个离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

d、将（c）中孵育的离心管拿出，加入hap2（5μm）和nt.bbvci（2μl）内切酶于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；

e、将d中孵育的离心管拿出，加入氯化铁血红素（1mm）于离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h，孵育后加入h2o2(27μm)和abts(0.1μm)进行检测；

利用紫外分光光度计来检测，设置波长范围从300到500，出峰位置在415到420之间，通过检测出的吸光度值来进行定量检测。检测结果如图4所示，a到f分别为100pm，1nm，10nm，100nm，1μm，10μm。图中我们可以看到，在氨苄青霉素的浓度在100pm到10μm时，苄青霉素浓度的对数与电流大小成正比关系，同时，我们在100pm的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于100pm时，吸光度值与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的吸光度的最低点因此可得到该方法的检测下限为100pm。

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<110>济南大学

<120>一种检测苄青霉素的方法

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<212>dna

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<222>(1)..(44)

<223>引物

<400>1

gcgggcggttgtatagcggttttttttttg30

cccgcatttagttt44

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>2

aaaagctgaggactatagc19

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<212>dna

<213>人工序列

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<221>misc_feature

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tagtcctcagcttttgggttttgggttttg30

ggttttgggacta43

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<212>dna

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>引物

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gctatagtcctcaatctaataaactaaatg30

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