GGGT CGGCCGTGTT CTGCAGCGGT ACATCATACT TAAAGGTCGG AACTCGGAAC ACTTATTTGT AGCCGCGGAG TCGTTGATTG CGATTGATCG GTTGCCGGCT GCAATTATAA CAAGGTTGAC GCAGACAAAC GATCCTCTCG GCGAGGTTAT GGCAGCCAGC CACATCGAGA CCTTCAAGGA AGAGGCTAAA GTCTGGGTCG GAGATTTGCC AGGTTGGCTC GCGCTCCACG GGTATCAGAA TTCCCGAAAG AGAGCCGTTG CCCGCCGTTA TCGCGTTATT
[0223] 实施例8
[0224] 本实施例将PA1201衍生工程菌株PA1201MSHA 9中由pheA基因编码的PheA蛋 白中第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸pheA (W323L)的方法，包括下列步骤：
[0225] 1.构建包含pheA基因的载体pUC-pheA
[0226] L 1 设计 1 对引物（pheA-FOR 和 pheA-REV)，以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) PA1201基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增pheA基因， PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收扩增片 段，长度为l〇98bp (图22)。引物的核苷酸序列如表2中SEQ ID No. 85和SEQ ID No. 86所 不O
[0227] 引物中的下划线为限制性酶切位点Bam HI、Hind III的酶切位点。该引物委托上海 生工生物工程有限公司合成。
[0228] 1. 2上述PCR扩增片段经限制性内切酶Bam HI、Hind III酶切回收后，与同样双酶 切的自杀载体PUC18混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至E. coli DH5 α感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后， 对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组质粒pUC-pheA。
[0229] 2.在上述载体pUC-pheA基础上突变PheA第323位氨基酸，构建自杀载体 pEX-pheA(W323L)
[0230] 2. 1 设计 1 对引物（pheA-W323L-F0R 和 pheA-W323L-REV)，上述构建载体 pUC-pheA为模板，利用高保真聚合酶KOD-plus-neo扩增载体，PCR产物通过0. 8 %琼脂糖 凝胶电泳检测，并且通过AxyPr印凝胶回收试剂盒回收扩增片段，长度为3784bp。引物的核 苷酸序列如表2中SEQ ID No. 87和SEQ ID No. 88所示。
[0231] 引物中的下划线为phzA基因突变位点。该引物委托上海生工生物工程有限公司 合成。
[0232] 2. 2通过限制性内切酶Dpn I酶切处理上述PCR扩增片段，去除PCR产物中残留 的模板DNA (质粒载体pUC-pheA)。回收酶切过的PCR产物后，将PCR产物转化至E. coli DH5 α感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后， 对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到PheA蛋白第323位 氨基酸色氨酸突变为亮氨酸的重组质粒pUC-pheA (W323L)。
[0233] 2· 3利用限制性内切酶Bam HI、Hind III消化上述构建重组质粒pUC-pheA(W323L) 后，将含有突变位点的PhzA片段（1098bp)再经凝胶回收试剂盒纯化回收（图23)，与同样 双酶切的自杀载体pEX18Gm混合，并通过T4DNA连接酶过夜连接。连接后将连接产物转化至 E. coli DH5a感受态细胞，并涂布于含有庆大霉素的LB琼脂培养基上，37°C恒温培养18小 时后，对转化子进行PCR验证。验证正确的转化子提取质粒后测序验证，得到重组自杀质粒 pEX-pheA(W323L)。再将该测序正确的重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)转化至E. coliS17-l 感受态细胞，并涂布于LB庆大霉素琼脂培养基上，37°C恒温培养18小时后，得到含有重组 自杀质粒pEX-pheA (W323L)的S17-1大肠杆菌单菌落，用于将PheA蛋白中第323位氨基酸 色氨酸突变为亮氨酸PheA (W323L)。
[0234] 3.构建工程菌株 PA1201MSHA 9pheA(W323L)
[0235] 3. 1通过双亲杂交法，将上述构建重组自杀质粒pEX-pheA (W323L)转化至 PA1201衍生工程菌株PA1201MSHA 9基因组上：用无菌接种环，在LB平板上充分混合 PA1201MSHA 9与含有重组自杀质粒pEX-pheA(W323L)的大肠杆菌S17-1菌株的菌落，在 28~37°C条件下，培养6~18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀释在无菌水中， 取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28~37°C条件下，培养24~ 36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株。
[0236] 3. 2将上述单交换突变株用无菌水配置成菌悬液后，取少许涂布于含有10%蔗糖 的LB培养基上，在28~37°C条件下，培养36~48小时，筛选在含有庆大霉素的LB培养基 上不生长，但在含有壮观霉素的LB培养基上生长的单克隆菌落；
[0237] 3. 3利用引物pheA-FOR和pheA-REV和高保真聚合酶KOD-plus-neo,通过基因组 PCR，通过凝胶回收纯化PCR片段后，对片段进行测序。选取pheA基因第968位碱基G突变 为T的克隆，即为PheA蛋白中第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸pheA(W323L)的克隆。
[0238] 工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L)与野生型pheA基因比对结果：
[0239?
[0240] 上述DNA序列定向插入质粒，感受态大肠杆菌的制备、转化以及重组质粒的提取 和验证分别按照J.萨姆布鲁克、D.W.拉萨尔编著，2002年科学出版社出版的《分子克隆实 验指南（第三版）》，第1章第68~71页和第96~99页及第8章第663~666页中所述 方法进行。其中，自杀质粒PEXlSGm由上海交通大学生命科学技术学院提供。限制性内切 酶和连接酶均购于上海皓嘉科技发展有限公司。大肠杆菌中重组质粒的提取采用由上海捷 瑞生物工程有限公司提供的质粒小量制备试剂盒（离心柱型），产品目录号：GK2002-100。 高保真聚合酶KOD-plus-neo购于上海硕盟生物科技有限公司，产品目录号：K0D-201。DNA 片段回收纯化采用AxyPr印凝胶回收试剂盒，产品目录号：AP-GX-50,购于上海正晃商贸有 限公司。DNA凝胶电泳所用分子量标准品购于宝生物工程（大连）有限公司DL10,000DNA 分子量标准品，产品目录号：3584A。
[0241] 实施例9、细朐毒件和致病件测试
[0242] 在完成前述系列工程菌株构建后，通过使用罗氏公司的细胞毒性检测试剂盒 (Cytotoxicity Detection Kit(LDH);货号：11644793001)，检测野生型菌株 PA1201、致病 性相关基因敲除工程菌株PA1201 Λ 6、及本发明申嗪霉素超高产菌株PA- III对小鼠巨噬细 胞系RAW264. 7的细胞毒性：当感染复数为50时，PA1201野生型菌株与细胞系RAW264. 7共 培养5小时后，狀1264.7细胞的死亡率62.3%，但本发明工程菌株？4-111与？八1201八6在 与RAW264. 7细胞共培养后，细胞死亡率分别仅为7. 2%和16. 5%，与感染大肠杆菌DH5 α 后RAW264. 7细胞的死亡率5. 2%相当；然而，相同条件下临床铜绿假单胞菌菌株PAOl侵染 RAW264. 7细胞后导致RAW264. 7细胞大量死亡，死亡率高达95. 0% (图2)。由此可见，敲 除了致病性相关基因 toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇 后，工程菌株PA- III和PA1201 Λ 6的细胞毒性显著下降。
[0243] 用野生型菌株ΡΑ1201、致病性相关基因敲除工程菌株ΡΑ1201Δ 6、本发明申嗪霉 素超高产菌株PA- III和大肠杆菌DH5 α分别喂食黑腹果蝇，记录并比较喂食后果蝇的存活 时间。结果表明：喂食了 ΡΑ1201果蝇在喂食后第4天开始死亡，并于第9天全部死亡；饲 喂工程菌株ΡΑ1201 Λ 6的果蝇在喂食后第7天开始死亡，在第11天后保持存活率20% ; 喂食申嗪霉素超高产菌株PA-III的果蝇在喂食后第9天开始死亡，在第11天后保持存活率 55%，该结果与喂食大肠杆菌DH5a的果蝇接近（图3)。由此可见，敲除了致病性相关基 因 toxA、adhesin、pilA-D基因簇、pilG-K基因簇和HCN生物合成基因簇后以及绿脓菌素 合成相关基因 PhzM和phzS的申嗪霉素超高产工程菌株PA- III对果蝇的毒性较出发菌株 PA1201显著下降。
[0244] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一株生产申嗪霉素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为铜绿假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 2015040。2. -种根据权利要求1所述生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于， 所述构建方法包括如下步骤： 步骤一、敲除野生菌株PA1201中致病性相关基因/基因簇，得工程菌株PA1201 A 6 ; 步骤二、敲除所述工程菌株PA1201A6中申嗪霉素代谢基因，得工程菌株 PA1201MSHA6 ； 步骤三、敲除所述工程菌株PA120IMSH A6中分支酸代谢相关基因，得工程菌株 PA1201MSHA9 ； 步骤四、通过点突变法，将所述工程菌株PA1201MSH A 9中芳香族氨基酸生物合成相关 蛋白进行突变，得到工程菌株PA1201MSH A 9pheA (W323L); 步骤五、将所述工程菌株PA1201MSH A 9pheA (W323L)的辅酶Q生物合成途径 中分支酸丙酮酸裂解酶编码基因UbiC替换为生物活性较低的基因，得到工程菌株 PA1201MSHA9pheA(W323L)Rv2949c ； 步骤六、利用基因组整合载体将在强启动子控制下的PhzC基因整合入所述工程菌株 PA1201MSHA9pheA(W323L)Rv2949c的基因组，并将基因组上aroG基因的启动子置换为强 启动子，得工程菌株PA-I ; 步骤七、敲除所述工程菌株PA-I中申嗪霉素合成基因簇phzAl-phzGl上转录抑制区域 (5' -UTR)，得到工程菌株PA-I AUTR ;将所述工程菌株PA-I AUTR中申嗪霉素合成基因簇 phzA2-G2的启动子置换为强启动子，得工程菌株PA- II ; 步骤八、将所述工程菌株PA- II中mexGHI-opmD基因簇启动子置换为强启动子，即 得所述生产申嘆霉素的基因工程菌株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M2015040,即基因工程菌株PA- III。3. 根据权利要求2所述的生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步 骤一中，所述致病性相关基因/基因簇包括包括：exsA、toxA、adhesin、pilA-D*pilG_KS 因簇或氢氰酸生物合成基因簇hen ; 步骤二中，所述申嘆霉素代谢基因包括phzM、phzS或phzH ; 步骤三中，所述分支酸代谢相关基因包括trpE、pabB或pch基因簇。4. 根据权利要求2所述的生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步 骤四中，所述芳香族氨基酸生物合成相关蛋白具体指PheA ;所述点突变具体指将蛋白PheA 的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸。5. 根据权利要求2所述的生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步 骤五中，所述生物活性较低的基因为革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶编 码基因rv2949c〇6. 根据权利要求2所述的生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步 骤六中，所述基因组整合载体具体指mini-Tn7T-Gm-phzC，所述强启动子具体指P ta。。7. 根据权利要求2所述的生产申嗪霉素的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步 骤七、八中，所述强启动子为P1UTK。8. -种根据权利要求1所述生产申嗪霉素的基因工程菌株在制备生物农药中的用途。9. 一种用权利要求1所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，其特征在于，所述方法 包括如下步骤： A、 将所述基因工程菌株PA- III接种于LB平板上，在25~37°C下活化生长18~28小 时，然后挑取单克隆接种于LB培养液中，于25~30°C、转速为180~220转/分条件下震 荡培养16~24小时，得种子液； B、 将所述种子液以1~5%的体积百分比接种于放大培养基中，于25~30°C、180~ 220转/分条件下放大发酵培养72~80小时，即得含有申嗪霉素的发酵液； C、 向所述发酵液中加入适量盐酸溶液，调整pH至3. 0~4. 0,再加入氯仿对发酵液中的 吩嗪类物质进行萃取；静置，取下层氯仿萃取液，在35~45°C下将萃取液旋转蒸干，得申嗪 霉素萃取液。10. 根据权利要求9所述的用所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，其特征在于，步 骤B中，所述放大培养基选自黄豆粉发酵培养基或PPM发酵培养基；步骤C中，所述盐酸溶 液的浓度为6M ;所述氯仿加入的量为发酵液体积的3倍。
【专利摘要】本发明公开一株安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用；基因工程菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO:M 2015040：通过对菌株PA1201致病性基因敲除、申嗪霉素代谢基因敲除、分支酸代谢基因敲除、点突变法降低PheA生物活性、同工酶替代法降低分支酸丙酮酸裂解酶生物活性、在基因组增加phzC基因拷贝数、aroG启动子替换为强启动子Ptac增强DAHP合酶基因表达水平、启动子置换法增强申嗪霉素生物合成基因簇表达水平和申嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD表达水平，即得；该菌株能安全、经济、超高产申嗪霉素。CCTCC NO:M 201504020150118
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/78, C12R1/385, C12P17/12, C12N1/20
【公开号】CN104946552
【申请号】CN201510056619
【发明人】周莲, 金凯明, 何亚文
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年2月3日