用于流式细胞术的多光谱滤波器剖析及质量控制的制作方法

相关申请案交叉参考

本申请案依据35u.s.c.§119(e)主张2015年8月12日提出申请且标题为“用于流式细胞术的多光谱滤波器剖析及质量控制(multi-spectralfilterprofilingandqualitycontrolforflowcytometry)”的第62/204,001号美国临时专利申请案及2016年8月11日提出申请且标题为“用于流式细胞术的多光谱滤波器剖析及质量控制(multi-spectralfilterprofilingandqualitycontrolforflowcytometry)”的第15/234,852号美国专利申请案的优先权权益，所述专利申请案据此以其全文引用方式并入本文中。

背景技术：

流式细胞仪已广泛地用于分析细胞及各种颗粒。作为诊断工具，流式细胞仪在提供关于细胞及颗粒的生理的详细信息方面一直非常有效。流式细胞仪已在研究实验室及诊所两者中用于分析细胞及其它颗粒。流式细胞仪包含比色皿中的传统流体动力聚焦的样本流、与空气中喷射分选的流式细胞仪一起的流体动力聚焦的样本流及不使用聚焦的微流体系统。出于此应用的目的，术语“流式细胞仪”应包含所有这些不同类型的流式细胞仪。

在许多典型流式细胞仪中，可用标记(例如，发荧光指示剂)给所关注颗粒或细胞加标签，可模拟所述标记以提供可量化响应，例如，以发出可由光学传感器检测的光。举例来说，在典型流式细胞术系统中，可使样本与已知结合到所关注颗粒的荧光指示剂混合，且这样做会使样本变得对(一或若干)特定波长的光为光敏的。接着可将所述样本聚焦到流或其它受约束区域中且用所述(一或若干)特定波长的高强度光照射所述样本—存在的任何光敏指示剂接着将响应于此照射而发荧光。通常选择此些指示剂以发出除刺激光以外的其它波长的光。接着可捕获且测量从被刺激指示剂发出的光以提供对多少指示剂存在且发荧光的评估，借此允许指示剂所结合的颗粒量的量化。

在实践中，获得此测量存在许多障碍。举例来说，必须提供到指示剂以便致使其在所要波长下以可检测到的强度级发荧光的刺激光的强度可比发出荧光的强度高数个数量级。由于目标细胞及颗粒的大小通常是相当小的，因此刺激光可需要紧紧地聚焦在细胞或颗粒上以便提供充足刺激光强度而不会不必要地增加刺激指示剂所需要的能量消耗。

此外，发荧光颗粒或细胞可以大体全向方式发出荧光，借此使高效地捕获经由荧光发出的所有光为不实际的。此减少可被捕获及量化的荧光量，借此进一步降低流式细胞术系统的测量效率。使流式细胞术测量进一步复杂化的另一问题是最终递送到检测器系统的荧光(所述检测器系统能够测量此荧光的强度)可为极其微弱的—微弱的使得许多光电检测器系统将不能够充分地量化其。为了所述目的，可使用极其灵敏光电检测器系统，例如光电倍增管，所述光电倍增管将所接收荧光转换成可被放大多个数量级(例如，100,000倍)的电流。

为了允许单个流式细胞仪用于单独或同时处理多个不同类型的颗粒或细胞及指示剂，许多流式细胞仪可包含多个光电检测器系统，每一光电检测器系统配备有允许流式细胞仪通过移除或交换滤波器而容易地重新配置的滤波系统。此允许每一光电检测器经调谐以可接受仅特定光谱的光，借此允许每一光电检测器用于检测不同指示剂的存在(或所接收光的不同光谱的存在—在一些情形中，指示剂可发出多个不同频率的光，且多个不同光电检测器可用于检测每一单独频率)。

本文中论述对具有此类可重新配置滤波系统的流式细胞仪系统进行改进的技术及系统。

技术实现要素：

在一些实施例中，可提供包含至少一个样本照射源的流式细胞术系统，所述至少一个样本照射源经配置以将光递送到对应样本位置，借此致使样本光由对应样本位置中的颗粒发出或经散射离开所述颗粒。所述流式细胞术系统还可包含聚焦光学器件，所述聚焦光学器件经配置以沿着一或多个光学路径引导来自每一样本位置的所述样本光，使得每一光学路径穿过对应的一或多个光学滤波器元件且终止于对应检测器处，所述对应检测器经配置以产生指示到达所述检测器的光的所测量强度的输出数据。所述流式细胞术系统还可包含校准光源，所述校准光源经配置以独立地发出不同光谱分布曲线的校准光，每一光谱分布曲线的校准光在不同波长下具有一或多个峰值，使得沿着所述光学路径中的每一者的至少一部分引导所述所发出校准光。所述流式细胞术系统还可包含一或多个处理器及存储器，所述存储器存储在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的计算机可执行指令：响应于所述检测器中的每一者从所述校准光源接收到校准光而从所述检测器接收所述输出数据；及通过分析在由所述校准光源发出至少两个不同光谱分布曲线的校准光期间产生的所述输出数据来确定沿着每一光学路径的所述光学滤波器元件的滤波特性。

在一些此类实施例中，所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：致使所述校准光源在第一时间发出具有第一光谱分布曲线的第一校准光；响应于所述检测器在所述第一时间从所述校准光源接收到所述第一校准光而从所述检测器中的每一者获得第一输出数据；致使所述校准光源在所述第一时间之后的第二时间发出具有所述第一光谱分布曲线的第二校准光；响应于所述检测器在所述第二时间从所述校准光源接收到所述第二校准光而从所述检测器中的每一者获得第二输出数据；及将所述第二输出数据与所述第一输出数据进行比较以确定所述流式细胞术系统的光学性能是否已存在改变。

在所述流式细胞术系统的一些其它或进一步此类实施例中，所述一或多个检测器可包含第一检测器，且所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而产生的第一输出数据；从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有不同于所述第一光谱分布曲线的第二光谱分布曲线的第二校准光而产生的第二输出数据；将所述第一输出数据及所述第二输出数据与光谱指纹的数据库进行比较，每一光谱指纹与特定滤波特性相关联且具有与所述第一光谱分布曲线相关联的第一分量及与所述第二光谱分布曲线相关联的第二分量；通过以下方式来确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性：至少部分地通过使所述第一输出数据及所述第二输出数据分别与所述第一分量及所述第二分量相关而识别所述特定滤波特性。

在所述流式细胞术系统的一些其它或进一步此类实施例中，所述一或多个检测器可包含第一检测器，且所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而产生的第一输出数据；将所述第一输出数据与光谱指纹的数据库进行比较，每一光谱指纹与特定滤波特性相关联且具有与所述第一光谱分布曲线相关联的第一分量；及通过以下方式来确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性：至少部分地通过使所述第一输出数据分别与所述第一分量相关而识别所述特定滤波特性。

在所述流式细胞术系统的一些其它或进一步此类实施例中，所述一或多个检测器可包含第一检测器，且所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而产生的第一输出数据；从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有不同于所述第一光谱分布曲线且还与所述第一光谱分布曲线重叠的第二光谱分布曲线的第二校准光而产生的第二输出数据；通过确定所述第二输出数据与所述第一输出数据的比率而将所述第一输出数据与所述第二输出数据进行比较；及至少部分地通过将所述比率与和多个波长对应的所述第一光谱分布曲线与所述第二光谱分布曲线的强度比进行比较而确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性。

在所述流式细胞术系统的一些此类实施例中，所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有除所述第一光谱分布曲线及所述第二光谱分布曲线以外的光谱分布曲线的校准光的一或多个额外发出而产生的额外输出数据；及确定无任何所述额外输出数据指示由所述第一检测器对校准光的所述额外发出的任何检测。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述计算机可执行指令可进一步包含在由所述一或多个处理器执行时致使所述一或多个处理器进行以下操作的指令：将沿着所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性与相关联于所述光学路径的预定义滤波特性进行比较；及经由用户接口提供关于沿着所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性是否在相关联于所述光学路径的所述预定义滤波特性的阈值量内的指示。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述一或多个光学路径的不同子集可穿过每一光学滤波器元件。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述一或多个光学路径中的每一者可至少部分地由光纤界定。

在所述流式细胞术系统的一些此类实施例中，所述聚焦光学器件可包含经配置以将所述样本光及所述校准光聚焦到所述一或多个光纤的端上的物镜光学器件。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述一或多个光学路径中的每一者可穿过针孔光圈。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述校准光源可包含印刷电路板，所述印刷电路板具有穿过其的开口及放置在所述开口的外围周围的多个发光二极管(led)。在此类实施例中，所述多个led可经配置以发出所述校准光且所述一或多个光学路径可穿过所述开口。

在所述流式细胞术系统的一些实施例中，所述校准光源可经配置以发出经引导穿过所述样本位置且进入所述聚焦光学器件的校准光。

在一些实施例中，提供用于确定流式细胞术系统中的多个光学滤波器元件的滤波特性的方法。在此流式细胞术系统中，多个光学路径的不同子集可穿过所述光学滤波器元件中的每一者，且每一光学路径可将所发出或所散射样本光从样本位置引导到对应检测器。所述方法可包含：从校准光源发出不同光谱分布曲线的校准光，其中每一光谱分布曲线的校准光在不同波长下具有一或多个强度峰值；沿着所述光学路径中的每一者的至少一部分引导所述校准光中的一些校准光；在所述检测器中的每一者处针对每一不同光谱分布曲线的校准光测量光强度，其中所述检测器中的每一者产生指示到达所述检测器的所述校准光的所述所测量光强度的输出数据；及分析在由所述校准光源发出至少两个不同光谱分布曲线的校准光期间产生的来自所述检测器中的一者的所述输出数据以确定沿着对应于所述检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性。

在所述方法的一些实施例中，所述方法可进一步包含：致使所述校准光源在第一时间发出具有第一光谱分布曲线的第一校准光；响应于所述检测器在所述第一时间从所述校准光源接收到所述第一校准光而从所述检测器中的每一者获得第一输出数据；致使所述校准光源在所述第一时间之后的第二时间发出具有所述第一光谱分布曲线的第二校准光；响应于所述检测器在所述第二时间从所述校准光源接收到所述第二校准光而从所述检测器中的每一者获得第二输出数据；及将所述第二输出数据与所述第一输出数据进行比较以确定所述流式细胞术系统的光学性能是否已存在改变。

在所述方法的一些其它或额外实施例中，所述方法可进一步包含：从所述一或多个检测器中的第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而产生的第一输出数据；从所述第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有不同于所述第一光谱分布曲线的第二光谱分布曲线的第二校准光而产生的第二输出数据；将所述第一输出数据及所述第二输出数据与光谱指纹的数据库进行比较，每一光谱指纹与特定滤波特性相关联且具有与所述第一光谱分布曲线相关联的第一分量及与所述第二光谱分布曲线相关联的第二分量；及通过以下方式来确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性：至少部分地通过使所述第一输出数据及所述第二输出数据分别与所述第一分量及所述第二分量相关而识别所述特定滤波特性。

在所述方法的一些其它或额外实施例中，所述方法可进一步包含：从所述一或多个检测器中的第一检测器获得响应于由所述第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而产生的第一输出数据；将所述第一输出数据与光谱指纹的数据库进行比较，每一光谱指纹与特定滤波特性相关联且具有与所述第一光谱分布曲线相关联的第一分量；及通过以下方式来确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性：至少部分地通过使所述第一输出数据分别与所述第一分量相关而识别所述特定滤波特性。

在所述方法的一些其它或额外实施例中，所述方法可进一步包含：响应于由所述检测器中的第一检测器检测到具有第一光谱分布曲线的第一校准光而从所述第一检测器获得第一输出数据；响应于由所述第一检测器检测到具有不同于所述第一光谱分布曲线且还与所述第一光谱分布曲线重叠的第二光谱分布曲线的第二校准光而从所述第一检测器获得第二输出数据；通过确定所述第二输出数据与所述第一输出数据的比率而将所述第一输出数据与所述第二输出数据进行比较；及通过将所述比率与和多个波长对应的所述第一光谱分布曲线与所述第二光谱分布曲线的强度比进行比较而确定沿着对应于所述第一检测器的所述光学路径的所述光学滤波器元件的所述滤波特性。

在所述方法的一些其它或额外实施例中，所述方法可进一步包含：响应于由所述第一检测器检测到具有除所述第一光谱分布曲线及所述第二光谱分布曲线以外的光谱分布曲线的校准光的一或多个额外发出而从所述第一检测器获得额外输出数据；及确定无任何所述额外输出数据中指示由所述第一检测器对校准光的所述额外发出的任何检测。

附图说明

图1是流式细胞仪的实例性实施例的透视图。

图2是图解说明图1中所图解说明的流式细胞仪的实例性实施例的一部分的操作的示意性框图。

图3是在一个实施例中使用比色皿透镜及若干物镜将来自颗粒的侧向散射及荧光聚焦到光纤上的示意性图解说明。

图4是图解说明图1的流式细胞仪的实例性实施例的操作的一部分的另一框图。

图5是led板的实例性实施例的平面图。

图6是实例性led板的示意性表示，其中光纤的受光区域投射到所述led板上。

图7是图解说明根据一个实例性实施例的光纤的受光区域的示意图，所述受光区域相对于led的位置投射到led板上。

图8a是led光谱分布曲线的曲线图。

图8b是图7a的led光谱分布曲线中的仅一者的曲线图。

图8c是图7a的led光谱分布曲线中的另一者的曲线图。

图8d是使用图7a的led光谱分布曲线的光谱指纹的表。

图9是用于一个实例性实施例的处理硬件的示意性框图。

图10是用于一个实例性实施例的处理器的操作的流程图。

图11是流式细胞仪的又一实施例的示意性图示。

具体实施方式

图1是根据本发明的流式细胞仪的实施例的描绘。如所展示，流式细胞仪100为可容易地装配在桌面上的自足式单元。如图1中所图解说明，流式细胞仪100具有装载/卸载按钮104以使样本托盘102伸出及缩回，此允许插入将由流式细胞仪100测试的样本。

图2是图1中所图解说明的流式细胞仪的实施例的检测器部分的实例性光学布局的示意性框图。如图2中所展示，光学布局200包含比色皿204、物镜光学器件208、led板210、一系列光纤220及光谱分离器222、224、226、228、230。比色皿204具有致使将被探询的细胞或颗粒(在本申请案中，术语“颗粒”应被理解为是指颗粒、细胞或其它微观物项)流动穿过比色皿204的内部部分的管件201；此样本流体流还可经历流体动力聚焦以使将被探询的颗粒聚集到一或多个样本位置中。举例来说，流体动力聚焦可使样本朝向比色皿的中心线聚集或可使样本流动穿过小直径管。在此类实施例中，一或多个样本位置可沿着中心线或沿着管的中心线排列。当样本流动穿过一或多个样本位置时，来自一或多个样本照射源的光可用于照射或探询样本。举例来说，激光束202可被投射到样本位置上，例如，投射到比色皿204中，且因此照射或探询经由管件201递送到样本位置的颗粒。可用附接到荧光染料的各种标记来标记样本中的颗粒；这些荧光染料在被来自一或多个样本照射源的光照射时可以特定波长的光发荧光。同样地，一些样本照射光还可散射离开颗粒。附接到颗粒的荧光染料响应于被一或多个样本照射源探询或照射而发出的光及散射离开颗粒的样本照射光在本文中共同称为“样本光”。

流式细胞仪可包含可收集来自一或多个样本位置的样本光且可接着沿着一或多个光学路径(例如光纤220)引导所收集样本光的各种光学组件，例如球面透镜242及物镜光学器件208。在典型布置中，一或多个样本照射源可经定向使得样本照射光主要沿着与到达光学组件的样本光可遵循的方向正交的路径行进。此可阻止样本照射光具有到达光学组件及光学路径的直接路径，借此帮助确保由光学组件收集的光仅为样本光。应理解，一或多个样本照射源一般可为窄带光源，例如，激光或单色led，所述窄带光源发出与荧光染料可响应于用样本照射光来照射而发出的光波长不同的波长中的光。此允许将由荧光染料的荧光引起的样本光与由经散射样本照射光引起的样本光区分开，借此改进流式细胞术系统的准确度及性能。举例来说，可分析样本光中的经散射光以了解颗粒的形状或总体大小，然而样本光中的荧光可允许识别特定类型的颗粒。

如上所述，可沿着一或多个光学路径引导样本光。每一光学路径可将样本光(或其一部分)传送到不同检测器；因此，每一检测器可具有终止于所述检测器处的其自身的唯一光学路径。在一些实施例中，多个光学路径可共享一些共同组件。举例来说，在光学布局200中，每一光纤220导向单独光谱分离器222、224、226、228或230。这些光谱分离器中的每一者可在其内具有滤波器及/或分色镜集合，所述滤波器及/或分色镜集合将沿着光纤220中的每一者行进的样本光细分成多个分支，且每一此类分支可终止于光谱分离器内的单独检测器处。因此，导向特定光谱分离器的光纤220可被视为终止于所述光谱分离器内的检测器处的多个光学路径的共同元件。

当然，除使用光纤220以外，还存在将光发射到光谱分离器的其它方法及方式。举例来说，在一些流式细胞仪中，与棱镜一起使用针孔条带以在自由空间中使从不同针孔到不同滤波器/光电倍增管对的光弯曲。此替代方法在一些方面更简单，但在其它方面可更复杂。举例来说，所述替代方法可需要更大空间来实施，从而使此些单元更庞大。另外，可替代棱镜而使用其它类型的光学元件。如本文中所使用的术语“光学元件”应被理解为是指棱镜、镜、透镜或可引导光的其它光学装置。一般来说，使用光纤或自由空间传播技术一般可称为用于将光输送到光谱检测器或光输送装置的过程。一般来说，样本光可聚焦于某一种类的光学接收端口或元件(例如，光纤的端、针孔光圈等)上，所述光学接收端口或元件可用于将样本光引入到光学发射系统(例如，光纤、基于棱镜或镜的光学系统等)，所述光学发射系统将样本光传送到一或多个检测器。

流式细胞仪100的目的是识别被探询的颗粒的特定特性。如较早所述，附接到标记的荧光染料在被具有特定频率的样本照射源(例如，激光)探询时发荧光。多个标记及多个荧光染料可用于识别细胞的不同方面。在免疫学中，标记可包含接合到细胞上的特定抗原的抗体。举例来说，荧光染料可附接到经选择以接合到细胞上的特定抗原的特定抗体。由激光进行探询致使附接到抗体的荧光染料发荧光，此识别存在于细胞上的抗原。由流式细胞仪测量的荧光量为存在于细胞上的抗原数目的指示。可使用众多不同标记及荧光染料，且各种波长的激光可在若干个其它不同波长下引起荧光。举例来说，使用405纳米激光作为样本照射源可引起七个不同荧光响应，每一荧光响应来自在颗粒上或内侧的不同标记，所述七个不同荧光响应可由对应的七个不同滤波器及七个不同光电倍增管滤波且个别地检测。通常，这些滤波器为光学带通滤波器，且在一些实施例中使被递送到每一此类检测器的样本光被多次滤波可为常见的，其中这些滤波器中的一些滤波器同时对递送到不同检测器的光进行滤波。另外，当激光探询颗粒时还可发生侧向散射。侧向散射构成指示颗粒的形态的经散射光。

再次参考图2，由荧光及侧向散射206构成的样本光通过球面比色皿透镜242从比色皿204发出到物镜光学器件208(其可在本文中共同称为“聚焦光学器件”)中。物镜光学器件208可经配置以(例如)通过使样本光反射离开镜214而将荧光及侧向散射206(即，样本光)聚焦到光纤220的端上。光纤220接着可将样本光传送到光谱分离器以进行检测及分析。在所描绘的实施例中，且如下文关于图4更详细地论述，光谱分离器222、224、226、228及230可各自具有若干个分色镜(即，沿着一个方向引导一个光谱分布曲线的光同时沿着不同方向引导不同光谱分布曲线的光的分束镜)及/或光学滤波器元件，所述光学滤波器元件经布置以便允许到达每一光谱分离器内的每一检测器的样本光以不同方式经滤波。出于本发明的目的，术语“光学滤波器元件”应被理解为是指光学滤波器(即，仅准许特定光谱分布曲线的光穿过的介质)及分色镜(即，对一个光谱分布曲线的光为光学透明且对不同光谱分布曲线的光为光学反射的介质)两者。可用于流式细胞术系统中的一些常见光学滤波器元件的实例包含光学带通滤波器，例如具有525nm的中心波长及35nm的带宽(还称为滤波器的“半峰全宽”或“fwhm”)的光学带通滤波器、具有575nm的中心波长及15nm的带宽的光学带通滤波器、具有670nm的中心波长及30nm的带宽的光学带通滤波器及在50％的峰值透射下具有750nm的截止波长的光学长通滤波器。应理解，这些实例性滤波器仅仅为可使用的各种滤波器的代表性实例，且还可在流式细胞术系统中利用具有其它滤波特性的大量其它滤波器。还应理解，可替代球面比色皿透镜242及物镜光学器件208以及上文所论述的其它组件而使用其它特定类型的聚焦光学器件，以便提供聚焦光学器件的功能性，即，以便沿着样本光在去往检测器的路上遵循的光学路径引导样本光。

在如所描绘的实施例的系统中，沿着每一光学路径的光学滤波器元件中的一或多者可为可交换的或可重新配置的，借此允许每一光学路径的总体滤波特性为用户可调整的。此允许流式细胞仪容易地重新配置以视需要与不同标记及不同样本照射源一起工作。然而，本发明人还认识到，用户可重新配置光学滤波系统可(例如)因将错误光学滤波器元件放置在错误光学滤波器元件位置中而无意地错误配置。此可具有从特定检测器无意地筛选出所关注样本光因而导致错误否定的效应。或者，可无意地允许应被滤除的样本光穿过且到达检测器，因此产生错误肯定。本发明人设想出可在此类可重新配置滤波器元件系统中实施以阻止此类错误的滤波器测试与证实系统。

此滤波器测试与证实系统可利用校准光源，所述校准光源可经配置以独立地发出不同光谱分布曲线的校准光使得沿着光学路径(沿着其引导样本光)中的每一者的至少一部分引导所发出校准光。在图2的系统中，举例来说，校准光源采取led板210的形式，led板210具有穿过其的允许光学路径(及沿着光学路径引导的样本光)穿过led板210的开口。因此，可从物镜光学器件208发出的荧光及侧向散射218可行进穿过led板210中的开口211且由镜214反射到光纤220的端上。led板210可含有产生具有不同光谱分布曲线的光的若干个led，例如，所述若干个led中的一或多个led可产生主要在绿色光谱中的光，然而所述若干个led中的另外一或多个led可产生主要在红色光谱中的光。一般来说，校准光源中的led(或其它发光装置)可具有具明显显著的峰值波长的相对窄带宽，例如在100nm到150nm范围内。根据图8a中的一个实施例，图解说明实例性校准光源中的led的不同峰值频率及带宽的实例性光谱。如可见，展示10个不同光谱分布曲线702、704、706、708、710、712、714、716、718及720。每一光谱分布曲线具有明显显著的峰值及大约为大致100nm到150nm的带宽。举例来说，光谱分布曲线702代表发出主要在紫色光谱中的光的led，光谱分布曲线704及706代表发出主要在蓝色光谱的相对端处的光的led，光谱分布曲线708代表发出主要在绿色光谱中的光的led，光谱分布曲线710代表发出主要在黄橙色光谱中的光的led，光谱分布曲线712、714及716代表发出主要在红色光谱中的光的led，且光谱分布曲线718及720代表发出主要在红外光谱中的光的led。可使与这十个光谱分布曲线中的每一者相关联的led单独照射，借此允许发出与将孤立地发出的每一单独光谱分布曲线对应的校准光。在一些实施例中，可使针对光谱分布曲线的子集的led同时照射，例如，可使产生光谱分布曲线702及704的led同时照射以产生具有为光谱分布曲线702及704的组合的光谱分布曲线的校准光(在此些情形中，经组合光谱分布曲线将为不同形状，因为光谱分布曲线的重叠部分可加性地组合)。

因此，在图2的所描绘实例性实施例中，led212中的每一者可产生窄带光学信号，所述窄带光学信号还由镜214反射到光纤220的开口上，借此致使所发出校准光沿着样本光所遵循的光学路径的至少一部分经引导。led212的目的是检查且验证光谱分离器222、224、226、228、230的操作。可使led212个别地或共同闪光，以便检查光谱分离器222到230的操作。光谱分离器222到230中的每一者产生输出数据232、234、236、238、240。由于led212中的每一者具有为单独光学频率的特定频带，因此可检查且验证光谱分离器222到230，如下文更详细地论述。

图3是图解说明荧光及侧向散射在光纤220的端上的聚焦的示意性侧视图。如图3中所图解说明，激光束202探询在比色皿204中及经由管件201递送到比色皿204(应理解，管件201不穿过比色皿，但单独管件201附接到比色皿的任一端；比色皿自身可为将样本约束到特定位置以由样本光源照射的光学透明器皿)的样本(其中激光束横越样本路径的每一位置(例如，比色皿)可被视为“样本位置”)中的颗粒。响应于激光探询而从每一样本位置处的颗粒发出的荧光及侧向散射光由球面比色皿透镜242收集。球面比色皿透镜242与物镜光学器件208一起将荧光及侧向散射光聚焦在光纤220的端上。在此实例中，聚焦点位于如由光纤220的开口的位置所图解说明的弯曲焦平面244上。当然，还可取决于流式细胞仪的特定配置而使用其它光学配置。

图4是图2中所图解说明的实施例的更详细视图。根据图4，激光束202进入比色皿204且探询经由管件201递送的颗粒。来自在比色皿204中经探询的颗粒的荧光及侧向散射发出206发射到物镜光学器件208。在此实例中，物镜光学器件208产生荧光及侧向散射的五个光束、射线或图像，其聚焦在光纤220的开口上，从而将样本位置的图像有效地投射到光纤的端上。在此实例性实施例中，存在五个激光束202，其中的每一者在比色皿中的五个不同样本位置(未展示)中的一者处与样本相交。存在于这五个单独样本位置中的每一者处的颗粒可取决于存在于样本中的标记及每一激光束202的特性而以不同方式发荧光。因此，可形成五个相异光学路径，每一光学路径具有主要从所述样本位置中的不同样本位置发出的光。镜214将荧光及侧向散射光束、射线或图像218从每一样本位置引导到光纤220的对应端上。led板210具有五个荧光及侧向散射光束、射线或图像218通过其发射的开口。led板210还具有产生各种led光谱输出216的一组led212。在此情形中，由于led一般具有角度功率分布模式，例如，从led发出的光通常在led的中心线附近具有最高强度且随着光发出方向与中心线之间的角度增加而下降，因此led紧密接近于开口的边缘允许led令人满意地照射光纤的端，借此允许校准光以充足效率耦合到光纤中以用于递送到检测器，例如，光电倍增管(pmt)235，且因此用于进行检测。尽管可替代led使用其它类型的发光装置(例如，激光)，但此些其它类型的发光装置可需要使用额外光学组件以便沿着光学路径引导校准光。应理解，在各种实施例中可使用更小或更大数目个样本照射源(例如，激光)。

以角度功率分布模式从led212发射的led光谱输出216可由镜214反射到光纤220的端上。光纤接着可将led光谱输出216以及荧光及侧向散射218(尽管通常并非同时地，因为校准光可干扰样本光)传送到五个不同光谱分离器222、224、226、228及230。在此实例性实施例中，光谱分离器222到230中的每一者可具有高达八个不同用户可替换光学滤波器，例如光学滤波器233，其中的每一者可放置在pmt235中的一者前面。光学滤波器(例如光学滤波器233)为用户可替换的，使得用户可配置光谱分离器222到230以用于各种不同分析。由于在此实施例中每一光谱分离器可具有为用户可替换的高达八个不同光学滤波器233，因此可能够重新配置的流式细胞仪100中总共存在多达40个不同光学滤波器。在如稍后所论述的一些实施例中，还可存在光谱分离器中所使用的也可为用户可替换的分色镜，可存在也可能够被替换的额外光学滤波器元件(例如分色镜)，从而致使此光谱分离器在图4的所描绘系统中具有不止40个用户可改变光学滤波器元件。应理解，其它实施例可以更多或更少光谱分离器以及与图4中所展示不同的数目个用户可替换光学滤波器及检测器或pmt235为特征。本发明不限于使用任何特定数目个光谱分离器及/或检测器及/或光学滤波器的流式细胞术系统。

如果使用不正确光学滤波器，或如果光学滤波器被更换且未对其替换进行记录，那么可在扫描颗粒时出现错误肯定及/或错误否定。另外，扫描的重复性也可为有益的。举例来说，如果日复一日地运行一个特定实验，那么期望具有重复性。为了所述目的，如稍后所论述，可每天(或其它规律时间间隔)以相同设定操作校准光源且可检查检测器响应以查看是否已存在检测器性能的任何降级。校准光源(例如，led板210上的led212)可用于检查pmt235的响应，而且用于检查光谱分离器222到230中的正确滤波器的使用。下文关于图8a到8c更详细地阐释可使用校准光源检查光学滤波器的方式。其它用途包含支持仪器故障检修、具有使仪器间性能标准化的光谱参考及具有将检测器输出值转化成定量光检测值的光谱参考。可通过使led输出的强度变化而进一步增强这些用途。再次参考图4的实例性实施例，光谱分离器222包含多个分色镜，例如分色镜237。如图4的实例性系统中所展示，七个分色镜237在每一光谱分离器222到230中。分色镜237反射具有某些光学频率的光且透射具有其它光学频率的光，因此用作分束器及光学滤波装置两者。以此方式，每一光谱分离器222到230中的七个不同分色镜237按光谱频率划分从将样本或校准光递送到所述光谱分离器的光纤发射的光且将经分开光发射到八个不同光学滤波器，例如光学滤波器233。应理解，在所描绘实施例中，样本或校准光在其经过每一光学路径时经历的滤波可包含四个单独滤波阶段—由于分色镜而发生的三个滤波操作及由于光学滤波器233而发生的最后滤波操作。应理解，还可使用其它类型的分束装置，例如，不具有二色效应的分束器—在此类例子中，光学滤波器233可为沿着光学路径的用于对到达检测器/pmt的样本或校准光进行滤波的仅光学滤波装置。在其中使用分色镜的一些例子中，所有分色镜可为“固定的”，即，并非用户可替换的。在其它例子中，分色镜中的所有或至少一些分色镜可为用户可替换的，其中剩余分色镜(如果存在)为固定的。

还如图4中所图解说明，安置多个光电倍增管(例如pmt234)以检测通过光学滤波器(例如光学滤波器233)透射的光。光学滤波器233可为仅透射在特定频率范围内的光的带通、长通或短通滤波器。以此方式，pmt235检测来自细胞的在光学滤波器233的特定频率范围内的荧光或侧向散射(对于每一pmt235及对应光学滤波器都是这样—每一pmt235及对应光学滤波器可以不同方式经配置以检测的光不同波长或频率)。由pmt235检测到的光的存在及强度提供关于已被探询的颗粒的特性的信息。以此方式，可检测荧光及侧向散射的众多不同频率以识别颗粒的这些特性。

如较早所述，单个样本照射源(例如激光束202中的一者)可产生众多荧光发出。在图4中所给出的实例中，五个不同激光束用作样本照射源；这些样本照射源在比色皿204的输出处产生五个荧光及侧向散射发出206；这五个荧光及侧向散射发出206穿过物镜光学器件208，从而作为聚焦在光纤220的端上的五个荧光及侧向散射光束、射线或图像218而离开。这些光束、射线或图像(例如荧光及侧向散射光束、射线或图像219)中的每一者可含有由在样本中所使用的荧光染料的若干个不同光谱响应产生的光。举例来说，405纳米激光可产生高达七个不同荧光响应及一个侧向散射响应。如果来自405纳米激光的荧光及侧向散射光束、射线或图像219聚焦在光纤221的端上，那么光束219、射线或图像由光纤221发射到光谱分离器222。可使用分色镜(例如分色镜237)按频率划分八个不同光谱响应中的每一者，且接着可由邻近于对应光电倍增管安置的单独光学滤波器对所述光谱响应中的每一者进行滤波。由于存在八个光电倍增管及八个光学滤波器，因此可在光谱分离器222中检测由405纳米激光进行的探询产生的光谱响应中的每一者。还以类似方式设置光谱分离器224、226、228及230以检测高达八个光谱响应，例如，由具有不同波长的样本照射源触发及/或源自其它荧光染料的光谱响应。当然，取决于预期光谱响应及流式细胞仪中为分色镜、光学滤波器及光电倍增管的布局分配的空间，可在光谱分离器222到230中的任一者中使用更多或更少检测器。如较早暗示，替代分色镜，还可使用其它构件(例如折射棱镜、衍射光栅或全息元件)将样本或校准光分开。

图5是led板400的布局的示意性图解说明。如图5中所图解说明，led板210具有允许荧光及侧向散射的光束、射线或图像(例如荧光及侧向散射218的五个单独光束、射线或图像)通过led板210发射的开口402。在此实例中，五个荧光及侧向散射光束、射线或图像218通过开口402投射，如图5中所图解说明。在此特定实例中，荧光及侧向散射光束、射线或图像218的间隔产生光束、射线或图像218的线性阵列，所述线性阵列致使开口402的形状为长圆形，如图5中所图解说明—取决于特定流式细胞仪中的光束、射线或图像218的布置，开口402可为不同形状。还如图5中所图解说明，存在在开口402的外围周围附接到led板210的多个led404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430。在此实例中，led404到430发出对应于图8a中所图解说明的光谱输出的十个不同光谱输出。led404、406、408、410、412、414、416、426、428及430全部具有彼此不同的光谱输出。在led板210的底部部分上重复led404、406、408、410。经重复led分别为led424、422、420、418。在此实例中在led板的顶部及底部上重复这些led的原因为光纤的端中的一些端的受光或捕获区域并非足够大的而不能捕获从led404、406、408、410、412、414、416、426、428及430中的一些led发出的光。关于图6及7更详细地阐释此。

如图5中所展示，开口402相对于环绕开口402的外围部分的led404到430居中地定位。led板210可为印刷电路板，所述印刷电路板可经设计以沿着光学路径安装且固定在物镜光学器件208的输出处。如此，led板不阻碍样本光且因此当在对校准光与样本光的测量之间切换时不需要led板的移动。将led板210安装在荧光及侧向散射光束、射线或图像218的光学路径中的目的是使得led404到430可将光学辐射投射到光纤220的端上，借此沿着相同光学路径的至少一部分引导从led404到430发出的校准光。

如较早所述，led404到430通常可发出具有角度功率分布的光。led402到430中的每一者的发出角度(例如，总角度，在所述总角度内所发出光的光强度为led的峰值光强度值的50％或更高)可变化，但典型发出角度(举例来说)可为120°。如此，从led投射到光纤220的端上的光的量值(例如，强度)可基本上小于从led中的每一者输出的光的总量值。然而，如下文更详细地阐释，来自led中的每一者的投射到光纤220的端上的光量值可在与投射到光纤220的端上的荧光及侧向散射光束、射线或图像218的光量值相同的光量值范围内，例如，大约数百微瓦到数十皮瓦。如此，不必须变更光电倍增管的操作范围以检测荧光及侧向散射光束、射线或图像218或来自led404到430的校准光/光谱信号。

图6是led板210的示意性图解说明，其中光纤的各种捕获区域或受光区域投射到led板210上。每一光纤的捕获或受光区域表示在其内来自led板210的光可朝向光纤的端发出且仍由光纤“捕获”(即，由光纤发射)的区域。如果入射光射线与光纤端处的光纤中心线之间的角度太大，那么所述光射线将被光纤拒斥且不被光纤导引。因此，每一光纤的受光或捕获区域表示在其内光可以在光纤端的受光角度内的角度发出且还仍与光纤端相交的区域。考虑受光区域的另一方式是将其视为光纤端的投射区域，即，如果光将通过光纤端从光纤发出，那么受光区域将为led板上的被所述光照射的区域—此经投射光将形成由光纤端的受光角度限定的圆锥形投射体积。

如图6中所展示，开口508存在于led板210中以允许荧光及侧向散射光束、射线或图像218通过led板210中的开口508发射。受光区域502及受光区域506表示光纤束220中的外部两个光纤的受光区域。举例来说，受光区域502可对应于光纤221的投射到led板上的受光角度。类似地，受光区域506可对应于光纤223的投射到led板210上的受光角度。受光区域504可对应于光纤225(其为中心光纤)的受光角度的投射。在那方面，led在受光区域502、504、506内的放置将确保光学辐射从所述led发射到对应光纤中。

图7是放置在led板210上的led404到430的图解说明，其中三个受光区域502、504及506投射到led板210上。假定受光区域502对应于光纤221，从led404到416及426到430发出的校准光可由光纤221捕获。假定受光区域506对应于光纤223，来自led412到430的校准光可由光纤223捕获。类似地，从led412、414、416及426、428、430发出的校准光可由所有不同光纤电缆220捕获。为确保从led404、406、408及410发出的波长的校准光也在所有光纤中经捕获，在led板210的底部处将这些led分别重复为led418到424。当接通led404到410中的任一者，例如，使其闪光(仅需要短照射持续时间，尽管还可视需要执行较长照射)时，还分别接通led418到424的对应led，使得所有光纤同时接收相同波长的校准光。可通过知晓led中的每一者的特性计算从led发射到光纤220的端中的功率量。举例来说，产生250mw的光能量的led可用作第一实例，其中此能量的75％在定中心于led的中心轴线(垂直于led板，举例来说)上的60°锥(120°总锥角)内。在led与光纤的端之间的125mm的距离下，锥具有216.5mm半径且覆盖147,262mm²的面积。如果光纤具有1.5mm的端直径，那么光纤的开口的面积为1.77mm²。通过在距led为与光纤端相同的偏移距离处将在所关注锥内发出的光能量的总功率除以归属于所关注锥内的面积，且接着将所述结果乘以光纤端的面积，可计算投射到光纤端上的光量。在此实例中，1.77mm²*(0.75*250mw/147,262mm²)＝大致0.0023mw＝大致2.3μw。在此实例中且在以下实例中，假定照射场在照射锥内为均匀的，尽管在实际应用中，照射可随距照射区域中心的距离而变化。可(举例来说)通过以下方式获得递送到每一光纤的光量的更准确确定：计算投射到环状环(在距led为与光纤相同的距离处)中的光量，所述环状环具有等于光纤直径的厚度及由从光纤到照射场的中心的距离定义的半径；及接着使用所述值乘以光纤的横截面积除以环状环的面积。作为另一实例，可使用2.5mwled，其中其能量的75％在15°锥(30°总锥角)内。在led与光纤的端之间的125mm的间隔下，锥的经照射区具有33.5mm的半径及3524mm²的经照射面积。再次，假定光纤具有1.77mm²的开口，发射到光纤的开口中的光量为1.77mm²*(0.75*2.5mw/3524mm²)＝发射到光纤的端中的大致1μw的功率。作为另一实例，5.5mwled使其能量的75％在35°锥(70°总锥角)内。在led与光纤的端之间的125mm的距离下，由锥照射的区域具有87.5mm半径及24,067mm²的面积。发射到光纤的端的光能量可经计算为1.77mm²*(0.75*5.5mw/24,067mm²)＝0.00030mw＝0.3μw。聚焦在此实例性流式细胞仪中的光纤220的端上的荧光及侧向散射光束、射线或图像可在光纤220的端上具有在大致1到3微瓦或更少的范围内的入射功率。因此，不必须被变更光电倍增管的响应，因为入射光学输入功率针对校准光源及经聚焦荧光及侧向散射光束、射线或图像两者在相同范围内。

在一些实施例中，校准光源可包含大量超窄带(例如，大约1到2nm带宽)光源，例如，激光。每一此光源可用于在不同超窄带波长下测试光学滤波器路径，借此允许以几纳米或更少的准确度发展沿着每一光学滤波器路径的滤波器的特性。然而，如果经设计以覆盖大工作范围的可能光学滤波器，那么此些实施例可为相当昂贵的。举例来说，(例如)针对从350nm到900nm的光学滤波器覆盖550nm的范围可需要250到550个不同光源及相关联控制硬件。

在替代实施例中，校准光源中的此些超窄带光源可被具有较大发出带宽的光源(例如，具有大约数十纳米到介于100纳米与200纳米之间的带宽的led)替换。此些实施例可更具成本效益，因为可使用更小数目个且不那么昂贵的光源，例如，可使用10个led来确定在光的350nm到900nm范围内的滤波特性。在以下章节中更详细地论述此实施例。

图8a是led404到430的十个不同光谱输出或分布曲线的曲线图。如图8a中所展示，led输出的光谱为从大致350纳米到900纳米。十个不同光谱输出或分布曲线包含光谱分布曲线702、704、706、708、710、712、714、716、718及720。光谱分布曲线702到720具有从大约150nm变化到大约30nm的不同光谱范围。在峰值输出功率下，光谱分布曲线介于从大约40nm的带宽到大约10nm的带宽的范围内。这些光谱分布曲线为可构成窄带光学频率的光谱分布曲线的实例，尽管可使用各种不同光谱分布曲线。十个不同光谱信号702到720允许流式细胞仪确定在图4中所展示的各种位置中的光学滤波器的光学或滤波特性(如本文中所使用，“特性”、“光学滤波特性”、“光学特性”及“滤波特性”全部用于是指管理一或若干光学滤波器元件的滤波性能的所述一或若干光学滤波器元件的光学性质—其可是指滤波器元件的特定中心波长或滤波器元件可透射的更宽波长集合)。举例来说，如果使用具有620nm的中心波长722的光学带通滤波器，那么接收穿过此光学滤波器的光的检测器应在使具有光谱分布曲线710的(若干)led照射(且其它led为黑暗的)时产生输出信号且在使具有光谱分布曲线712的(若干)led照射(且其它led为黑暗的)时产生稍微较大输出信号。这是因为具有光谱分布曲线712的(若干)led在620nm波长下发出比具有光谱分布曲线710的(若干)led稍微多的光。在此实例中，来自光谱信号710的一些响应的存在辅助识别光学滤波器的频率或波长。举例来说，如果在使具有光谱分布曲线710的(若干)led照射时检测器检测到光，那么此信息指示不论安装什么光学滤波器都透射具有归属于光谱分布曲线710内的波长的光。在一些例子中，校准光源可经配置以发出已知强度的校准光。在此类例子中，如果所发出校准光的强度为已知的，那么由检测器响应于此校准光发出而检测到的校准光量可用于进一步识别光学滤波器的光学特性。举例来说，如果检测器寄存从具有光谱分布曲线710的(若干)led发出的所检测校准光的振幅或强度为大致11(基于图8a中所使用的无单位比例尺—参见图8b)，那么仅存在由产生此振幅的此些led发出的两个光波长—大致570nm及大致620nm。然而，通过使对应于其它光谱分布曲线的其它led照射，可获得准许上述光学滤波器的更确切表征的进一步信息。举例来说，如果使产生光谱分布曲线702、704、706、714、716、718及720的led单独地或组合地照射，那么从所述led发出的光将不穿过具有620nm的中心波长的光学滤波器(假定此滤波器的总体带宽为相对窄的，例如，不多于±10nm)。此外，如果使产生光谱分布曲线712的(若干)led照射(其中其它led为黑暗的)，那么检测器可(举例来说)指示大致21的所测量光振幅(参见图8c)。通过比较两个相邻/重叠光谱分布曲线的所检测光振幅的比率，可做出关于哪一中心波长与所计算比率对应的确定。举例来说，仅存在一个光学滤波器中心波长—中心波长722(620nm)，在所述中心波长下来自产生光谱分布曲线710的(若干)led的到达检测器的光将具有来自产生光谱分布曲线712的(若干)led的到达检测器的光的振幅的大致二分之一。可将这些比率与每一波长的预期比率的查找表进行比较(每一比率因此将与特定波长且与由校准照射源在每次发出校准光时所发出的产生促成所述比率的所测量校准光振幅的光谱分布曲线相关联)。

或者，每一光学滤波器元件(或每一光学滤波特性)可具有与以光谱分布曲线中的每一者发出的校准光相关联的预期所测量量值的“指纹”。通过将每一光谱分布曲线的校准光的所测量振幅与此些指纹的数据库进行比较，可做出关于所测量振幅是否对应于特定光学滤波器元件指纹的确定，借此允许光学滤波器元件经表征及识别。应理解，可通过使用容差或计及测量误差及可影响所测量值的其它因素的可能性的其它机制来促进比率或振幅与来自查找表或其它数据源的数据的匹配。相同指纹识别技术还可应用于布置成光学系列的一组多个光学滤波器元件，其中指纹代表所述组多个光学滤波器元件的累积滤波特性。在其中使用具有超窄带光谱分布曲线的光源的实施例中，具有特定光学滤波特性与单个光谱分布曲线之间的一对一匹配可为可能的，在所述情形中如果存在响应于所述光谱分布曲线的校准光而来自检测器的任何输出信号那么可确定光学滤波特性。在一些进一步此类实施例中，沿着特定光学路径的光学滤波器元件的滤波特性可具有比针对校准光源所使用的在光学滤波器元件的中心频率附近的光谱分布曲线的带宽宽的带宽。在此些情形中，情形可为，校准光源可能够发出的光谱分布曲线中的数个光谱分布曲线可致使针对所述光学路径的检测器检测所发出的校准光。因此，举例来说，检测器可响应于以数个不同光谱分布曲线独立地发出校准光而检测相同量值的所检测校准光。在此些情形中，可难以确定这些光谱分布曲线中的哪些光谱分布曲线最能够代表所述光学路径的光学滤波特性，因为可存在多个候选者，所有所述候选者可产生来自检测器的类似输出信号。在一些此类实施例中，所有光谱分布曲线(校准光以其产生输出信号的某一最小阈值电平)可经识别且用于表征所述光学路径的光学滤波特性。举例来说，如果七个邻近光谱分布曲线的校准光全部独立地产生来自检测器的类似输出信号，那么与中心光谱分布曲线(例如，在此实例中为七个光谱分布曲线中的第四光谱分布曲线)相关联的波长可经识别为沿着所述光学路径的(若干)光学滤波器元件的中心波长。如果存在偶数数目个此类光谱分布曲线，那么中心波长可为两个最中心光谱分布曲线的平均值。

举例来说，图8d是使用图7a的led光谱分布曲线的光谱指纹的表。在此实例中，所述表包含以10nm间隔跨越400nm到850nm的光谱的光谱指纹。每一行表示与不同波长对应的光谱指纹。每一列列示针对校准光的不同光谱分布曲线在所述不同波长中的每一者下的所测量光强度。举例来说，如果致使校准光源单独发出光谱分布曲线702到720中的每一者，且检测器处的所测量光量值或强度针对光谱分布曲线706为14，针对光谱分布曲线708为64，且针对所有其它光谱分布曲线为0，那么此可指示导向所述检测器的光学路径的滤波特性与540nm滤波器的滤波特性对应，540nm滤波器具有其中光谱分布曲线706产生15的量值、光谱分布曲线708产生68的量值且其它光谱分布曲线产生0的量值的指纹。如可见，针对特定波长的理想指纹与所测量之间的可存在某种程度的不匹配(举例来说，在光谱分布曲线706处，所测量强度14与指纹强度15相比较)。可通过此项技术中已知的各种技术(例如，使用容差带、内插、模式匹配技术等)中的任一者来适应此些微小变化。如较早所论述，上文所论述的比率概念也可实施为查找表的一部分；此可实际上类似于指纹识别技术，但可允许可变检测器灵敏度。举例来说，两个检测器可具有对光的不同灵敏度，例如，一个检测器可不在峰值性能下执行且因此可低估到达其的光量。为了适应此检测器灵敏度，可基于邻接光谱分布曲线中的光量值而将所检测光的绝对量值转换成相对量值，非常像上文关于比率的使用所论述。此实际上可使检测器响应正规化，使得检测器灵敏度不导致所检测光强度与预期光强度之间的不匹配。

举例来说，如果在先前实例中检测器将到达检测器的光的量值低估50％，那么所测量光量值将针对光谱分布曲线706为7，针对光谱分布曲线708为32，且当然，针对剩余光谱分布曲线仍为0。然而，这些所测量光量值将不与如图8d的指纹表中所列示的预期光量值中的任一者良好地相关。最接近的将为550nm的指纹，所述指纹具有在光谱分布曲线706处为8且在光谱分布曲线708处为44的预期光量值。尤其对于光谱分布曲线708，32的值比44的预期值低30％。

在一些实施方案中，可通过使用邻接光谱分布曲线的所测量光量值的比率来解决此些问题。举例来说，光谱分布曲线706的所测量光量值与光谱分布曲线708的所测量光量值的比率为7:32，其等于0.22。如果将所述比率与基于所述两个光谱分布曲线的预期光量值的对应比率进行比较，那么可看到，可容易地识别出540nm的恰当波长而不管所检测的减小光量值。举例来说，针对540nm波长的在光谱分布曲线706处的预期光量值与在光谱分布曲线708的预期光量值的比率为15:68，其还等于0.22。相比之下，针对550nm波长的在光谱分布曲线706处的预期光量值与光谱分布曲线708的预期光量值的比率为8:44，其等于0.18，且针对530nm波长的在光谱分布曲线706处的预期光量值与光谱分布曲线708的预期光量值的比率为30:97，其为0.31。因此，即使在检测器正以未知效率水平操作时此正规化也可允许沿着光学路径的光学滤波器元件的光学特性的准确确定。应理解，还可使用用于将响应于发出来自光谱分布曲线中的每一者的光而检测到的所测量光与光谱指纹匹配的各种其它技术，且所述各种其它技术被视为在本发明的范围内。本文中所论述的实例为代表性实例且不应被视为限制性的。

还应理解，虽然本文中所论述的实例已集中于一般仅与一个或两个紧接地相邻的光谱分布曲线重叠的光谱分布曲线，但可使用更大数目个重叠光谱分布曲线(例如，在一侧或两侧上与一个以上其它光谱分布曲线重叠的光谱分布曲线)来实践相同技术。在此些情形中，存在更进一步数据点，用所述数据点填入光谱指纹且将所测量光量值与所述数据点进行比较。

另外，在本文中所论述的实例中，一般已假定光学滤波特性为(例如)紧紧地约束到单个中心波长的窄带光学滤波器的光学滤波特性。然而，相同技术一般可用于识别其它类型的光学滤波特性，例如与较宽带滤波器相关联的光学滤波特性。

应理解，校准光源应最低限度地包含例如led或激光的光源，所述光源可经控制以独立地发出不同光谱分布曲线的校准光，即，可在若干个不同光谱分布曲线之间切换由校准光源发出的校准光。在以发出大量光谱分布曲线的能力为特征的实施例(例如，较早论述的超窄带实施例)中，光谱分布曲线可为非重叠的或仅重叠最少量，例如，跨越其基宽的小于10％。

在以较宽光谱分布曲线(例如，图8a中所描绘的光谱分布曲线)为特征的实施例中，每一光谱分布曲线可经选择以与一或若干相邻光谱分布曲线重叠，使得(举例来说)仅存在由响应于孤立地提供所有光谱分布曲线而产生的检测器输出唯一地识别的一个波长。举例来说，图8a中的光谱分布曲线中的每一者具有稍微高斯形状，且具有这些光谱分布曲线中的一者的校准光的给定所测量光振幅可在除最大振幅以外的位置中与两个可能波长对应—一个波长在分布的“上坡”上且另一波长在分布的“下坡”上。由于光谱分布曲线重叠，因此针对一个或两个相邻光谱分布曲线的校准光的所测量振幅可用于确定“上坡”还是“下坡”波长为正确波长。应理解，在一些情形中可存在给定光谱分布曲线的不与相邻光谱分布曲线重叠的部分(举例来说，参见光谱分布曲线714及718，其具有不与相邻光谱分布曲线重叠的部分)。如果非重叠部分不具有与相同振幅对应的多个数据点，那么此些光谱分布曲线仍然可允许光学滤波器的特性的准确表征。举例来说，在图8a中，光谱分布曲线714贯穿光谱分布曲线714的整个“上坡”部分(在最大振幅左边的部分)与光谱分布曲线712重叠。如果响应于发出具有光谱分布曲线714的校准光而检测到20的所测量校准光振幅，那么存在经表征的光学滤波器的两个可能波长：～610nm及～700nm。如果接着致使校准光源发出具有光谱分布曲线712及716的校准光，且此校准光发出两者均不产生任何可测量光振幅，那么可消除610nm波长作为候选者，因为如果光学滤波器可透射610nm光那么光谱分布曲线712将已产生可测量光振幅。

为促进论述，以上分析及实例利用其中每个led发出相同最大振幅的光而不管所述最大振幅的光的波长的校准光源。应理解，光谱响不需要具有均匀最大振幅—校准光源的不同光源可发出具有不同最大振幅的不同光谱分布曲线。如果在确定光学滤波器特性中所使用的光谱分布曲线(或光谱分布曲线信息)代表实际所发出校准光，那么基于此光谱分布曲线数据而做出的关于光学滤波器特性的确定仍然可为准确的。还应理解，如果存在用于产生特定光谱分布曲线的多个led那么可需要进行校正—举例来说，如果两个led用于产生特定光谱分布曲线的校准光，但光纤端的仅恰当子集从两个led接收光(其中剩余光纤端仅从一个led接收校准光)，那么所检测光的振幅可在一些检测器处与其它检测器相比较被人为地减半(或加倍)。在此些情形中，可使与所述特定光谱分布曲线相关联的led单独照射(使得接收校准光的任何检测器处的振幅与在任何其它检测器处所接收的光相比较不被“加倍”或“减半”)。或者，所检测振幅可在必要时被减半或加倍，以便使信号符合用作参考的光谱分布曲线。举例来说，如果光谱分布曲线各自针对单个led经规定，且特定检测器从两个此类led接收光，那么指示量值的输出信号可被减半以便将信号正规化到光谱分布曲线的比例尺。来自不从两个led接收光的检测器的输出信号可被单独留下。将认识到，存在计及此类可能错误的多个其它方式，所有这些方式被视为在本发明的范围内。

在一些例子中，以上技术可不能够确定特定滤波器的光学特性，但可替代地用于确定作为整体的多个光学滤波器的光学特性—借此允许确定作为整体的光学滤波器是否恰当地配置。举例来说，如果两个滤波器串联布置，每一滤波器具有不同中心波长，那么校准光源可仅能够确定两个滤波器的经组合光学特性—所述技术无法用于确定两个光学滤波器中的哪一者是哪一者。如果沿着特定光学路径仅存在一个光学滤波器，那么当然可使用以上技术来肯定地表征所述特定滤波器。

可基于已发布数据(例如，制造商提供的光谱分布曲线数据)或凭经验确定校准光源的光谱分布曲线。举例来说，在一些实施方案中，可将流式细胞仪放置到基线模式中，其中检测器可用于使用沿着所述检测器的光学路径的已知光学滤波器元件或光学滤波器元件集合检测以所述光谱分布曲线中的每一者发出的校准光。与每一光谱分布曲线相关联的所检测到光量值读数接着可经记录且用作所述已知光学滤波器元件或光学滤波器元件集合的光学特性的“指纹”。通常存在与流式细胞仪一起使用的仅设定数目个光学滤波器元件，因此可能需要检测的可能滤波特性群体可为有限的；这些可能滤波特性可被视为给定流式细胞仪系统的所关注光学特性。一旦所有所关注光学特性已被指纹化，那么在一些实施例中可跳过进一步指纹识别，因为在正常使用期间非常不可能遇到此些进一步光学特性(通常在配置流式细胞仪中遇到的错误为其中流式细胞仪的光学滤波器元件的现有群集以某种方式不正确地配置在流式细胞仪内的错误，而非其中来自某一件其它装备的劣等滤波器元件以某种方式进入流式细胞仪光学路径配置的情景)。从实用立场来看，仅仅能够识别滤波器元件配置何时具有与预期光学特性中的一者对应的光学特性可为足够的—如果所测量光量值使得不能够进行与预期光学特性的指纹的匹配，那么此可指示滤波配置(无论其可为什么样)是不正确的。在此些情形中，校准系统可将警告仅提供给用户以指示存在光学滤波配置错误，而不具有是什么错误的任何进一步指明(除假定存在被测试的多个光学路径的情况下指示哪一光学路径具有错误以外)。在一些其它实施方案中，系统还可识别错误的本质，例如，可将在上述光学路径应具有与一或多个特定波长对应的光学滤波特性时指示上述光学路径具有与另外一或若干特定波长对应的光学滤波特性的通知提供给用户。当然，在一些实施例中，不预期在流式细胞仪的正常使用中遇到的光学滤波特性的指纹也可包含于指纹数据库中；在此类实施例中，在光学路径的错误配置的情形中给用户的通知也可包含关于所述光学路径的与匹配指纹对应的光学特性的信息。

图9是可与本文中所揭示的其它实施例一起利用的处理硬件900的实施例的示意性框图。如图9中所图解说明，利用总线902作为处理硬件900的支柱。用户接口904允许用户操作且控制处理硬件900的各种功能。来自光电倍增管(其经示意性地图解说明为光电倍增管912、914)的数据发射到输入/输出装置，例如i/o916及i/o918。此数据接着沿着总线902经发射且存储于ram908及/或存储器910中。处理器906执行各种处理功能，如图10中所图解说明，例如将先前数据与当前数据进行比较，将当前数据与所计算数据进行比较，且将当前数据与经验数据进行比较。还可由处理器906执行其它功能。这些数据比较的结果可提供到用户接口904。用户接口904还可用于控制示意性地展示为pmt912及pmt914的光电倍增管的灵敏度(还可存在额外pmt及i/o装置，但未展示这些额外pmt及i/o装置)。

图10是图解说明处理器906的功能中的至少一些功能的示意性流程图1000。如图10中所图解说明，处理器可在步骤1002处开始操作。在步骤1004处，处理器可任选地检查以确保流式细胞仪中的激光或其它样本照射源关断。在步骤1006处，可使校准光源照射。可使校准光源照射以产生校准光源能够取决于所期望或支持的测试而产生的一个光谱分布曲线、光谱分布曲线子集或所有光谱分布曲线的光。举例来说，如果期望光学滤波器测试，那么可顺序地激活校准光源，例如，可使产生不同光谱分布曲线的led单独地照射，以便发出由校准光源支持的每一光谱分布曲线的校准光。然而，如果替代地使用校准光源来对照先前检测器性能测试检测器，那么可致使校准光源同时产生所有光谱分布曲线的校准光。在步骤1008处，处理器收集由于校准光源进行照射而来自光电倍增管的数据。在步骤1010处，存储来自检测器(例如，pmt)的数据。数据可存储于ram908或存储器910中。在步骤1011处，可做出关于是否需要校准光源的进一步照射(例如)以允许产生其它光谱分布曲线的额外校准光的确定。在步骤1012处，处理器可(例如)通过检查用户规定的设定或咨询管理光学滤波器元件检查的定时的计划或其它规则来确定是否将要检查光学滤波器元件。如果将要检查光学滤波器元件，那么可将当前数据与用于检查滤波器的所存储数据进行比较，例如，可来自检测器的针对特定光谱分布曲线下的每一校准光发出的量值数据与所存储数据进行比较，如较早论述，以确定所检测光在去往检测器的路线中经过的(若干)光学滤波器的光学特性。在步骤1016处，可将比较的结果发射到用户接口。结果可取决于系统的特定配置而变化。举例来说，在一些实施例中，针对一或若干光学滤波器元件确定的光学特性可发射到用户接口且显示给用户。在一些其它或额外实施例中，可将所述光学特性与和流式细胞仪的特定设定相关联的预定义预期光学特性进行比较，且可突出显示或以其它方式指示预期光学特性与所确定光学特性之间的差异，借此通知用户存在异常。举例来说，流式细胞仪可具有允许用户规定用于标记的(若干)荧光染料的类型的设定，且每一此类荧光染料可与已经预定以适合用于来自此些荧光染料的荧光的准确且可靠检测的光学滤波器特性的不同集合相关联。当用户规定特定荧光染料时，可对照所述荧光染料的光学滤波器特性评估光学滤波器元件的光学特性。

过程接着可返回以确定是否需要检查滤波器(或可直接继续进行到步骤1018)。由于已检查光学滤波器元件，因此过程接着任选地继续进行到步骤1018以查看是否应检查检测器操作。如果在步骤1018中确定应检查检测器，例如，规定应发生此检查的用户设定或其它规则，那么过程可继续进行到步骤1020，其中可将当前数据与先前测试数据进行比较以确定流式细胞仪的性能是否已存在改变。以此方式，如果当前测试数据与先前测试数据相同或几乎相同，那么系统可验证检测器在正确地操作。举例来说，如果所有检测器展现对校准光的相同光谱分布曲线的类似响应，那么此可指示检测器相对于较早性能一致地发挥性能。然而，如果一或多个检测器展现比较早测试数据针对相同光谱分布曲线的校准光所指示的低或高的响应，那么此可指示上述检测器正经历某种故障，即，与系统的先前光学性能状态相比较已存在系统的光学性能的改变。在步骤1016中接着可经由用户接口将这些结果传送给用户且过程接着可返回到步骤1012。如果在步骤1012中确定不需要检查滤波器且在步骤1018中不需要检查检测器，那么过程接着可继续进行到步骤1022，其中停止所述过程。应理解，在一些实施例中可变更以上步骤的次序，且在一些其它或额外实施例中可省略一些步骤。举例来说，一些实施例可不包含测试检测器性能的功能性，且因此在一些情形中可省略此些步骤。

还可执行额外处理以检查各种其它操作参数。举例来说，如果检测器性能测试指示被提供来自单个光纤或针孔的光的所有检测器具有与预期值相比较或与由系统中的其它检测器测量的信号强度相比较经减小的信号强度，那么此信息可指示关于将光递送到所述光谱分离器的问题而非关于检测器自身的问题。举例来说，所述检测器的光纤中可存在缺陷或故障。在另一实例中，可操作校准光源以获得所测量光值，后续接着(或前面为)使响应于被样本光源激发而具有已知强度的光发出的校准颗粒流动。如果检测器在不具有问题的情况下寄存来自校准光源的光但在由样本光源单独刺激校准颗粒时寄存经减小强度的所发出光，那么此信息可指示存在关于样本光源的问题，例如，激发激光可以经减少输出操作，借此致使校准颗粒中的荧光减少(如较早所述，校准光源可经设计使得发射到检测器的校准光具有类似预期于在正常使用期间由检测器测量的样本光的数量级—因此，校准光可用作对照其比较其它照射(例如校准颗粒发出)的照射标准或参考点的形式)。

在一些实施例中，可使用经校准仪器(举例来说，光谱仪)单独测量在校准光源中使用的每一光源的实际光谱分布曲线。此些测量可从可预期用于此些光源的“标称”光谱分布曲线(例如，制造商公告的led的光谱分布曲线)捕获光谱分布曲线形状的变化以及每一光源的强度。这些所测量光谱分布曲线接着可存储于与所述特定校准光源相关联的存储器(例如，在校准光源的印刷电路板上且因此与校准光源一起行进的非易失性存储器)中。所测量光谱分布曲线接着可用作前进的所述校准光源中的光源的光谱分布曲线，例如，用作图8a中所展示的光谱分布曲线。此定制校准的校准光源一般可用于增强光学特性确定的准确度且用于本文中所论述的实施例中的任一者。

在一些实施例中，单个校准光源可与多个流式细胞仪一起使用以帮助标准化或校准其性能。举例来说，由流式细胞仪使用的检测器可对于相同强度的所检测光具有变化的灵敏度，即，可产生针对相同输入的不同输出读数。为了量化此检测器间可变性，相同校准光源可从一个流式细胞仪移动到另一流式细胞仪且使用相同设定在两个流式细胞仪中操作。接着可将来自两个流式细胞仪的所得检测器读数进行比较，且可量化两个流式细胞仪之间的检测器灵敏度差异以允许来自检测器的输出相对彼此经校准或标准化。当然，还可以此方式校准多于两个流式细胞仪。相同技术还可用在单个流式细胞仪内以校准所述流式细胞仪内彼此不同的检测器。应理解，在此些检测器间校准操作期间，导向经校准的检测器中的每一者的光学路径理想地在滤波特性方面应为相同的，例如，要不就不存在滤波器或者要不就存在相同的滤波器，使得归因于不同滤波特性的检测器输出差异不与归因于检测器灵敏度差异的检测器输出差异混淆。

校准光源因此可用作共同参考点—通过测量由多个流式细胞仪中的检测器响应于相同校准光源使用相同设定所产生的校准光发出而产生的输出信号。

图11中图解说明可用于实施本文中所论述的系统及技术的一个进一步实施例。图11描绘类似于图2中所图解说明的流式细胞仪的流式细胞仪的示意性图示。然而，替代包含led板作为如图2中所展示的校准光源，校准光源经定位以便通过比色皿发出校准光—因此，校准光及样本光将遵循相同光学路径，从而允许针对可能缺陷检查所述光学路径的全部。举例来说，如果物镜光学器件208中存在可影响检测器效率的缺陷，那么图2中所展示的实施例将检测不到此缺陷，因为将校准光引入到物镜光学器件的光学路径“下游”。相比之下，图11的实施例将能够检测到此缺陷，因为校准光还行进穿过物镜光学器件208。

已出于图解说明及描述目的而呈现对本发明的前述描述。并不打算为穷尽性的或将本发明限制于所揭示的精确形式，且根据上文教示可能进行其它修改及变化。选择并描述实施例以便最佳地图解说明本发明的原理及其实际应用，以借此使得所属领域的技术人员能够在各种实施例中且以适合于所预计的特定用途的各种修改来最佳地利用本发明。打算将所附权利要求书理解为包含本发明的其它替代实施例，惟受现有技术限制除外。