生菌株中：用无 菌接种环，在LB平板上充分混合PA1201衍生菌株与含有重组自杀质粒的大肠杆菌S17-1 菌株的菌落，在28~37°C条件下，培养6~18小时后，用无菌接种环刮取少量接合菌落，稀 释在无菌水中，取100微升涂布于含有庆大霉素和壮观霉素的LB平板上，在28~37°C条件 下，培养24~36小时，筛选得到抗庆大霉素的单交换突变株；
[0040] (6)将单交换突变株稀释涂布于含有10 %蔗糖的LB培养基上，在28~37°C条件 下，培养36~48小时，从中筛选得到基因/启动子置换后的工程菌株。
[0041] 优选地，所述需置换基因/启动子包括：aroG基因（编码DAHP合酶AroG)启动 子、申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子、mexGHI-opmD基因簇（编码申嗪霉素外排 泵MexGHI-OpmD)启动子，和UbiC基因（编码分支酸丙酮酸裂解酶UbiC)。
[0042] 优选地，所述用于替换上述基因/启动子的替代基因/启动子包括：Pta。强启动子、 去除了 PhzAl-Gl基因簇启动子上转录抑制区域5'-UTR的强启动子Piutk，和来源于革兰氏 阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶基因 rv2949c。
[0043] 优选地，所述用于置换aroG基因启动子的三对引物如序列r2020-F0R-l和 r2020-REV-l、raroG-F0R-3 和 raroG-REV-3、rPtac-F0R-2 和 rPtac-REV-2 ;所示 phzA2-G2 基因簇启动子的两对引物如序列rqscR-FOR-1和rqscR-REV-1、rphzA2-F0R_3和 rphzA2-REV-3、rUTR(A2) -F0R-2 和 rUTR-REV-2 ;mexGHI-〇pmD 基因簇启动子的两对引物 如序列 r0733-F0R-l 和 r0733-REV-l、rmexG-F0R-3 和 rmexG-REV-3、rUTR(mexG)-F0R-2 和rUTR-REV-2所示；ubiC基因的两对引物如序列如rglcC-FOR-1和rglcC-REV-1、 rubiA-F0R-3 和 rubiA-F0R-3、rrv2949c-F0R-2 和 rrv2949c-REV-2 所示。
[0044] 本发明所涉及基因、启动子或特定DNA序列包括：DAHP合酶编码基因 aroG启动 子、申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子、申嗪霉素外排泵基因簇mexGHI-opmD启动 子，和分支酸代谢相关基因 UbiC的置换均可通过上述步骤1到6完成，不同之处在于使用 引物为为扩增所述基因或启动子两段侧翼序列设计（详见表2);在工程菌株PA1201MSHA 9pheA(W323L)RV2949C中，DAHP合酶编码基因 aroG启动子被置换为强启动Ptae;在工程菌 株中PA-I Λ UTR中，申嗪霉素生物合成基因簇phzA2-G2启动子被置换为强启动子Piutk;在 工程菌株PA- II中mexGHI-opmD基因簇的启动子为强启动子Piutk;在工程菌株PA1201MSH Δ 9pheA(W323L)中，分支酸代谢相关基因 UbiC被置换为来源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌 的基因 rv2949c ;
[0045] 第三方面，本发明提供一种所述生产申嗪霉素的基因工程菌株在制备生物农药申 嗪霉素中的用途。
[0046] 第四方面，本发明提供一种用所述基因工程菌株生产申嗪霉素的方法，所述方法 包括如下步骤：
[0047] A、将所述基因工程菌株PA- III接种于LB平板上，在25~37°C下活化生长18~ 28小时，然后挑取单克隆接种于LB培养液中，于25~30°C、转速为180~220转/分条件 下震荡培养16~24小时，得种子液；
[0048] B、将所述种子液以1~5%的体积百分比接种于放大培养基中，于25~30°C、 180~220转/分条件下放大发酵培养72~80小时，即得含有申嗪霉素的发酵液；
[0049] C、向所述发酵液中加入适量盐酸溶液，调整pH至3. 0~4. 0,再加入氯仿对发酵液 中的吩嗪类物质进行萃取；静置，取下层氯仿萃取液，在35~45°C下将萃取液旋转蒸干，得 申嗪霉素萃取液；其中，申嗪霉素的含量通过高效液相色谱分析测定。
[0050] 优选地，步骤A中，所述LB培养液的制备包括：取去离子水1升、胰蛋白胨10克、 酵母提取物5克、氯化钠10克，混合，pH调节为7. 0~7. 4,121摄氏度高压灭菌15分钟后， 即得。
[0051] 优选地，步骤B中，所述放大培养基选自黄豆粉发酵培养基或PPM发酵培养基；
[0052] 所述黄豆粉发酵培养液的制备具体为：取去离子水978毫升、黄豆粉65克、玉米浆 16克、葡萄糖12克，混合，pH调节为6. 8~7. 2,121摄氏度高压灭菌15分钟后，再加入无 水乙醇22毫升，即得；
[0053] 所述PPM发酵培养液的制备具体为：取去离子水1升、胰蛋白胨22克、葡萄糖20 克、硝酸钾5克，混合，pH调节为7. 2~7. 6,121摄氏度高压灭菌15分钟后，即得。
[0054] 本发明所涉基因工程菌株在黄豆粉发酵培养基中申嗪霉素产量为6. 6~7. 4克/ 升发酵液；在PPM发酵培养基中申嗪霉素产量为3. 5~4. 0克/升发酵液。
[0055] 优选地，步骤C中，所述盐酸溶液的浓度为6M。
[0056] 优选地，步骤C中，所述氯仿加入的量为发酵液体积的3倍。
[0057] 优选地，步骤C中，所述高效液相色谱具体为：液相色谱柱为C18分析柱；流动相 为5mM乙酸铵水溶液：乙腈（40 :60，v/v);流量为0. 7ml/min ;检测波长为252nm ;进样量为 2yL;出峰时间为L9min。
[0058] 优选地，步骤C中，所述申嗪霉素的含量通过高效液相色谱分析测定具体为：根 据已知浓度的申嗪霉素标准样品通过上述方法测定的出峰峰面积，可得申嗪霉素含量的线 性回归方程：申嗪霉素含量（毫克/升发酵液）=(实测峰面积-23. 283)/68. 281 (R2 = 0. 99986);根据回归方程，可计算出未知发酵液萃取液中申嗪霉素的含量。
[0059] 本发明的目的在于针对现有菌株存在的缺陷，提供一种安全性能优越并超高产申 嗪霉素的工程菌株PA-III，在保证使用安全的前提下，大幅降低申嗪霉素的生产成本。
[0060] 致病性相关基因的敲除：利用基因敲除方法，对拮抗菌株PA1201中致病性相关基 因/基因簇进行敲除，包括 ：exsA (编码III型分泌系统全局转录激活因子ExsA)、toxA (编码 外毒素 A)、adhesin (编码黏附素）、pilA-D和pilG-K基因簇（编码菌毛生物合成相关蛋 白），以及氢氰酸（HCN)生物合成基因簇，得到工程菌株PA1201 Λ 6。该工程菌株PA1201 Λ 6对小鼠巨噬细胞系RAW264. 7和果蝇的细胞毒性较原菌株ΡΑ1201显著下降，但申嗪霉素的 产量在PPM发酵培养基中或黄豆粉发酵培养基中不受上述致病性相关基因敲除影响，保持 在0. 8克/升发酵液左右。
[0061] 申嗪霉素代谢基因的敲除：在铜绿假单胞菌中，申嗪霉素不是吩嗪生物合成途径 的最终产物，ΡΑ1201基因组上包含3个申嗪霉素修饰基因 phzM、phzS和phzH，可在胞内将 申嗪霉素进一步转化为下游代谢产物（图1)，包括吩嗪-1-酰胺和绿脓菌素，其中绿脓菌素 是一种致病因子，具有细胞毒性。为了阻断申嗪霉素在胞内向下游产物的转化("节流")，我 们在致病性相关基因敲除菌株PA1201 Λ 6的基础上，敲除了申嗪霉素代谢基因 phzM、phzS 和phzH，得到工程菌株PA1201MSH Λ 6,该菌株在PPM发酵培养基中申嗪霉素产量较原始菌 株提高135%。
[0062] 分支酸代谢相关基因的敲除、改造与替换：在铜绿假单胞菌ΡΑ1201中，申嗪霉素 的生物合成前体为分支酸。分支酸是莽草酸途径的终产物，也是微生物代谢途径的一个重 要分叉点。菌株ΡΑ1201除了可以利用分支酸合成申嗪霉素以外，还包含至少5个可利用 分支酸的代谢途径来合成叶酸、芳香族氨基酸、螯铁蛋白和辅酶Q(图1)。为了阻止分支酸 向除了申嗪霉素以外的代谢产物（"节流"），我们在工程菌株PA1201MSHA 6的基础上，分 别单独敲除了分支酸代谢相关基因 trpE、pabB和pch基因簇（图1);并利用点突变法将 芳香族氨基酸生物合成途径中负责将分支酸转化为酪氨酸和苯丙氨酸合成前体预苯酸的 关键蛋白PheA的第323位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸，降低了 PheA的生物活性；再利用 基因置换法，将辅酶Q生物合成途径中负责编码分支酸丙酮酸裂解酶基因 UbiC替换为来 源于革兰氏阳性菌结核分枝杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶基因 rv2949c，基因 rv2949c编码 的分支酸丙酮酸裂解酶的生物活性较低；通过上述方法所得工程菌株在发酵培养基中的生 长不受影响，但是申嗪霉素的产量较PA1201MSHA 6菌株均有一定程度的提高（表1)。随 后，在工程菌株PA1201MSHΛ 6的基础上对上述所有分支酸代谢基因/基因簇相应地进 行了敲除（基因 trpE、pabB和pch基因簇）、点突变（pheA)和置换（UbiC)，所得工程菌株 PA1201MSHA 9pheA(W323L)RV2949C由分支酸转化为申嗪霉素转化效率得到大幅提高，在 PPM发酵培养基中申嗪霉素的产量较PA1201MSHA 6提高175%。
[0063]表 1
[0065] 增强DAHP合酶PhzC和AroG的表达水平：在铜绿假单胞菌PA1201中，3-脱氧阿拉 伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP)合酶在申嗪霉素生物合成过程中至关重要，该酶负责在莽草酸 途径中将4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸转化为DAHP，控制体内碳源代谢流流向莽草 酸（申嗪霉素生物合成前体）合成途径。PA1201基因组包含多个DAHP合酶编码基因，包括 由位于2个申嗪霉素合成基因簇中的phzCl和phzC2基因编码的II型DAHP合酶（PhzC)， 以及由aroG编码的I型DAHP合酶（AroG)。为了提高申嗪霉素合成前体水平（"开源"） 来促进申嗪霉素的合成，我们利用基因组整合质粒mini-Tn7T-Gm在工程菌株PA1201MSHA 9pheA (W323L) Rv2949c基因组上过表达phzC基因，并通过启动子置换方法，增强aroG基 因的表达水平，所得工程菌株PA-I在PPM发酵培养基中的申嗪霉素产量较PA1201MSH Λ 9pheA (W323L) Rv2949c 菌株提高 69 %。
[0066] 增强申嗪霉素生物合成基因簇phzAl-Gl和phzA2_G2表达水平：申嗪霉素的生 物合成依赖于两个高度同源的申嘆霉素合成基因簇：phzAl-phzGl和phzA2-phzG2。其中 phzAl-phzGl基因簇启动子上存在一个转录抑制区域（5' -UTR)，大幅影响了该基因簇的转 录水平，从而影响了申嗪霉素的产量。我们在工程菌株PA-I的基础上，敲除该转录抑制区 域（5'-UTR)，将phzAl-phzGl基因簇启动子改造为一个强启动子P iutk来促进该基因簇的表 达，得到工程菌株ΡΑ-ΙΔ UTR。随后，又在菌株ΡΑ-ΙΔ UTR的基础上，将第二个申嗪霉素合 成基因簇phzA2-G2的启动子置换为上述构建启动子Piutk，改造后所得工程菌株PA- II的两 个申嗪霉素合成基因簇的表达都由该强启动子控制，菌株PA- II的申嗪霉素产量在PPM发 酵培养基中较PA-I菌株提高252%。
[0067] 增强申嘆霉素外排泵MexGHI-OpmD的表达水平：由mexGHI-opmD基因簇编码的申 嗪霉素外排泵MexGHI-OpmD负责将申嗪霉素从胞内排放到胞外，提高申嗪霉素向体外排放 的速度有利于进一步提高申嗪霉素产量。因此，我们利用启动子置换法，在工程菌株PA- II 的基础上，将mexGHI-opmD的启动子置换为前述强启动子Piutk，所得工程菌株PA- III的申 嗪霉素发酵效价在PPM发酵培养基中较PA- II菌株提高21 %，达到3. 7克/升发酵液；并 且工程菌株PA- III在黄豆粉发酵培养基中申嗪霉素的发酵效价可达7. 2克/升发酵液，是 原始菌株PA1201的9倍之多。
[0068] 表2.本发明菌株PA-III构建中使用的引物序列
[0072] 表中引物序列中：下划线部分为酶切位点（其中，SEQ ID No. 87和88为氨基酸突 变位点），小写字母为侧翼下游扩增序列5'端18个碱基序列，该序列是侧翼上游扩增序列 3'端18个碱基序列（一般为18碱基序列）的反向互补序列（重叠部分）。所述引物委托 上海生工生物工程有限公司合成。
[0073] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0074] (1)由于水稻根际拮抗菌PA1201与临床分离条件致病菌铜绿假单胞菌同源性高， 因而被鉴定为铜绿假单胞菌。临床铜绿假单胞菌为机会性致病菌，能产生多种毒力因子，侵 染人体，因此，若在工业生产中大规模使用菌株PA1201，将有造成人体感染的潜在风险。针 对这个问题，我们系统分析了铜绿假单胞菌主要致病因子，再运用基因工程手段，全面敲除 PA1201基因组中与毒性相关基因/基因簇，工程菌株PA-III的细菌黏附系统和III型分泌系 统被破坏，不能产生致病性III型分泌效应子；也不能产生具有细胞毒性副产物氢氰酸、外毒 素 A和绿脓菌素；因此，与野生型相比，对小鼠巨噬细胞RAW264. 7的细胞毒性显著降低，在 果蝇感染模型中，喂食了工程菌株PA- III的黑腹果蝇的存活时间显著优于喂食了野生型菌 株果蝇。由此可见，该工程菌株PA- III相比野生型菌株PA1201，对动物的毒性显著降低，菌 株的安全性得到大幅提升，有利于工业化大规模生产。
[0075] (2)利用菌株PA1201发酵申嗪霉素，其发酵效价仅能达到0. 8克/升发酵液，发 酵成本高，缺乏市场竞争力。为了提高申嗪霉素的发酵效价，我们本着"开源节流"的指导 方针，对菌株PA1201中申嗪霉素的生物合成、代谢途径以及生物合成调控机理展开了全局 性的分析，并在此基础上，对菌株PA1201进行了一系列的基因敲除、改造和置换，分别从 基因表达水平、蛋白质生物活性水平和碳源代谢流水平全面提升该菌株的申嗪霉素发酵效 价，降低了生产成本，增加了该生物农药的市场竞争力。
[0076] 首先，由于申嗪霉素不是假单胞菌吩嗪合成的最终产物，申嗪霉素在细菌体内可 被进一步代谢为其衍生物，从而降低申嗪霉素的产量。通过全面敲除申嗪霉素代谢基因 phzM、phzS和phzH，截断了体内申嘆霉素向绿脓菌素和吩嘆-1-酰胺转化的途径，所得工程 菌株不再产生具有细胞毒性的化合物绿脓菌素，在提高菌株安全性的基础上显著增加了申 嗪霉素的产量和纯度；
[0077] 其次，前期申嗪霉素工程菌株的构建方法是通过质粒pME6032加强申嗪霉素 生物合成基因簇在假单胞菌中的表达水平（专利名称：利用工程菌株M18G携带质粒 p