实施例5
[0184] 本实施例将ΡΑ1201衍生工程菌株PA-I Δ UTR基因组上的phzA2-G2基因簇的启 动子置换为前述强启动子Piutk的方法，包括下列步骤：
[0185] 1.构建重组自杀质粒pEX-P1UTK-phzA2
[0186] I. 1 设计 2 对引物（rqscR-FOR-l、rqscR-REV-l 和 rphzA2-F0R-3、rphzA2-REV_3)， 以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶 KOD-plus-neo扩增qscR和phzA2基因的部分序列，PCR产物通过0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检 测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为360bp和372bp。引 物的核苷酸序列如表 2 中 SEQ ID No. 67 和 SEQ ID No. 68、SEQ ID No. 69 和 SEQ ID No. 70 所示。
[0187] L 2 设计 1 对引物（rUTR(A2)-F0R-2 和 rUTR-REV-2)，以工程菌株 PA-I Δ UTR 基因组为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo,扩增Piuti^S启动子序列，PCR产物通过 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收，长度为383bp。引物 的核苷酸序列如表2中SEQ ID No. 71和SEQ ID No. 72所示。
[0188] L3以rqscR-FOR-Ι和rphzA2-REV_3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用 高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1079bp，产物通过0.8%琼脂糖 凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收（图16)。
[0189] 1.4上述三片段融合片段经限制性内切酶EcoR I、HindIII酶切回收后，与同样双 酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至 E. coli DH5a感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小 时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒 pEX-P1UTK-phzA2。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-P1UTK-phzA2转化至E. coli S17-1感 受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后，得到含有重组自 杀质粒pEX-P 1UTK-phzA2的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将phzA2-G2基因簇自身启动子置换 为Piutk强启动子。
[0190] 2.构建工程菌株PA- II
[0191] 2. 1通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-P1UTK-phzA2转化至PA1201衍 生工程菌株PA-I Δ UTR基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA-I Δ UTR与含 有重组自杀质粒pEX-P1UTK-phzA2的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28~37°C条件下，培 养6~18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含 有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28~37°C条件下，培养24~36小时，筛选得到抗 庆大霉素的单交换突变株。
[0192] 2. 2将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10%蔗糖 的LB培养基上，在28~37°C条件下，培养36~48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基 上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；
[0193] 2. 3利用引物rUTR(A2)-F0R-2和rphzA2-REV-3,通过基因组PCR，筛选和验证 phzA2-G2启动子置换为Piutk强启动子的工程菌株PA- II。phzA2-G2启动子置换为P _的 菌株PCR扩增片段长度为737bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段（图17)
[0194] 进一步的，所述强启动子？1_来源于工程菌株PA-I Λ UTR。如实施例所列举的， 其碱基序列为SEQ ID NO. 92:
[0195] CCGTAACCCG AGAAGTACCC AAGCGCTCTA TTTCGCACTT CTTGCCCGCT CGGCGAGAAA TACCGCAGAA CACCCCGGTT CATTCGGAAC TTTGAGAAAA AATGCGCTCA TCCCCCGGAT CAGCGCTCCC TGGATCTCGT
[0196] TGCGGAAACA ACCCTGGAAC TTTCCAACTG CCTGTTCCAG AGCCTTTTCC TGCGTACCGA AAGAATAAAA TTACMCTTG GCTACAACCT CCGGCATTGC AGGAAGCATC AGCTTAGCAA TCCCGCATAC CCTGTCTGGC ACCTACCAGA TCTTGTAGTT GAGCCGGTAC GAGCGTTCTG TGTTTTATGC AATCCATACC TGGAGAGCCC TCTCGGAGGC GGCGC0
[0197] 实施例6
[0198] 本实施例涉及将PA1201衍生工程菌株PA- II基因组上的编码申嗪霉素外排系统 基因簇mexGHI-opmD的启动子置换为通过前述步骤敲除了 phzl基因簇启动子中转录抑制 区域（5' -UTR)后的Piuti^S启动子的方法，方法包括下列步骤：
[0199] 1.构建重组自杀质粒pEX-P1UTK-mexG
[0200] I. 1 设计 2 对引物（r0733-F0R-l、r0733-REV-l 和 rmexGH-F0R-3、rmexGH-REV-3)， 以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶 KOD-plus-neo扩增mexGHI-opmD启动子上下游侧翼片段，PCR产物通过0. 8 %琼脂糖凝胶电 泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为566bp和578bp。 引物的核苷酸序列如表中 SEQ ID No. 73 和 SEQ ID No. 74、SEQ ID No. 75 和 SEQ ID No. 76 所示。
[0201] 1. 2 设计 1 对引物（rUTR (mexG) -F0R-2 和 rUTR-REV-2)，以工程菌株 PA-I Δ UTR 基因组为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo,扩增Piuti^S启动子序列，PCR产物通过 3. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收，长度为383bp。引物的 核苷酸序列如表2中SEQ ID No. 77和SEQ ID No. 78所示。
[0202] 1.3以r0733-F0R-l和rmexG-REV-3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用高 保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1491bp，产物通过0. 8 %琼脂糖凝 胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收（图18)。
[0203] 1. 4上述三片段融合片段经限制性内切酶EcoR I、Hind III酶切回收后，与同样双 酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至 E. coli DH5a感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小 时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒 pEX-P1UTK-mexG。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-P1UTK-mexG转化至E. coli S17-1感 受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后，得到含有重组自 杀质粒PEX-P iutk - mexG的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将phzA2-G2基因簇自身启动子置换 为Piutk强启动子。
[0204] 2.构建工程菌株PA-III
[0205] 2. 1通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-P1UTK-mexG转化至PA1201衍 生工程菌株PA- II基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合PA- II与含有重组自杀 质粒pEX-P1UTK-mexG的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在28~37°C条件下，培养6~18小时 后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和 壮观霉素的LB平板上，在28~37°C条件下，培养24~36小时，筛选得到抗庆大霉素的单 交换突变株。
[0206] 2. 2将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10%蔗糖 的LB培养基上，在28~37°C条件下，培养36~48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基 上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落。
[0207] 2. 3利用引物rUTR(mexG) -F0R-2和rmexG-REV-3,通过基因组PCR，筛选和验证 mexGHI-opmD的启动子置换为Piutk强启动子的工程菌株PA- III。mexGHI-opmD启动子置换 为Piutk的菌株PCR扩增片段长度为943bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段（图19)
[0208] 实施例7
[0209] 本实施例将PA1201衍生工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L)基因组上的UbiC 基因置换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的rv2949c基因的方法，包括下列步骤：
[0210] 1.构建重组自杀质粒 pEX-rv2939c(ubiC)
[0211] I. 1 设计 2 对引物（rglcC-F0R-l、rglcC-REV-1 和 rubiA-F0R-3、rubiA-REV-3)， 以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶 1(00-?1118-1^〇扩增111^(：上下游侧翼片段，？〇?产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并且 通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收两个侧翼片段，长度分别为502bp和455bp。引物的核苷 酸序列如表 2 中 SEQ ID No. 79 和 SEQ ID No. 80、SEQ ID No. 81 和 SEQ ID No. 82 所示。
[0212] 1. 2设计1对引物（rrv2949c-F0R-2和rrv2949c-REV-2)，以结核分枝杆菌基因组 为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo,扩增rv2949c基因序列，PCR产物通过0. 8 %琼 脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收，长度为618bp。引物的核苷酸 序列如表2中SEQ ID No. 83和SEQ ID No. 84所示。
[0213] 1.3以rglcC-FOR-1和rubiA-REV-3为引物，以上述3个PCR片段为模板，利用高 保真聚合酶KOD-plus-neo扩增三片段融合片段，长度为1539bp，产物通过0. 8 %琼脂糖凝 胶电泳检测，并且通过AxyPrep凝胶回收试剂盒回收（图20)。
[0214] 1. 4上述三片段融合片段经限制性内切酶Hind III、BamH I酶切回收后，与同样双 酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至 E. coli DH5a感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小 时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒 pEX_rv2939c(ubiC)。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX_rv2939c(ubiC)转化至E. coli S17-1感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后，得到含 有重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将UbiC基因置换为 rv2949c〇
[0215] 2.构建工程菌株 PA1201MSHA 9pheA(W323L)Rv2949c
[0216] 2. 1通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒PEX-rv2939c(ubiC)转化至 PA1201衍生工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L)基因组上：用无菌接种环，在LB平板上 充分混合PA1201MSHA 9pheA(W323L)与含有重组自杀质粒pEX-rv2939c(ubiC)的大肠杆 菌S17-1菌株的菌落，在28~37°C条件下，培养6~18小时后，用无菌接种环刮取少量接合 菌落，稀释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28~ 37°C条件下，培养24~36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。
[0217] 2. 2将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10%蔗糖 的LB培养基上，在28~37°C条件下，培养36~48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基 上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；
[0218] 2. 3利用引物rrv2949c-F0R-2和rrv2949c-REV-2,通过基因组PCR，筛选和验证 ubiC 基因置换为 rv2949c 的工程菌株 PA1201MSHA 9pheA(W323L)Rv2949c。ubiC 基因置换 为rv2949c的菌株PCR扩增片段长度为618bp，启动子未置换的菌株不可得到扩增片段（图 21) 〇
[0219] 进一步的，所述rv2949c基因来源于结核分枝杆菌Mtl03。如实施例所列举的，其 氨基酸序列为SEQ ID NO. 93:
[0220] MTECFLSDQE IRKLNRDLRI LIAANGTLTR VLNIVADDEV IVQIVKQRIH DVSPKLSEFE QLGQVGVGRV LQRYIILKGR NSEHLFVAAE SLIAIDRLPA AIITRLTQTN DPLGEVMAAS HIETFKEEAK VWVGDLPGWL ALHGYQNSRK RAVARRYRVI SGGQPIMVVT EHFLRSVFRD APHEEPDRWQ FSNAITLAR [0221] 进一步的，所述rv2949c基因来源于结核分枝杆菌Mtl03。如实施例所列举的，其 碱基序列为SEQ ID NO. 94:
[0222] ATGACCGAGT GTTTTCTATC TGATCAAGAG ATCCGAAAGC TCAATCGTGA CCTTCGAATA CTGATAGCAG CTAATGGCAC CCTCACTAGG GTTCTCAACA TTGTCGCTGA CGATGAGGTG ATCGTGCAAA TCGTCAAGCA GCGGATTCAC GATGTTTCAC CGAAGCTATC CGAATTCGAG CAGCTAGGGC AGGTGG