安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用，具体为一株安 全、超高产绿色农药申嗪霉素的基因工程菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是农业大国，粮食作物的高产稳产是国民安居乐业、国家经济发展的重中之 重。由植物病原菌引起的农经作物病害可导致农经作物减产，造成巨大的经济损失。目前， 用于防治植物病害的主要方法包括培育抗病品种、栽培防治、化学防治和生物防治等。农药 的合理应用能够极大程度上保障我国农业的可持续性性发展。近些年来，生物技术的飞速 发展大力推进了生物农药的研发工作。与传统化学农药相比，生物农药具有高效、安全、经 济及对环境友好等特点，现已成为我国现代农药开发的一个重要方向。
[0003] 水稻根际假单胞菌PA1201，能有效抑制水稻纹枯病菌和水稻白叶枯病菌的生长， 其主要抑菌成分为两种农用抗生素申嗪霉素，即吩嗪-1-羧酸，和吩嗪-1-酰胺。其中，申 嗪霉素能有效防治水稻纹枯病、西瓜蔓枯病和甜椒疫病等多种真菌性病害，于2011年正式 获得农药登记证（登记号：PB20110314和PB20110315)，并被全国农技推广服务中心列为 "十二五"重点推广产品（证书号：TG2011-002)。在黄豆粉发酵培养液中，PA1201菌株的 申嗪霉素发酵效价可达800毫克/升发酵液，吩嗪-1-酰胺发酵效价为350~450毫克/ 升发酵液。该菌株PA1201已于2013年9月23日在中国专利局指定的保藏单位：中国典 型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072)保藏，保藏号为CCTCC NO. M 2013441，并于2013年10月提交了名为"高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞 菌"的专利申请（专利【申请号】201310511796. 2)。
[0004] 虽然水稻根际菌株PA1201的申嗪霉素发酵效价显著优于现有申嗪霉素生产菌株 的出发菌株M18 (约为200毫克/升发酵液），但并不适宜应用到农业生产领域，主要包括以 下两方面的原因：1)菌株PA1201的申嗪霉素发酵效价通常为0.8克/升发酵液，生产成本 较高，缺乏市场竞争力；2)经鉴定水稻根际拮抗菌PA1201为铜绿假单胞菌，而临床分离的 铜绿假单胞菌多是条件致病菌，在发酵过程中能产生多种毒性因子，具有感染人体的潜在 危险，因此，有必要对PA1201基因组中与致病相关的基因进行敲除，降低PA1201安全隐患。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术缺陷，提供一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其 应用；首先，本发明针对现有菌株PA1201的安全隐患，系统敲除PA1201基因组中的主要致 病性相关基因/基因族，从而大幅提尚该菌株的安全性；其次，本发明针对现有菌株PA1201 发酵效价低，申嗪霉素生产成本高，不利于工业化生产和大规模推广使用的问题，本着"开 源节流"的原则，利用基因工程和蛋白质工程手段，对原始菌株PA1201进行大幅基因改造和 代谢改造，从而提高申嗪霉素产量，包括：1)阻止申嗪霉素向吩嗪-1-酰胺和绿脓菌素的转 化；2)对申嘆霉素合成前体分支酸的代谢相关基因 trpE、pabB和pch基因簇进行敲除，并 降低分支酸代谢蛋白UbiC和PheA的生物活性，提高分支酸的水平；3)通过增强DAHP合酶 PhzC和AroG的表达水平，增加菌体内碳源向申嗪霉素生物合成途径的代谢流通量；4)增强 两个申嗪霉素生物合成基因簇phzAl-Gl和phzA2-G2的表达水平，进一步提高申嗪霉素的 产量；5)增强申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD的表达水平，加速申嗪霉素向体外排放的速度， 提尚申嘆霉素广量。
[0006] 本发明所涉的生产申嗪霉素的基因工程菌株已提交中国典型培养物保藏中心进 行保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心， 430072;保藏日期为20150118;保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015040;分类名称为铜绿假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa) PA-III。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 第一方面，本发明提供一株生产申嗪霉素的基因工程菌株，所述基因工程菌株为 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 2015040。
[0009] 本发明所得基因工程菌株是一株安全性优越并超高产申嗪霉素的工程菌株，其申 嗪霉素的发酵效价可达7. 0~7. 4克/升发酵液，是原始菌株PA1201申嗪霉素产量的7~ 9倍，且优于现有申嗪霉素高产菌株（专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz 生产吩嗪-1-羧酸的方法（专利CN200910198664. 2))，可用于绿色微生物农药申嗪霉素的 制备，大规模地防治植物病害。
[0010] 第二方面，本发明提供一种所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，所述 构建方法包括如下步骤：
[0011] 步骤一、敲除野生菌株PA1201中致病性相关基因/基因簇，得工程菌株ΡΑ1201Δ 6 ；
[0012] 步骤二、敲除所述工程菌株ΡΑ1201Λ 6中申嗪霉素代谢基因，得工程菌株 PA1201MSHA 6；
[0013] 步骤三、敲除所述工程菌株PA1201MSHA 6中分支酸代谢相关基因，得工程菌株 PA1201MSHA 9；
[0014] 步骤四、通过点突变法，将所述工程菌株PA1201MSHA 9中芳香族氨基酸生物合 成相关蛋白进行突变，得到工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L);
[0015] 步骤五、将所述工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L)的辅酶Q生物合成途径中分 支酸丙酮酸裂解酶编码基因 UbiC替换为生物活性较低的基因，得到工程菌株PA1201MSH Λ 9pheA(W323L)Rv2949c ；
[0016] 步骤六、利用基因组整合载体将在强启动子控制下的phzC基因整合入所述工程 菌株PAl20IMSH Δ 9pheA (W323L) Rv2949c的基因组，并将基因组上aroG基因的启动子置换 为强启动子，得工程菌株PA-I ;
[0017] 步骤七、敲除所述工程菌株PA-I中申嗪霉素合成基因簇phzAl-phzGl上转录抑制 区域（5' -UTR)，得到工程菌株PA-I Δ UTR ;将所述工程菌株PA-I Δ UTR中申嗪霉素合成 基因簇phzA2-G2的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA- II ;
[0018] 步骤八、置换所述工程菌株PA- II中mexGHI-opmD基因簇的启动子为强启动子， 即得所述生产申嘆霉素的基因工程菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M2015040,即基因工程菌株PA- III。
[0019] 优选地，所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法中，敲除的方法包括如 下：
[0020] (1)根据需要敲除基因/基因簇的DNA序列，每个基因/基因簇设计引物两对，以 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶 KOD-plus-neo扩增该基因两段侧翼序列（flanking sequences);其中，扩增上游侧翼序列 需使用引物（敲除基因名）-F0R_l和引物（敲除基因名）-REV-l，扩增下游侧翼序列需使用 引物（敲除基因名）-F0R_2和引物（敲除基因名）-REV-2。
[0021] (2)以所述两段侧翼序列为模板，以扩增上游侧翼序列使用的正向引物（敲除基 因名）-FOR-I和扩增下游侧翼序列使用的反向引物（敲除基因名）-REV-2,通过重叠延伸 PCR(〇verlap PCR)克隆得到基因敲除融合片段；
[0022] (3)自杀质粒pEXISGm和所述基因敲除融合片段经限制性内切酶双酶切后，将基 因敲除融合片段插入到自杀质粒pEXISGm，构建重组自杀质粒，用于基因敲除；
[0023] (4)通过双亲杂交法，将所述重组自杀质粒转化至PA1201或其衍生菌株中，具体 包括：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201或其衍生菌株与含有重组自杀质粒的大 肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28~37°C条件下，培养6~18小时后，用无菌接种环刮取少 量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在 28~37°C条件下，培养24~36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；
[0024] (5)将所述单交换突变株稀释涂布于含有10 %蔗糖的LB培养基上，在28~37°C 条件下，培养36~48小时，从中筛选得到敲除的基因工程菌株。
[0025] 优选地，步骤一中，所述致病性相关基因/基因簇包括：exsA(编码III型分泌系统 全局转录激活因子ExsA)、toxA(编码外毒素 A)、adhesin (编码黏附素）、pilA_D和pilG-K 基因簇（编码菌毛生物合成相关蛋白）或氢氰酸（HCN)生物合成基因簇。
[0026] 优选地，步骤二中，所述申嘆霉素代谢基因包括phzM、phzS或phzH。
[0027] 优选地，步骤三中，所述分支酸代谢相关基因包括trpE、pabB或pch基因簇。
[0028] 优选地，所述基因 exsA的两对引物如序列exsA-FOR-1和exsA-REV-l、exsA_F0R-2 和 exsA_REV_2 所不；基因 toxA 的两对引物如序列 toxA_F0R_l 和 toxA_REV_l、toxA_F0R_2 和 toxA-REV-2 所示；基因 adhesin 的两对引物如序列 adh-FOR-1 和 adh-REV-l、adh-F0R-2 和adh-REV-2所示；基因 pilA-D的两对引物如序列如pilAD-FOR-1和pilAD-REV-1、 pilAD-FOR-2和pilAD-REV-2所示；基因 pilG-K的两对引物如序列如pilGK-FOR-1和 pilGK-REV-l、pilGK-F0R-2 和 pilGK-REV-2 所示；基因 HCN 的两对引物如序列如 hcn-FOR-1 和 hcn-REV-1、hcn-FOR-2 和 hcn-REV-2 所示。
[0029] 优选地，所述基因 phzM的两对引物如序列如phzM-FOR-1和phzM-REV-1、 phzM-FOR-2和phzM-REV-2所示；所述基因 phzS的两对引物如序列phzS-FOR-1和 phzS-REV-1、phzS-FOR-2和phzS-REV-2所示；所述基因 phzH的两对引物如序列 phzH-FOR-Ι 和 phzH-REV-l、phzH-F0R-2 和 phzH-REV-2 所示；所述基因 trpE 的两对引物如 序列 trpE-FOR-Ι 和 trpE-REV-l、trpE-F0R-2 和 trpE-REV-2 所示；所述基因 pabB 的两对引 物如序列 pabB-FOR-Ι 和 pabB-REV-l、pabB-F0R-2 和 pabB-REV-2 所示；所述基因 pch 的两 对引物如序列 pch-FOR-Ι 和 pch-REV-1、pch-FOR-2 和 pch-REV-2 所示。
[0030] 优选地，步骤四中，所述芳香族氨基酸生物合成相关蛋白具体指PheA;所述点突 变具体指将蛋白PheA的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸；通过点突变可以降低该蛋白 的生物活性。
[0031] 优选地，步骤五中，所述生物活性较低的基因为革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分 支酸丙酮酸裂解酶编码基因 rv2949c。
[0032] 优选地，步骤六中，所述基因组整合载体具体指mini-Tnn-Gm-phzC，所述强启动 子具体指P ta。;步骤七、八中，所述强启动子为P 1UTK。
[0033] 本发明所涉及敲除基因、基因族或特定DNA序列包括：毒性相关基因 exsA、toxA、 adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇；申嗪霉素代谢相关基因 phzM、phzS和phzH ;分支酸代谢相关基因 trpE、pabB和pch基因簇的敲除均可通过上述 步骤1到5完成，不同之处在于使用引物为为扩增所述基因或基因簇两段侧翼序列设计 (详见表2);在工程菌株ΡΑ1201Δ 6中，致病性相关基因/基因簇exsA、toxA、adhesin、 pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除；在工程菌株PA1201MSHA 6中，申嗪霉素代谢相关基因 phzM、phzS和phzH和致病性相关基因/基因簇exsA、toxA、 adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除；在工程菌株中 PA1201MSHA 9中，分支酸代谢相关基因 trpE、pabB和pch基因簇，申嗪霉素代谢相关基 因 phzM、phzS和phzH和致病性相关基因/基因族exsA、toxA、adhesin、pilA-D基因族、 pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇均被敲除。进一步的，上述致病性相关基因 exsA、 toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇，申嗪霉素代谢相关 基因 phzM、phzS和phzH，以及分支酸代谢相关基因 trpE、pabB和pch基因簇的基因敲除部 分可以是全基因完整序列，也可以是上述基因的部分序列。
[0034] 优选地，所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法中，基因或启动子置换的 方法包括如下：
[0035] (1)根据需要置换基因/启动子的DNA序列，每个基因/启动子设计引物两对，以 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶 KOD-plus-neo扩增该基因/启动子两段侧翼序列（flanking sequences);其中，扩增上游 侧翼序列需使用引物r (上游片段）-FOR-I和引物r (上游片段）-REV-I，扩增下游侧翼序列 需使用引物r (下游片段）-F0R-3和引物r (下游片段）-REV-3 ;
[0036] (2)根据需扩增基因/启动子的DNA序列，设计1对引物，以包含目标序列菌株基 因组DNA或质粒为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo,扩增目标基因/启动子序列；
[0037] (3)利用引物r (上游片段）-FOR-I和引物r (下游片段）-REV-3,以上述3个PCR 片段为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段；
[0038] (4)自杀质粒pEX18Gm和所述基因置换三融合片段经限制性内切酶双酶切后，将 三融合片段插入到自杀质粒pEXISGm，构建重组自杀质粒，用于基因或启动子置换；
[0039] (5)通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒转化至PA1201衍