本发明涉及细胞和亚细胞规模的光学层析成像。更具体地说，本发明涉及用于确定由癌症检测测试系统分析的样本充分性的系统和方法。
背景技术：
：肺癌是美国第二大流行癌症，并且是致命性最高的(4)。主要由于吸烟史，美国(us)发生肺癌的风险很高，超过3100万患者。每年大约有16万美国患者死于肺癌(4)。已经进行了许多尝试来开发用于肺癌的筛选程序。传统的基于痰液或支气管洗液标本的细胞学方法已被证实是相对不敏感的，其中只有大约40-60％的癌症患者有阳性结果，其中大部分来自支气管内鳞状细胞癌(567)。与细胞学检查相关的一个亮点是该程序的阳性预测值相对较高，一般高于98％，这意味着阳性测试是疾病的可靠指示(7)。医疗保险/医疗补助服务中心(cms)最近批准了在高风险患者中进行肺癌筛选的低剂量ct射线扫描(ldct)的报销范围(8)，以及美国预防服务工作组和其他一些专业和倡导组织提出了筛选高风险人群的建议(9、10)。全国肺癌筛选试验结果显示，与传统的胸部x射线相比，使用ldct能够将肺癌的死亡率降低20％(10)。尽管对肺部肿瘤(连续3次ldct扫描)的检测敏感，但ldct具有低特异性，其中结节患者的假阳性结果高达96％，这导致了阳性预测值低(11)。此外，必须考虑与继续监测和介入随访相关的成本和发病率/死亡率，特别是在假阳性人群中(12)。因此，添加具有更高特异性的非侵入性分类测试(如早期肺癌检测试验)具有更高的特异性，因此在ldct检查测试阳性患者中具有潜在的应用价值。此外，如果测试的敏感性也很高，那么它也有可能作为独立的主要肺癌筛选测试。在相关技术中，自二十世纪九十年代以来，基于二维形态学参数的自动和半自动算法分类器已经广泛用于宫颈细胞学标本。一种这样的设备现在被称为焦点主要筛选系统(becton-dickinson，franklinlakes，newjersey)(1，2)。焦点的分类器在标签过程中对细胞进行人工测评，然后通知算法分类器，允许新呈现的细胞(和病例)被赋予异常概率。低于指定评分阈值的个体细胞和/或病例发生异常的风险高于低于阈值的个体细胞和/或病例发生异常的风险，因此可以在此基础上进行选择，以供细胞学家进行重点检查(1，2)。将这个概念扩展到三维形态学分析提供了显著的更多数量的测量参数的可能性，这些测量参数在统计学上是稳健的，因此提高了准确性和临床性能。三维分析提供了比目前使用的细胞学设备更高的细胞和亚细胞错综复杂的分辨率(3)。鉴于肺癌的高发病率，需要在早期检测肺癌的肺癌检测测试。这样的肺癌检测测试既具有可以被用作肺癌的主要筛选器的潜力，又可以作为ldct辅助使用的测试以降低ldct单独筛选的假阳性及费用。为了追求这样的早期肺癌检测系统，利用光学层析成像的生物细胞的三维成像的发展已经由nelson开发，例如在2003年2月18日公布的美国专利no.6,522,775中所公开的标题为“使用光学层析成像在流动液体中成像小物体的装置和方法”，其全部公开内容通过引用并入本文。该领域的进一步重大发展在fauver等人于2010年6月15日公布的美国专利no.7,738,945中所公开的标题为“用于光学层析成像的伪投影形成的方法和装置”(fauver′945)以及fauver等人于2011年3月15日公布的美国专利no.7,907,765中所公开的标题为“用于光学微层析成像的焦平面跟踪”(fauver′765)中，fauver′945和fauver′765的全部公开内容也通过引用并入本文。基于其中的教导，visiongate，inc.，phoenix，az已经开发了早期肺癌检测技术，以提供可大大改善常规形态学细胞学分析的操作特性的测量优势。本文描述了与这种早期肺癌检测测试有关的新系统和方法。在这样的光学层析成像系统中的处理从标本制备开始。典型地，从患者采集的标本从医院或诊所被接收，并被处理以去除非诊断成分，固定然后被染色。然后将染色的标本与光学凝胶混合，插入微毛细管中。使用光学层析成像系统生成标本中诸如细胞的物体成像。所得到的图像包括来自被称为“伪投影图像”的来自不同视角的一组扩展景深图像。可以使用反向投射和滤波技术来重构伪投影图像集合以生成感兴趣细胞的三维重建。在所有三个维度上具有等距或大致相等的分辨率是三维细胞层析成像中的优势，特别是对于定量图像分析。然后三维重建仍然可用于分析，以便能够定量和确定感兴趣的结构，分子或分子探针的位置。诸如生物细胞的物体可以用至少一种染色剂或标记的分子探针被示踪，并且测量的该生物标记物的量和位置可以生成关于细胞疾病状态的重要信息，包括但不限于各种癌症，诸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌和胰腺癌。不幸的是，目前可用的测试技术由于缺乏确定标本是否被充分分析的方法而受到阻碍。在本发明中，已经发现，由于肿瘤或异常细胞从给定器官系统的上皮细胞与正常细胞一起脱落，这些正常细胞提供了极好的标记来确定标本是否被充分采样。使用本文公开的新技术，将满足这些条件的标本确定为适当的标本。技术实现要素：提供本概述是为了以简化的形式介绍在下面的具体实施方式中进一步描述的概念的选择。本概述不旨在确定要求保护的主题的关键特征，也不旨在用作帮助确定所要求保护的主题的范围。本申请公开了对来自标本进行三维细胞分类的细胞学分析测试。该方法包括从标本分离和保存细胞，并在将富集的细胞嵌入光学培养基之前富集细胞。嵌入的细胞被注入施加压力的毛细管中，直到细胞出现在伪投影观察子系统的视场中以获取伪投影图像。毛细管围绕管轴旋转以为每个嵌入的细胞提供一组伪投影图像，伪投影图像被重建以生成一个三维细胞重建集。参考细胞被分类和列举，第二细胞分类器检测目标细胞。充分性分类器将参考细胞的数量与列举参考细胞的阈值进行比较以确定标本充分性。附图说明尽管本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述，结合附图，从组织和内容两方面，本发明以及其他目的和特征将从下面的详细描述中被更好地理解和认识，其中：图1示意性地示出了用于分析痰液样本的肺癌测试的功能概述。图2示意性地示出了在肺癌测试系统中使用的三维光学层析成像系统的基本系统组件。图3a至图3c示出了腺癌细胞的三维图像的单个透视图。图4示出了肺柱状细胞上的纤毛。图5示意性地示出了包括充分性分类器的用于分析痰液样本的肺癌测试的功能框图。图6示出了异常细胞分类器的roc曲线。图7以图形方式显示绘制具有异常细胞的病例针对许多正常支气管上皮细胞充分性的曲线。在附图中，相同的附图标记表示相似的元件或部件。附图中的元件的尺寸和相对位置不一定按比例绘制。例如，各种元件和角度的形状不是按比例绘制的，并且这些元件中的一些被任意放大和定位以提高图形易读性。此外，所画出的元件的特定形状不一定旨在传达关于特定元件的实际形状的任何信息，并且已经被单独选择以便于在附图中识别。具体实施方式以下公开内容描述了用于癌症分析的标本充分性分类器。在附图中提出并描述了根据示例实施例的方法和系统的若干特征。应当意识到，根据其他示例实施例的方法和系统可以包括与附图中示出的附加过程或特征不同的附加过程或特征。这里参照光学层析成像细胞成像系统来描述示例实施例。然而，应该理解的是，这些实施例是为了说明原理的目的，本发明不限于此。本发明提供了一种使用标本的早期肺癌检测系统，所述标本包括由光学层析成像系统处理的患者痰液，所述光学层析成像系统产生等距亚微米分辨率的三维细胞图像，然后通过自动特征提取和分类算法对其进行询问以高准确精度识别痰液中的异常细胞。由于异常细胞在痰液中很少，并且非诊断性污染物很多，只有能够以高敏感性和高特异性进行细胞检测的系统才能有效管理痰液中的肺癌检测，同时确保标本充分性。目前公开的光学层析成像系统有许多潜在的用途；与非赘生性细胞的背景相比，其在赘生性细胞产量较低或异常细胞难以识别的标本中是最有利的。其示例包括在早期或周围型肺癌的情况下检测血液中的循环肿瘤细胞和痰液中的赘生性细胞。这是初步研究调查的后者应用。定义通常，如本文所使用的，以下术语具有以下含义：当与权利要求书或说明书中的术语“包含”一起使用时，使用单词“一”或“一个”表示一个或多于一个，除非上下文另有规定。术语“约”是指所述值加上或减去测量误差的边界，或者如果没有指示测量的方法则加上或减去10％。在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者如果替代方案是相互排斥的。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(及其变体)是开放式连接动词并且允许在权利要求中使用时添加其他元素。贯穿本说明书对“一个示例”或“示例实施例”、“一个实施例”、“实施例”或这些术语的组合和/或变体的引用意味着结合该实施例描述的特定特征，结构或特性被包括在本公开的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的短语“在一个实施例中”或“在实施例中”并不一定都指的是相同的实施例。此外，特定特征、结构或特性可以任何合适的方式在一个或多个实施例中组合。“毛细管”具有其普遍被接受的含义，并且旨在包括透明的微毛细管和具有通常500微米或更小内径的等同物。“cell-ct平台”是指由phoenix，az的visiongate公司制造的光学层析成像系统，包括上文提到的nelson和fauver专利的教导以及这些教导的改进。“景深”是沿着光轴的长度，在生成用于特定特征的不可接受的图像模糊之前，焦平面可以在该长度内移动。“luced测试”是指采用由phoenix，az的visiongate公司开发的cell-ct平台的早期肺癌测试，其结合了上文引用的nelson和fauver专利的教导以及这些教导的改进。“物体”是指个体细胞、项目、事物或其他实体。“伪投影”包括表示比光学器件的原始景深大的范围的采样体积的单个图像，其中由此形成的伪投影图像包括来自固定视点的一定范围的焦平面图像的集成。在fauver′945中教导了伪投影的概念。“标本”是指从个体患者的单个测试或程序获得的完整产品(例如，用于分析活体组织或鼻拭子的痰液)。标本可能由一个或多个物体组成。标本诊断的结果成为病例诊断的一部分。“样本”是指可以进行分析的成品细胞制剂，其包括全部或部分等分试样或标本。在图像处理的上下文中使用的“阈值”包括用于特征的任何可测量特征的判定边界值。根据所接受的模式识别原理，可以根据仪器规格、可接受的错误率、统计或其他标准来预先确定或设置阈值。在图像处理的上下文中使用的“体素”是3d网格上的体积元素。概述参照图1，示意性地示出了用于分析痰液样本的肺癌测试系统的功能概述。测试系统5包括用于痰液标本收集10的装置和方法，随后是早期肺癌检测12的测试，诸如luced测试。早期肺癌测试12进一步包括用于标本染色和富集14、三维细胞成像20、三维细胞分类22和异常候选细胞25的临床医生审查的装置和方法。痰液收集通常是通过患者家中的自发咳嗽或通过诊所的诱导来完成的。痰液被处理以去除污染物和非支气管上皮细胞，例如通过使白细胞和口腔鳞状细胞进行去膨胀处理。富集的标本在cell-ct平台上被处理，该平台以真实三维以等距亚微米的分辨率数字化地将细胞成像，例如在上面引用的nelson和fauver中所公开的。在三维细胞图像上测量与癌症相关的生物特征，并将其组合成用于识别具有癌症特性的少数细胞的评分。然后显示这些细胞用于人工细胞学家审查，使用诸如由visiongate，inc.，phoenix，az公司开发的cellgazertm审查站。审查站提供的视觉显示允许细胞学家查看二维和三维的细胞图像，以确定特定的细胞候选人明确的正常或异常状态。三维(3d)细胞分类22可以使用如下所述的技术来执行。细胞成像系统20包括通过计算机软件执行的处理，例如由与光机械设备交互的个人计算机执行，以校正在图像捕获期间生成的运动。大多数细胞图像以良好重建的方式从过滤的反向投影中出现。该算法识别重建不良的细胞，从而可以拒绝进一步处理。meyer等人在于2012年4月10日公布的美国专利no.8,155,420的标题为“三维重建中检测质量差的系统和方法”中教导了一种检测质量差的重建的方法示例，其公开内容通过引用并入本文。早期开发肺癌-筛选程序的尝试基于痰液细胞学检查(7)，该检查对疾病检测的敏感性不足(平均约60％)，但具有非常好的特异性。该经验导致一些人认为痰液对于肺癌检测没有价值。包括石蜡块嵌入痰液的仔细分析表明，标本实际上含有86％的癌症患者的异常细胞(8)。连续三天收集早上咳嗽取得了最佳效果。进一步的分析表明，由所有相关的临床因素包括肿瘤的组织类型、尺寸、阶段和部位表明，痰液中存在异常细胞(9)。基于这些标本特性，目前公开的肺癌检测测试采用自发性咳嗽痰液。使用cytoyt(hologic，marlborough，ma)或著名的saccomanno方法进行痰液固定，初步评估显示出令人满意的结果。标本充分性问题对痰液细胞学也很重要。试图增加痰液量已取得了不同的成功。痰液诱导(10，11)增加了痰液的生成，以帮助获得总体上适当的样本。痰液富集制备的示例在肺癌检测试验的一个例子中，痰液标本在分析之前经历三个阶段的处理：1)痰细胞分离和冷冻保存；2)通过荧光激活细胞分选(facs)富集细胞；以及3)将富集的细胞嵌入与光学层析成像系统的光学部件折射率匹配的光学油中。冷冻保存及facs富集用粘液溶解剂二硫苏糖醇(dtt)(fisherscientific，waltham，ma)处理痰液。为了长期储存，然后将标本通过41μm尼龙网，并保存在-80℃的15％二甲基亚砜(dmso)(fisherscientific，waltham，ma)中。过滤后，去除多达100μl的保存标本的等分试样以用于肺癌检测测试分析。首先，将痰液细胞用苏木精(electronmicroscopysciences，hatfield，pa)染色，用于下游肺癌检测测试成像。然后用包含荧光轭合物的抗体混合物处理细胞，所述荧光轭合物被选择以富集支气管上皮细胞并消耗污染性炎症细胞(中性白细胞和巨噬细胞)。抗细胞角蛋白-fitc缀合物混合物(cellsignaling，danvers，ma)靶向在正常和恶性上皮细胞中表达的细胞角蛋白。抗-cd45-apc缀合物(mylteni，bergischgladbach，德国)靶向用于阴性选择的炎症细胞。在细胞分选之前，细胞也用dapi(lifetechnologies，grandisland，ny)染色。对于facs富集，创建dapi阳性母门以排除双重细胞和碎片，然后排斥主要是口腔鳞状细胞的高侧散射事件。随后，绘制细胞角蛋白高子门(高fitc)和cd45-低子门(低apc)。该子门中的细胞群是使用诸如cell-ct光学层析成像系统的光学层析成像系统分选的富集的靶上皮细胞，用于更有效以及下游肺癌检测测试的分析。富集细胞的嵌入在facs富集后，将细胞在乙醇中脱水，然后悬浮于二甲苯中。然后将细胞转移到并嵌入到合适体积的光学培养基中。光学培养基是光学层析成像系统具有匹配折射率的粘性油。一旦被嵌入，细胞将被注入到一次性盒中用于在光学层析成像系统上成像。现在参考图2，在肺癌测试系统中使用的三维光学层析成像系统的基本系统组件。细胞成像系统20是自动的、高分辨率的3d层析显微镜和计算系统，用于对流动的细胞进行成像。包括光学耦合到聚光透镜92的照明源90，聚光透镜92与物镜94光学配合，用于扫描容纳在毛细管96中的物体1的图像。通过由振动镜102扫描物体占据的体积并通过分束器104传输到高速摄像机106来获得图像。高速摄像机生成多个伪投影图像110。高速摄像机生成多个伪投影图像110。针对每个物体生成用于多个轴向管旋转位置的一组伪投影图像。尽管测试系统不限于任何一种对比方法，但在一个实例中，肺癌检测测试特别针对基于传统使用的苏木精染色剂的细胞形态。在肺癌检测测试应用中，光学层析成像系统在所有维度(即，各向同性分辨率)下以相等的分辨率计算三维细胞图像，从而允许独立取向的测量。此外，消除传统显微镜典型的焦平面模糊度和视图取向依赖性提供了信息内容，以自动识别广泛的细胞类型，并明确识别主要正常细胞群中的罕见异常细胞。光学层析成像系统的输出识别出使用cellgazertm(visiongate，phoenix，az)工作站验证的所有细胞中大约0.5％为异常候选，该工作站是一种成像软件工具，其允许人眼审查没有焦平面和方向模糊的图像。光学层析成像系统成像是在小容量液体悬浮液上进行的。对于肺癌检测测试，这些细胞来自上述富集的上皮细胞群。因为光学层析成像系统可以将紧密重合的物体分开，所以单个文件细胞流的狭窄聚焦核心是不必要的，尽管是标准流体细胞计数中的要求。肺癌测试系统的实例的操作在上面引用的nelson和fauver的参考文献以及包括于2012年8月28日授予watson等人的美国专利no.8,254,023的其它专利中描述，所述专利的名称为“具有高速扫描仪的光学层析成像系统”，其内容也通过引用并入本文。在操作中，生物细胞1的染色细胞核悬浮在光学培养基112中，并被注入具有例如62μm内径的毛细管96中。毛细管系统被设计成一次性的，从而消除了标本之间交叉污染的可能性。在管旋转时收集三维数据之前，压力114被施加到流体上，以将物体1移动到用于成像的位置。致动反射镜102以扫过通过物体的焦平面，并且由相机对图像进行整合以从每个单视角(24)生成伪投影。未示出将毛细管96连接到光学层析成像系统的玻璃保持器。保持器有一个穿过中间的孔，该孔比两侧的毛细管和玻璃平板的外径略大，以允许与物镜和聚光透镜光学耦合。装载有传输培养基中嵌入的细胞的毛细管穿过保持器。保持细胞的传输介质、玻璃毛细管、毛细管保持器、与透镜接触的油以及透镜本身由具有相同光学指数的材料制成。结果，光线穿过光学层析成像系统光学器件、毛细管和细胞而没有折射，同时细胞可以被旋转以允许在毛细管旋转360度时捕获一组500个伪投影。因为细胞悬浮在流体培养基中，所以在收集伪投影图像110的同时它们容易发生少量移动。因此，伪投影中的细胞图像必须被注册到共同的中心，使得细胞特征在重建期间相互加强。meyer等人在于2010年11月16日授权的美国专利no.7,835,561的标题为“用于光学层析成像的图像处理和图像重建的方法”中公开了用于伪投影的错误校正技术，其内容通过引用并入本文。使用与常规x射线ct中使用的类似的过滤反向投影算法来处理校正的伪投影的集合，以计算层析三维细胞重建(13)。示出了在三个角位置0g、90g和180g处拍摄的伪投影图像110。照明由585nm波长的光源90提供，以基于苏木精吸收光谱来优化图像对比度。在重建中，三维像素或体素是立方体，每个维度尺寸为70纳米。由于图像收集体积在物体周围被裁剪，所以重建体积的尺寸各不相同。通常情况下，体积的尺寸约为200-300像素。现在参考图3a至图3c，示出了腺癌细胞的三维图像的透视图。图3a示出了最大强度投影中的腺癌细胞(13)。由于三维图像中的灰度值与各种细胞特征相关联，因此建立了将细胞结构映射到颜色和不透明度值的查找表，以在中心(如图3b所示)和右边(如图3c所示)生成细胞图像。在这些图像的颜色再现中，细胞质以半透明白色402表示、细胞核以不透明蓝色404表示，松散的染色质和核质以半透明绿色406表示以及凝聚的染色质和核仁以不透明红色408表示。鉴于国际专利条例对仅提供黑白图纸的限制，这些颜色已由相应的参考标号404、406和408(显示为虚线边界)标识的边界标识。现在参考图4，示出了肺柱状细胞上的纤毛。成像的正常支气管上皮细胞显示直径约250nm的单个纤毛链。这进一步展示了三维细胞成像系统的分辨率。细胞分类现在参考图5，示意性地示出了用于分析包括充分性分类器的痰液样本的肺癌测试的功能框图。包括几种细胞分类算法。光学层析成像系统技术的一个优势在于自动化的三维细胞分析，它可以检测细胞特征，这对于人类审查者来说太微妙或太复杂。自动分类消除了对标本的高度可变的人类审查。此外，基于三维图像的分类克服了与基于标准二维、固定焦平面图像的分类相关的固有限制，因为二维切片可能不携带基本图像信息以自动识别细胞疾病状态(14)。细胞分类具有可能自动识别由肺癌检测测试处理的数千个正常细胞中的少数罕见异常细胞。用于三维细胞分类22的分类步骤包括用于检测不良重建30的分类器，用于正常细胞库32的分类器，染色分类器36，充分性分类器37和异常细胞分类器42。在细胞学检测系统中使用的分类器被训练如下所述。在一个有用的例子中，用于检测不良重建30的分类器可以参考如上文meyer等人的参考文献。在一个示例中，用于正常细胞库32的分类器将正常细胞识别为用于使用审查站来识别异常细胞的参考点。有三种分类器可识别这些正常细胞类型：正常鳞状中间细胞34、正常柱状上皮细胞38和正常巨噬细胞40。染色剂分类器36例如通过处理被识别为鳞状中间细胞的细胞而进行操作。鳞状中间细胞的细胞核具有恒定的倍性，使得其整体灰度光密度值是理想的特征，其可用于评估标本染色是否处于最佳吸收对比度的正确范围内。可以为每个细胞核计算平均灰度值和中值灰度值，并维持一个运行平均值。平均的稳定值是可以用作所考虑的细胞核的各个灰度值的归一化的染色剂。充分性分类器37列举参考细胞，包括例如正常的支气管上皮细胞，并用于基于整体细胞数目来确定标本的处理是否适当。下面更详细地描述充分性分类器。异常细胞分类器是通过训练以使用本文描述的分类器训练方法来识别具有异常特性的目标细胞而生成的。这些目标细胞(通常是所有被处理细胞的0.5％)继续由病理学家使用审查站25检查，例如由phoenix，az的visiongate公司开发的cellgazertm工作站。在某些实施例中，目标细胞包括异常鳞状细胞、腺癌细胞、细支气管肺泡癌细胞、异常神经内分泌细胞、小细胞癌细胞、大细胞癌细胞、肺柱状细胞、肿瘤细胞、赘生性细胞和细支气管肺泡癌细胞及其他细胞以及在痰液中发现的细胞。分类器训练-输入及方法上面描述的细胞检测分类器的创建和优化通常被称为“分类器训练”，因为该过程旨在根据参考或基础事实准确地诊断细胞。准确性主要有两个方面：第一是特异性(正常细胞被分类器称为正常)，第二是敏感性(异常细胞被分类器称为异常)。算法训练方法包括adaptivelyboostedlogisticregression(18)和randomforest(19)。本领域技术人员将会熟悉如何将其他经典训练技术应用于分类器，诸如模板方法、自适应处理等。用于训练分类器的方法确保在输入数据的情况下获得非常好的结果。首先，当分类器训练过程的输入精确地描述细胞的临床相关方面并且对可能影响光光学层析成像系统结果的环境因素是稳健的时，确保分类器的准确性：1.如以上参考图3a-图3c所示，由光学层析成像系统生成的三维细胞图像具有高分辨率，允许精确测量支持正确分类的关键特征。2.一些对分类有用的特征只在三维图像中出现(17)。因此，三维特征集不仅更多地描述细胞，而且与二维成像相比，基于三维成像的分类更丰富也更准确(16)。3.已经开发了三维图像分割算法，以从细胞的背景和细胞核中分离出整个细胞。这些分割算法的准确性通过比较分割迹线与人类衍生细胞或核膜迹线来验证。4.特征测量描述细胞、细胞核、细胞质和细胞核仁的各个方面。在测试系统的一个例子中，针对代表物体形状、体积、染色质分布和其他更精细的形态成分等的每个三维细胞图像计算594个特征。已经证实这些特征的计算与细胞的定向无关。5.分类器训练的诊断真理(病理的金标准)是基于由两名细胞技术专家和一名细胞病理学家提供的分级细胞诊断。例如，cellgazertm工作站的用户必须首先完成一个训练和测试程序，其强调已经被判定为正常或异常的细胞的性能。分类器训练-统计考虑其次，在本发明人进行的一个测试中，分类器训练过程的准确性通过包括三个方面的严格过程来确保：1.用于训练分类器的数据库被制定为包含足够的材料以确保二项式95％置信区间(21)保持性能估计值在可接受范围内的变化。2.过度训练是训练过程中的一个潜在缺陷，因为过多的信息可能被纳入分类器，从而导致训练结果可能过于专业化。这种情况对分类器性能生成过于乐观的估计。过度训练的风险可以通过交叉验证(20)来减轻，这个过程涉及一部分训练数据并将作为测试数据。当基于训练数据的性能估计超出测试数据的估计时，可以达到在分类器中使用的信息量的限制。3.最后，作为对过度训练的进一步保证，分类器对来自不是训练过程部分的第二组细胞的数据进行测试。异常胞分类器训练总结以下考虑用于定义管理异常细胞分类器42的训练参数：1.由于痰液样本中异常细胞稀少，痰液中未诊断成分丰富，分类器必须以高敏感性和高特异性操作。如下述的表4所示，在单细胞分类器敏感性为75％时，并且标本含有多于一个异常细胞的情况下，其维持了高检测敏感性。2.为了确保工作量保持在合理的范围内，将特异性的目标设定为99％。3.区间较低的二项式95％置信区间(21)应被维持在敏感性在70％以内并且特异性98.5％以内。基于这些考虑，训练需要至少325个异常细胞和2500个正常物体。表1给出用于训练异常细胞分类器的细胞计数，并示出满足上述要求。表1细胞类型训练中使用的细胞数目异常554正常23626图6中的肺癌检测测试接受操作者特征(roc)曲线示出肺癌检测测试符合性能目标。而且，表1中所示的训练集中的样本数目在非常窄的二项式95％置信区间内支持该分类性能。表2示出具有置信区间(21)的肺癌检测测试的敏感性和特异性符合最低预期目标。表2表2所示的性能也使用了分类器培训中未包含的细胞进行验证。表3示出了基于训练被广泛应用于细胞群的性能预测。表3请注意，在表3中，使用a549(americantypeculture收集，manassas，va)细胞系以测试分类器敏感性。a549是由肺腺癌生成的细胞系。如下表6所示，肺癌检测试验被训练以识别许多不同的异常细胞类型。腺癌和鳞状癌细胞(包括a549细胞)具有最显着的特征，并以比表2中所示的基线75％更高的速率被识别。最后，对于每个阳性病例而言，都希望具有高的检测速率。单细胞检测的敏感性转化为检测到异常情况的敏感性，如表4所示。表4由visiongate，inc.构建的肺癌检测测试异常分类器的一个例子是在99.5％特异性下个体细胞敏感性为75％的操作。表2示出了低于95％的二项式置信区间的敏感性为71％。假设细胞分析是独立的，则可以基于检测到任何一个细胞的概率以及分析中出现异常细胞的数量的知识来计算病例敏感性。独立性是一个很好的假设，因为光学层析成像系统一次处理细胞。或者，与标本处理有关的因素或细胞来自病变的相同部分的事实可能影响来自病例的细胞评分。作为针对基于细胞检测敏感性的过度优化估计病例检测性能的保守测量，本发明人已经使用个体细胞检测敏感性的低于95％的置信区间限来估计病例检测敏感性。使用这个保守数字，病例检测敏感性可以根据在分析期间遇到的异常细胞的数量来估计。例如，如果只遇到一个异常细胞，则病例敏感性的下限为71％。如果遇到两个异常细胞，则病例敏感性将是100％*(1-0.29*0.29)＝91.6％。表4示出了这种病例检测与所遇到的异常细胞数量的趋势。表2、表3和表4的含义对于肺癌检测测试是重要的。这些表格中显示的结果表明，如果异常细胞处于通过肺癌检测测试分析的组中，其将自信地被检测到，从而以高敏感性识别病例。这在肺癌检测测试分析中留下异常细胞存在的问题，以作为决定癌症检测速率的剩余因子。标本充分性由于痰液是患者之间高度可变的标本，因此需要一个过程来评估肺癌检测测试分析的细胞是否包含足够的肺部取样以用于疾病检测。经典的痰液充分性是根据肺泡巨噬细胞的丰富程度来评估的(22)，然而这些细胞类型不能通过肺癌检测试验细胞富集过程得以保存。此外，先前对巨噬细胞存在与痰液中异常细胞存在之间的关系的评估并没有给出充分性确定方法的置信度。因此，肺癌检测测试充分性基于参考细胞的计数，诸如包括化生细胞和柱状细胞的正常支气管上皮细胞。如上所述，肺癌检测测试会自动列举这些细胞，因此不需要单独的手动分析充分性。如上所述，肺癌检测测试标本处理去除了痰液中的非诊断成分。该处理具有随机化富集细胞聚合体中的细胞内容物的作用。这意味着在癌症患者标本的肺癌检测测试分析过程中遇到异常细胞的可能性主要取决于异常细胞与样本中正常细胞数量的比例以及由肺癌检测测试处理的正常细胞的数量。这个比例取决于很多因素，包括病变大小、咳嗽动力学等。病例检测主要依赖于处理足够的正常支气管上皮细胞，以使得异常细胞也被处理。现在参考图7，图中示出了绘制具有异常细胞的病例针对多个支气管上皮细胞的充分性的曲线。曲线80表示垂直y轴上具有异常细胞的病例的百分比与水平x轴上的支气管上皮细胞的数量之间的关系。第一充分性阈值82对应于250个支气管上皮细胞。第二充分性阈值84对应于800个支气管上皮细胞。异常细胞病例的分类由异常细胞分类器42确定。注意曲线80的趋势对于通过自发咳嗽生成的标本是有效的。由于诱导改变了咳嗽动力学，可能需要为通过诱导收集的标本创建不同的曲线。本文描述的使用肺癌检测测试取决于测试如何与临床实践相结合。有两种模式：主要筛选器和ldct辅助。在主要筛选模式中，肺癌检测测试被用作一线筛选器，目标是在其发展成侵入性条件之前检测肺癌。在这种模式下，肺癌检测测试敏感性被设定为大于90％(23)。参考图7中的图表，当肺癌检测测试已处理800个正常支气管上皮细胞时，发生这种敏感性水平。因此，对于主要筛选，800是正常支气管上皮细胞的充分性所需的数量。在辅助模式下，肺癌检测测试采用ldct，以确定哪些来自ldct的阳性病例确实具有异常细胞，由于临床医生将获得两个正交筛选结果，所以肺癌检测测试敏感性低于70％是可以接受的。如阈值82所示，当识别250个正常支气管上皮细胞时，可以实现70％的肺癌检测测试敏感性。总而言之，肺癌检测测试具有两种操作模式，表5中给出了充分性条件和预期的病例敏感性。表5在达到没有任何异常细胞识别的充分性标准之后，可以安全地终止测试并且将该病例称为正常。注意，通过肺癌检测测试发现异常细胞消除了充分性的考虑。在这种情况下，肺癌检测测试报告了异常结果。分类器的开发及功能通常，计算特征以提供三维层析图照片的各个方面的数字表示。所计算的特征与物体的专家诊断一起使用以开发可以区分物体类型的分类器。例如，具有m个三维层析图的数据集用于第一类型的物体计算类型1，并且n个三维层析图可以用于第二类型的物体(诸如正常和异常细胞)计算类型2。这里“m”和“n”分别代表类型1和类型2的数量。数据集优选地由光学层析成像系统生成。光学层析成像系统提供包括诸如例如细胞的物体的三维图像的三维层析图。细胞通常包括其他特征，诸如具有细胞器(诸如核仁)的细胞核。物体类型可以包括不同类型的细胞、细胞器、呈现选定疾病状态的细胞、探针、正常细胞或其他感兴趣的特征。基于所有m+n个物体的三维层析图计算一组x个三维图像特征。接下来，找到能够最好地区分物体类型的y个三维图像特征的改进特征集合，其中“x”和“y”表示每个阶段的三维图像特征的数量。使用y个三维图像特征的精化三维图像特征集来建立输出与物体类型相关的分类器。在一个示例性实施例中，在阶段102，聚集一组三维图像，其中聚集的组表示基本上所有将被专家用来区分三维生物物体类型的重要标记。在聚集了具有代表性的一组三维层析图之后，可以为表征重要标记的每个物体计算三维图像特征组。特征诸如细胞的生物物体的层析图显示出多个可观察和可测量的特征，其中一些特征可以用作分类的特征。下面的表6提供了特征的基本摘要，即用于促进分类目的的重要标记。表6特征作为进一步解释，在一个有用的示例中，现在已经发现在三维生物物体中出现的空隙是基于测量标准(包括与计算或选择阈值的比较)的有用分类特征。与空隙相关的另一个特征可以包括物体中空隙的数量。与空隙相关的另一个特征包括空隙的体积或空隙的数量。另一个特征包括空隙的表面积或空隙的数量。核间空隙的形状和位置也可以用作有用的特征特性。另外，还可以使用特征特性的组合来构建如上所述的分类器。类似地，现在已经发现在三维生物物体中发生的内陷是基于测量标准(包括与计算或选择阈值进行的比较)的有用的分类特征。与内陷相关的另一个特征可以包括物体内陷的数量。与内陷有关的另一特性包括内陷的体积或内陷的数量。另一个特性包括内陷的尺寸或内陷的数量。核内陷的位置也包括有用的特征特性。另外，特征特性的组合也可以用于构建如上所述的分类器。现在已经发现在三维生物物体中发生的内陷空隙是基于测量标准(包括与计算或选择的阈值进行的比较)的有用分类特征。内陷空隙的体积、表面积、形状、连接到内陷的空隙的位置以及内陷特征的组合也可以有利地用于构建如上所述的分类器。现在已经发现在三维生物物体中发生的核仁是基于测量标准(包括与计算或选择的阈值进行比较)的有用的分类特征。可能是核仁或染色质浓缩物的体积、表面积、形状、位置以及前述特征的组合也可有利地用于构建如上所述的分类器。现在已经发现在三维生物物体中出现的核纹理特征是有用的分类特征。使用各种尺寸的结构成分，使用模糊残留物的技术以分离细胞核内的各种尺寸的特征。模糊残留技术通常需要使用过滤器来对图像进行模糊处理，并通过应用标记操作来测量所得的模糊残留。然后计算总的三维体积，如离散成分的数量、体积直方图、平均体积和方差以及形状直方图。现在已经发现描述核仁、内陷、空隙和核膜之间的空间关系的距离度量是有用的分类特征。例如，如果发现三个核仁，则可以找到平均值和方差，可以找到最小和最大的核仁间距离。也可以找到核仁群集的平均坐标与整个物体的质心之间的距离。类似的计算可以通过用上述任何实体取代核仁和核心质量来形成。快速傅立叶变换(fft)特征现在也被发现是有用的分类特征。fft特征由三维层析图的快速傅立叶变换形成。fft特征表示fft分类的突出和平均特性。这里已经相当详细地描述了本发明，以符合专利法规并向本领域技术人员提供应用本发明的新颖原理所需的信息，并根据需要构建和使用这样的示例性和专用组件。然而，应该理解的是，本发明可以通过不同的设备和装置来实现，并且可以在不脱离本发明的实际精神和范围的情况下实现关于设备细节和操作过程的各种修改。参考文献以下出版物的教导通过引用整体并入本文。1.wilburdc，preymu，millerwm，pawlickgf，colgantj.用于宫颈细胞学主要筛选的autopap系统：比较预期、预期使用的研究结果与常规手动操作。actacytol1998；42：214-20.2.wilburdc，black-schafferws，luffrd，abrahamkp，kemperc，molinajt，tenchwd).bectondickinsonfocalpointgs成像系统临床试验显示出对重要宫颈病变检测的显着提高的敏感性。amjclinpathol2009；132：767-75.3.meyerm，hayengaj，neumannt，katdarer，presleyc，steinhauerd，bellt，lancasterc，nelsonac.cell-ct三维细胞成像技术平台能够使用非侵入性luced痰液测试以检测肺癌，(submittedcacytopathol)4.美国癌症协会.癌症事实和数据2015.atlanta，ga：美国癌症协会；2015.accessedatcancer.org/onmarch10，2015.5.pilottis，rilkef，gribaudig，ravasigl.用于肺癌诊断的痰液细胞学。actacytol.1982；26：649-54.6.singa，freudenbergn，kortsikc，wertzelh，klosab，hassej.痰液和细胞刷检中诊断肺癌的敏感性的比较。actacytol.1997；41：399-408.7.vanrensburga，neethlinggs，schubertpt，koegelenbergcfn，wrightca，bollingerct，bernasconim，diaconah.常规痰细胞学检查对支气管癌高危人群的影响。intj管rclungdis.2014；18：607-12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