检测链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸条及胶体金试剂卡的制作方法

本实用新型涉及胶体金免疫层析法快速检测领域，具体地说，涉及一种链格孢毒素链格孢酚单甲醚的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术：

链格孢霉菌属于丝状真菌，是一种普遍存在于水果、蔬菜等食品中的病原体和腐生菌，它可以在低温潮湿的环境下生长繁殖，因此是导致冷藏或长途运输过程中水果、蔬菜等食品腐烂变质的主要微生物。链格孢酚单甲醚(AME)是链格孢霉菌的主要次生代谢产物之一，由于它具有诱变性、基因毒性、致癌性，能够诱导单链DNA和双链DNA的断裂，并且还被鉴定为拓朴异构酶Ⅰ和Ⅱ强有力的抑制剂，摄取链格孢毒素侵染的食品会对人体健康造成严重危害。因此，AME成为目前国内外科学家研究较多的主要的链格孢毒素之一。

但到目前为止，国内外现行的食品中真菌毒素的限量标准尚不包括链格孢毒素，然而近年来，欧盟已经就食品与饲料中链格孢毒素对人畜的健康风险发布了科学意见，并且在国际贸易中，商家委托第三方检测链格孢毒素的现象已经十分普遍，其检测主要采用实验室中的气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS)等传统检测方法。然而，这些传统的检测方法通常需要大型、昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，并且检测只能在实验室中进行，检测时间长，费时费力，不能满足当前食品安全领域所追求的实时、快速、便携式检测的需求。

针对上述传统检测方法的不足，基于单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条，具有快速、操作简单、高特异性、高灵敏性、检测成本低、不需要检测仪器，并且特别适用于现场大量样本的实时、快速抽样检 测的特点，因此可以简单、快速实现水果蔬菜等食品中AME的定性或半定量检测。AME属于有机小分子，不具备免疫原性，需要通过羧基化修饰制备成半抗原，并与BSA载体蛋白偶联合成完全抗原对动物进行免疫才能获得特异性单克隆抗体。目前，我们已经成功筛选到AME的单克隆抗体，这就使胶体金免疫层析试纸条应用于AME的检测成为可能。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本实用新型是针对链格孢毒素传统检测方法的不足，将胶体金免疫层析试纸条应用于链格孢毒素AME的检测，实现蔬菜水果等食品中AME的定性及半定量快速检测，该试纸条检测时间短、专一性强、操作简单，不需要大型检测设备。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本实用新型提供一种检测链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板、样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水膜，所述NC膜粘附在PVC底板上，胶体金结合垫和吸水垫分别粘附在NC膜的两端，样品垫粘附在胶体金结合垫的另一端，胶体金结合垫上包被有胶体金修饰的链格孢毒素AME单克隆抗体，NC膜上设置了检测线和质控线。

其中，所述链格孢毒素AME单克隆抗体可为本领域技术人员根据常规单克隆抗体的制备方法制备得到的。

例如，对AME羧基化衍生修饰得到半抗原，并与BSA偶联得到AME-BSA免疫原，然后对动物进行免疫，将产生AME单抗的动物脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合得到能够稳定分泌AME单克隆抗体的杂交瘤细胞，并按照常规方法进行单克隆抗体的腹水制备及纯化。

所述NC膜为Millipore135，所述检测线上固定有AME-OVA抗原， 所述质控线上固定有羊抗鼠二抗。

所述胶体金结合垫为玻璃纤维素膜，所述胶体金的纳米颗粒大小为13～40nm，优选18nm。

所述样品垫优选为玻璃纤维素膜。

所述吸水垫优选为滤纸纤维。

进一步地，所述试纸条的宽度为4～5mm。

作为优选，所述吸水垫压住NC膜的一端2mm，NC膜的另一端被包被有胶体金-AME抗体复合物的胶体金结合垫压住2mm，样品垫压住胶体金结合垫2mm。

本实用新型还提供一种检测链格孢毒素AME的胶体金试剂卡，所述胶体金试剂卡由所述胶体金试纸条和包裹该胶体金试纸条的塑料外壳构成，塑料外壳上设有上样孔。

进一步地，所述胶体金免疫层析试纸条的具体制备步骤为：

(1)样品垫预处理：将样品垫放置于预处理缓冲液(0.5g BSA，50μL Tween-20溶于50mL的磷酸盐缓冲液)中，并于37℃恒温水浴箱中孵育30min；随后用大量的磷酸盐缓冲液彻底清洗，37℃烘箱中干燥2h，最后4℃干燥条件下保存备用。

(2)胶体金垫预处理：将胶体金结合垫浸泡在预处理缓冲液(1g BSA，1.5g蔗糖和0.01g叠氮钠溶于50mL 10mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液)中，并放置于37℃恒温水浴箱中孵育30min；随后用大量的磷酸盐缓冲液进行彻底清洗，37℃烘箱干燥2h，最后4℃干燥条件下保存备用；

(3)将AME单克隆抗体与18nm的胶体金纳米颗粒孵育形成胶体金-抗体复合物，并将其喷涂于预处理后的胶体金结合垫；

(4)将AME-OVA包被原(1mg/mL)按照1.0μL/cm的包被量固定于NC膜T线预设区域，形成T线；

(5)同样将羊抗鼠二抗(1mg/mL)按照1.0μL/cm的包被量固 定于NC膜C线预设区域，形成C线；

(6)试纸条组装：首先，将固定有抗体的NC膜粘贴在PVC底板上；其次，用吸水垫压住NC膜的一端2mm左右，NC膜的另一端被包被有胶体金-AME抗体复合物的胶体金结合垫压住约2mm左右；最后，样品垫压住胶体金结合垫2mm左右。

(三)有益效果

(1)本实用新型是基于AME单克隆抗体制备的检测AME的竞争性胶体金试纸条，可以定性或半定量检测样本中的链格孢毒素AME的含量，可在5-10min内实现AME的可视化检测，检测灵敏度达到10ng/mL，并且检测专一性强，操作简单；

(2)本实用新型采用基于AME单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条定性或半定量检测AME，可广泛应用于蔬菜、水果等大批量样本中AME的分析检测及快速筛查。

(3)本实用新型使用高专一性和亲和性的单克隆抗体制备胶体金免疫层析试纸条，使胶体金免疫层析试纸条应用于AME的检测成为可能。

附图说明

图1为本实用新型所述检测链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸条的立体结构示意图；

图2为本实用新型所述检测链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图；

图1和图2中，1、PVC底板；2、NC膜；3、结合垫；4、样品垫；5、吸水膜；6、检测线(T点)；7、质控线(C点)；

图3为本实用新型所述检测链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

实施例1胶体金的制备

本实施例采用柠檬酸钠还原法制备胶体金纳米颗粒，具体制备步骤为：

(1)取99mL超纯水和1mL 1％的三氯金酸水溶液，混匀后，磁力搅拌加热煮沸；

(2)快速加入1.8mL 1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸；

(3)当胶体金溶液颜色由浅黄色变为蓝黑色，最后变为酒红色后，继续加热煮沸10min；

(4)当制备好的胶体金溶液的温度降至室温时，将制备好的胶体金溶液定容到100mL。

(5)最后，将制备好的胶体金溶液放于洗净的玻璃瓶中，并于4℃环境条件下存放备用。

实施例2胶体金标记抗体的制备

(1)取实施例1制备好的粒径大小为18nm的胶体金溶液2mL，用0.1M K₂CO₃调节其pH到8.0；

(2)逐滴加入200μL浓度为0.1μg/μL的AME单克隆抗体，室温条件下磁力搅拌反应2h；

(3)逐滴加入10％的BSA溶液，使其终浓度为0.5％，室温条件下磁力搅拌反应30min；

(4)逐滴加入10％的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2％，室温条件下磁力搅拌30min；

(5)12000rpm离心30min，弃掉上清，留下胶体金沉淀；

(6)向沉淀中加入1％的BSA溶液重悬胶体金，然后12000rpm离心，重复进行三次后，用胶体金重悬液(0.025g PEG20000，2.5g蔗糖，0.5g HSA和50μL Tween-20溶于50mL 10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中)重悬沉淀至原体积的1/10。

实施例3试纸条的组装(图1)

将实施例2所得胶体金标记的AME单克隆抗体喷涂于预处理后的胶体金结合垫；

将AME-OVA包被原(1mg/mL)按照1.0μL/cm的包被量固定于NC膜T线预设区域，形成T线；同样将羊抗鼠二抗(1mg/mL)按照1.0μL/cm的包被量固定于NC膜C线预设区域，形成C线；37℃恒温干燥箱中固定2h后，4℃条件下保存备用。

将固定有抗体的NC膜粘贴在PVC底板上；

用吸水垫压住NC膜的一端2mm左右，NC膜的另一端被包被有胶体金-AME抗体复合物的胶体金结合垫压住约2mm左右；最后，样品垫压住胶体金结合垫2mm左右。试纸条的宽度为4mm，长度为6cm。

实施例4胶体金免疫层析试纸条对链格孢毒素AME的检测

1、胶体金试纸条对AME的检测

以AME标准品为检测对象，用PB缓冲液依次稀释AME标准品，使其浓度分别为50ng/mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL。分别取70μL上述AME标准品，分别滴加到制备的胶体金免疫层析试纸条上进行检测，5-10min 后观察显色结果(图3)。

从结果中可以看出，当AME浓度小于10ng/mL时，随着AME标准品浓度的降低，检测线上红色强度增加；当AME浓度大于10ng/mL时，检测线不显色。

上述结果表明，该试纸条的检测限为10ng/mL。

2、交叉反应验证

由于链格孢酚AOH和AME具有相似的结构，因此，本发明利用AOH进一步考察此胶体金试纸条的检测特异性。以AOH标准品为检测对象，用PB缓冲液依次稀释AOH标准品，使其浓度分别400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。依次取70μL上述AOH标准品溶液，分别滴加到制备的胶体金免疫层析试纸条上进行检测，5-10min后观察显色结果。

结果显示为：当AOH的浓度分别为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL时，检测线和质控线均显色，检测结果均为阴性，可以得出本发明的胶体金免疫层析试纸条具有高的检测专一性，无交叉反应。

本实施例基于AME单克隆抗体竞争性胶体金试纸条，定性或半定量检测样本中的链格孢毒素AME的含量，可在5-10min内实现AME的可视化检测，检测灵敏度达到ng/mL，并且可广泛应用于蔬菜、水果等大批量样本中AME的分析检测及快速筛查。

以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。