用于颗粒测定的检测和信号处理系统的制作方法
本申请根据35u.s.c.§119(e)基于并要求2015年12月30日提交的美国临时专利申请序列第62/273,368号的优先权权益，所述申请出于所有目的通过引用其整体并入本文。
其他材料的交叉引用
本申请通过出于所有目的引用以下材料的整体来结合这些材料：2010年7月8日公开的美国专利申请公开第2010/0173394a1号；以及josephr.lakowicz的荧光光谱原理(principlesoffluorescencespectroscopy)(第2版，1999年)。
引言
在各种类型的测定中从颗粒(诸如液滴)检测信号。在典型的测定中，用荧光染料标记颗粒。然后，当颗粒连续通过检测体积时，从各个颗粒中检测荧光，在该检测体积中，荧光染料被激发以引起光发射。
仅仅荧光可能不足以精确检测每个颗粒的存在并表征颗粒的尺寸/形状。在许多数字测定中，在每个颗粒具有高荧光或低荧光的混合颗粒群中，该问题可能是显著的。因此，基于颗粒的测定的结果可能由于高估或低估检测到的颗粒的数量而偏离，从而无法排除不满足预定标准的颗粒的荧光数据等。
技术实现要素：
本公开提供了用于检测和处理来自颗粒的信号的系统和方法。在示例性方法中，颗粒可以通过通道的区域，而该区域用光照射。光与颗粒的相互作用可以使光偏转并诱导光致发光。可以从该区域检测偏转信号和光致发光信号。可以在偏转信号中识别颗粒波形。颗粒波形的至少一个子集可以是双峰波形，包括对应于进入和离开该区域的颗粒的一对峰。可以从光致发光信号获得幅度。幅度可以对应于相应的颗粒及它们的颗粒波形，并且幅度的至少一个子集可以对应于该双峰波形。基于相应的幅度，可以将各个颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性。
附图简述
图1是根据本公开的方面的用于检测和处理来自诸如液滴的颗粒的信号的示例性系统的示意图。
图2是大致沿图1的2-2线截取的图1的检测和处理系统的狭缝形成光学元件的视图。
图3是图1的检测和处理系统的局部视图，其在光束与流动通道相交以便产生照射区域(也称为检测体积)处截取。
图4是大致沿图1的4-4线截取的图1的检测和处理系统的掩模的视图。
图5是根据本公开的方面的图1的检测和处理系统的实施例的局部示意图，其中光束被点画以便示出掩模如何在光束中形成阴影区域。
图6-图9是根据本公开的方面的图1的检测和处理系统的局部视图的时间序列，其在颗粒(例如，液滴)通过系统的检测体积并且示出入射光如何被颗粒的不同区域偏转时截取。
图10是根据本公开的方面的图4的检测和处理系统的修改版本，其通过添加中继透镜来聚焦偏转的光并且使掩模的像平面远离通道而产生。
图11是围绕系统的流动通道和偏转检测器截取的图1的检测和处理系统的局部视图。
图12是图1的检测和处理系统的修改版本的局部视图，其如图11那样截取并且在流动通道和偏转检测器之间具有较窄的光学狭缝以便减少小角度偏转的检测。
图13是图1的检测和处理系统的另一个修改版本的局部视图，其如图11那样截取并且具有偏转检测器，该偏转检测器具有位于掩模的像平面中的较小光敏区域并且替换图11的光学狭缝。
图14是图1的检测和处理系统的又一个修改版本的局部视图，其如图11那样截取并且具有位于掩模的像平面中的一对光学狭缝以便减少大角度偏转的检测。
图15是图1的检测和处理系统的又一个修改版本的局部视图，其如图11那样截取并且偏转检测器的一部分被遮蔽以便减少对不需要的光的检测。
图16是图1的检测和处理系统的实施例的局部视图，该系统被配置成检测在通道的照射区域下游的位置处的偏转光和未偏转光。
图17是对于图16的检测和处理系统内通常由图16中的17-17线指示并位于辐射区域内和其周围的区域计算的光的强度分布。
图18是在图16中的18-18线所指示的区域处入射到图16的系统的检测器上的光的经计算的强度分布。
图19是图5的检测和处理系统的更完整视图，其中视图包括光源和一对光致发光检测器。
图20是用图19的检测和处理系统的工作模型检测的偏转光和荧光的强度的曲线图，该强度作为来自通过通道的照射区域的一系列液滴的时间的函数。
图21是一系列曲线图(a-e)，示出了在示例性检测和处理系统中从位于辐射区域上游的光学狭缝的相同尺寸但具有不同投影宽度的液滴检测到的示例性液滴波形。
图22是根据本公开的方面的可以在用于至少一种分析物的颗粒分析方法中执行的示例性步骤的流程图。
图23a和图23b共同是图示出可用于执行根据图22的颗粒分析方法的示例性算法及其信号处理步骤的流程图。
图24是在单个液滴通过通道的检测体积之前、期间和之后用图19的检测和处理系统的工作模型检测到的偏转和荧光信号的曲线图。
图25是根据本公开的方面的当从通过检测体积的颗粒检测到偏转信号时、根据偏转信号实时识别双峰波形的示例性状态机的示意图。
图26是存在于偏转信号中并且从左到右进行了标记的示例性双峰波形，其中在波形的前端、第一局部最大值、局部最小值、第二局部最大值和后端处具有垂直条。
图27是根据本公开的方面的用图24的偏转信号和荧光信号之一产生的一对曲线图，并且示意性地图示出如何通过图23a和图23b的算法分析由偏转信号产生的双峰波形以便从峰的时间点获得用于荧光信号的波形和积分边界的峰到峰分离值。
图28是示意性地表示根据本公开的方面的液滴过滤过程的一对曲线图，该过程可以被执行以便排除对应于具有在可接受范围之外的峰到峰分离值的双峰波形的液滴。
图29是示意性地表示根据本公开的方面的另一液滴过滤过程的一对曲线图，该过程可以被执行以便排除对应于不满足一个或多个波形标准的波形的液滴。
图30是示意性地表示根据本公开的方面的又一个液滴过滤过程的一对曲线图，该过程可以被执行以便排除在偏转信号中的波形的频率和周期产生充分变化之后检测到的液滴(以及每个信号的其余部分)。
图31是根据本公开的方面的示意性地描绘了在相同时间段内从连续通过通道的照射区域的液滴(或其他颗粒)检测到的偏转信号和光致发光信号的一对曲线图，该曲线图示意性地图示出可以被执行以便排除对应于具有在可接受范围之外的宽度值的单峰或双峰波形的液滴(或其他颗粒)的过滤过程。
具体实施方式
本公开提供了用于检测和处理来自颗粒的信号的系统和方法。在示例性方法中，颗粒可以通过通道的区域，同时用光照射该区域。光与颗粒的相互作用可以使光偏转并诱导光致发光。可以从该区域检测偏转信号和光致发光信号。可以在偏转信号中识别颗粒波形。颗粒波形的至少一个子集可以是双峰波形，包括对应于进入和离开该区域的颗粒的一对峰。可以从光致发光信号获得幅度。幅度可以对应于相应的颗粒及它们的颗粒波形，并且幅度的至少一个子集可以对应于该双峰波形。基于相应的幅度，可以将各个颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性。
在一些实施例中，该方法还可包括以下的任何组合。可以针对每个波形计算宽度值，并且可以基于宽度值排除颗粒。在一些实施例中，宽度值可以是对应于波形的一对峰值之间的时间间隔的分离值。在一些实施例中，可以将每个宽度值与阈值进行比较，并且如果比较满足预定条件，则可以排除相应的颗粒(以及对应的(多个)幅度和波形)。获得幅度的步骤可以包括基于利用相应波形限定并且可选地使用一对时间点限定的积分边界来计算积分幅度的步骤，其中在该一对时间点处计算出波形的宽度值。
提供了一种用于检测和处理来自颗粒的信号的示例性系统。该系统可以包括通道和一个或多个光源，该光源被配置为照射通道内的区域。该系统还可包括至少一个正/负压源，其配置成驱动载液中的颗粒通过该区域。该系统还可包括偏转检测器和光致发光检测器，该偏转检测器配置成检测来自通过该区域的颗粒的偏转信号，该光致发光检测器配置成检测来自通过该区域的颗粒的光致发光信号。该系统还可包括处理器。处理器可以被配置为识别偏转信号中的颗粒波形。颗粒波形的至少一个子集可以是双峰波形，包括对应于进入和离开该区域的颗粒的一对峰。处理器还可以被配置为从光致发光信号获得幅度。幅度可以对应于各个颗粒及它们的颗粒波形。幅度的至少一个子集可以对应于双峰波形。处理器还可以被配置为基于相应的幅度将各个颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性。
在一些实施例中，处理器可以进一步配置成如下。处理器可以被配置为多个波形的每个波形计算宽度值，并且基于宽度值排除颗粒(以及对应的幅度和/或波形)。每个宽度值可以是对应于波形的一对峰值之间的时间间隔的分离值。处理器还可以或者可选地配置成调整从波形计算出的宽度值，以便在检测到信号时校正携带颗粒通过区域的流体的流速的波动，并且基于调整后的宽度值排除颗粒(和相应的信号部分)。在一些实施例中，处理器可以被配置为使用样条调整宽度值。例如，处理器可以用样条拟合替换宽度值，并使用拟合的残差来调整宽度值。另外或替代地，处理器可以被配置为计算宽度值的平均值，并且排除在时间上对应于偏离平均值超过限定量的宽度值的颗粒。另外或替代地，处理器可以被配置为将每个宽度值与阈值(或范围)进行比较，并且排除在时间上对应于超过(或小于)预定义阈值(或者在预定义范围之外)的宽度值的颗粒。在一些实施例中，处理器可以被配置为利用状态机可选为实时地识别双峰波形和/或单峰波形。每个幅度可以是积分幅度，并且处理器也可以或者可选地可以被配置为基于利用每个波形限定的积分边界从光致发光信号的部分获得积分幅度，并且可以基于积分幅度确定被分配为对于分析物为阳性或阴性的颗粒的数量。可选地，可以使用计算出相应宽度值的时间点来限定积分边界。
本公开的系统和方法可以为颗粒测定提供各种优点，包括以下之一或两者。
首先，可以从偏转信号而不是光致发光信号(例如，荧光信号)确定关于每个颗粒的尺寸信息。根据每个颗粒的分析物含量(analytecontent)，光致发光信号幅度可能在颗粒之间显著变化。对于待测分析物为阳性的每个颗粒通常产生较高的信号幅度，导致较大的阳性颗粒估计尺寸，而对于分析物为阴性的每个颗粒产生较低的信号幅度，导致较小的阴性颗粒估计尺寸。相反，偏转信号的幅度对于阳性颗粒和阴性颗粒都是相同的。因此，偏转信号可以用于根据尺寸过滤颗粒，由分析物含量产生的偏差很少或没有，这导致更准确的分析物测量。
其次，可以通过对光致发光信号的一部分进行积分来获得每个颗粒的积分幅度信息。该积分方法可以产生与每个颗粒中染料分子的有效数量(例如，未猝灭和/或结合的染料分子的数量)成比例的积分幅度。因此，这些积分幅度可能受到例如由变形、收缩等引起的颗粒的几何形状和/或尺寸变化的影响较小，导致分析物测量精度的进一步提高。
以下部分描述了本公开的其他方面：(i)检测和信号处理系统概述、(ii)流体子系统、(iii)光学子系统、(iv)颗粒检测方法、(v)用于偏转光的检测配置、(vi)偏转光的示例性强度分布、(i)vii)检测和处理系统实施例、(viii)示例性偏转和光致发光信号、(ix)用颗粒测定的概述、(x)用于信号处理的示例性算法、和(xi)实施例。
i.检测和信号处理系统概述
该部分提供了用于光学检测和/或表征颗粒52(诸如液滴)的示例性检测和信号处理系统50的概述；见图1-图8。检测和处理系统50可包括流体子系统54、光学子系统56和处理/控制子系统58。在一些实施例中，系统可以被描述为检测系统。
流体子系统54可以包括通道60，流体子系统在该通道60处与光学子系统相交。该通道限定了用于由颗粒52和周围的载液64在62处的运动箭头指示的行进的流动路径。流动路径延伸通过通道内的照射区域66。(照射区域66可互换地称为检测体积，如下所述。)流体子系统还包括驱动机构，该驱动机构可操作地连接到通道并包括一个或多个正/负压源。每个正/负压源可以例如包括至少一个泵68，其可操作地连接到通道，以便产生压力差，该压力差驱动载液沿着通道60并通过照射区域66流动。泵可以是正压泵或负压泵(即真空泵)。泵和通道之间的流体连通可以由位于泵和通道之间的流体路径中的一个或多个阀控制。
颗粒52由载体液体输送通过照射区域。载液可以由与通道流体连通的载液源供应。在一些实施例中，颗粒可以是液滴，诸如水性液滴，并且载液可以是由与液滴不混溶的液体组成的连续相，诸如油。
光学子系统56包括至少一个光源70、至少一个光检测器(例如，偏转检测器72和光致发光检测器74)、以及各种光学元件，以便引导和/或限制光辐射从(多个)光源到照射区域66以及从照射区域到(多个)检测器的传播。根据设置在光束路径中的光学元件，光源70可以产生光辐射束76，其可以例如在沿着光束的区域中发散、准直或汇聚。光学子系统可以包括任何合适的光学元件，诸如透镜、掩模、空间/光谱滤光器、反射镜、孔径限定元件、分束器、光导等。例如，一个或多个光谱滤光器可以设置在照射区域和光致发光检测器之间的光路中，以便选择性地防止激发光(相对于通过光致发光发射的光)到达检测器。
在本公开中，术语“光”和“光辐射”可互换使用。两者均表示紫外辐射、可见光或红外辐射或者它们的任何组合。
光束76跟随光路77，光路77从光源70向下游延伸，横穿通道60，并朝向偏转检测器72。光路限定光轴78，光轴78可以是线性的，如这里所示，或者可以(例如，经由光导和/或反射镜)弯曲(参见示例3)。在所描绘的实施例中，在光束从光源70沿着光路77之后，光束76发散，由准直透镜80准直，延伸通过分束器82(这里是短通镜)，并由聚焦透镜84聚焦。聚焦后的光束延伸通过光学狭缝86，由另一个准直透镜88准直，并被掩模90部分地阻挡。光束由至少一个聚焦元件聚焦在通道60的照射区域66上。(多个)聚焦元件可以被描述为聚光器和物镜。(多个)聚焦元件用作用于沿着光路77在图1中从左到右行进的光束76的光辐射的聚光器，并且作为仅沿着光路的一部分在图1中从右到左反向传播的发射光的物镜。(多个)聚焦元件称为物镜92。
在任何给定时间，入射在辐射区域66上的光辐射可以遵循不同的轨迹。光束的大部分光辐射可以基本上未偏转地通过照射区域66。该未偏转的光辐射不入射在偏转检测器72的光敏区域上。例如，可以通过空间滤光器，即孔径限定元件(例如，狭缝形成元件94)防止该未偏转的光辐射到达检测器72，或者从到检测器72的光路发散过多。一部分光辐射可以通过照射区域的当前内容朝向偏转检测器充分偏转，使得偏转的辐射入射在检测器的光敏区域上并因此被检测。另一部分光辐射可激发照射区域内的(多个)光致发光体，引起光子发射(即光致发光)。
在沿着光路77的一部分反向行进之后，可以通过光致发光检测器74检测该发射光的一部分。特别地，发射光通过物镜92、准直(现在为聚焦)透镜88、光学狭缝86和聚焦(现在为准直)透镜84。当发射光(波长比光束76的激发光长)到达分束器82时，光被反射到聚焦透镜96，如98处的箭头所示，其将发射光聚焦在光致发光检测器74上。因此，来自相同光源70的光辐射可以朝向偏转检测器72偏转并且可以引起光致发光。
这里使用的术语“偏转”意味着使其改变路线或遵循新轨迹。更具体地，通过与照射区域中的物质(例如，颗粒和/或载液体)的相互作用而偏转的光辐射由于相互作用而偏离当前轨迹。偏转可以通过任何合适的机制或机制的组合发生。与本文公开的检测系统相关的示例性偏转机制可包括折射、反射、米氏散射等。在一些实施例中，诸如在透明颗粒的情况下，颗粒和载液之间的折射率差异可能是大部分检测到的偏转的原因。可以互换地将“偏转(deflection、deflect、deflected)”描述为“散射(scattering、scatter、scattered)”。
为了便于描述，可以认为光沿着光路在光束中从光学“上游”位置向光学“下游”位置传播。因此，光学元件在光路中的相对位置也可以用这两个术语来描述。例如，在图1中，光源70位于光学狭缝86的上游，同时又是位于掩模90的上游。掩模位于物镜92和照射区域66的上游。偏转检测器72和狭缝形成元件94位于照射区域66的下游，并且狭缝形成元件94位于检测器72的上游。
处理/控制子系统58可以与流体子系统和/或光学子系统的任何合适的组件通信和/或可操作地连接，如箭头100所示。例如，子系统58可以接收由偏转检测器72检测的偏转信号和/或由光致发光检测器74检测的光致发光信号。子系统58可以包括处理器102(例如，电子/数字处理器)，其被配置为处理偏转信号和/或光致发光信号以便确定颗粒52的一个或多个特性。特性可以包括尺寸、速度、形状、通过照射区域的渡越时间、在各个颗粒中或上存在或不存在分析物等。处理器102还可以或可选地控制泵68、光源70或一个或两个检测器72和74或其任何组合的操作。
处理器102可以包括存储器和存储在存储器中的数据操纵程序。数据操纵程序可以包括存储在存储器中并且可由处理器执行以便控制和/或执行本公开的任何步骤的指令。
图2示出了检测和处理系统50的狭缝形成光学元件110，其产生光学狭缝86。该狭缝对于系统的光辐射是透明的，而围绕狭缝的不透明主体112防止光辐射通过其他地方的光学元件110传播。例如，狭缝86可以由主体112中的开口(气隙)形成或者形成为在主体112的另外遮蔽的表面上的未遮蔽区域。该狭缝垂直于光路77而伸长，之后是光学元件110处的光束76，并且该狭缝与通过照射区域66的通道60的伸长(和流体流动)方向垂直地延伸(在校正方向变化之后，如果有的话，在光学狭缝86和照射区域66之间的光路中(例如，由反射镜产生的方向的变化))。
图3更详细地示出了通道60的辐射区域66。位于狭缝86和通道60之间的光路中的光学元件可以准直光束76，然后将光束76聚焦在通道的一部分上。通道可以在狭缝86的像平面中伸长(参见图1)，使得狭缝被投射到通道的截面上以便在通道内产生由光束76照射的体积。该体积在图3中明显地被点画，相当于照射区域66，并且可以描述为检测体积，因为当流体和颗粒流过通道60时该体积的变化内容可能是每个探测器随时间感测到多少光的主要决定因素。
狭缝86的宽度和由狭缝和照射区域66之间的光学元件产生的放大或缩小(如果有的话)限定了通道60中的狭缝的投影宽度114。平行于通道的局部长轴116测量到的投影狭缝宽度114确定通道内的照射区域66的尺寸。例如，如果狭缝86具有35μm的宽度，并且光学子系统在狭缝86和通道60之间具有两倍的放大率，则投影宽度114为70μm。因此，狭缝86的宽度可以例如根据被检测的颗粒52的直径(或长度)来选择，使得投影狭缝宽度114小于颗粒52的尺寸(例如，其直径(或长度))。在示例性实施例中，投影狭缝宽度为颗粒尺寸的约40-90％、50-80％或60-70％。颗粒的尺寸在通道60中限定，并且在每个颗粒通过照射区域时平行于颗粒行进方向来测量。每个颗粒的尺寸(例如，长度)可以与其直径基本相同或者可以显著大于直径，诸如比直径大至少20％、30％、40％或50％，等等。
图4示出检测和处理系统50的掩模90。掩模可以阻挡光束的任何合适的横向部分。例如，掩模可以是线掩模，其提供窄且细长的非透射区域，即用于阻挡光束76的一部分的线120。线120可以平行于光学狭缝86来定向，并且可以或可以不以光束76和/或光轴78为中心。掩模可以例如由具有不透明涂层的透明衬底122形成，以便形成不透明线120。例如，衬底122可以由玻璃形成，并且线120可以通过铬蚀刻玻璃的细长表面区域来产生。掩模可以被认为是整个光学元件或仅是其不透明区域。在一些示例中，线掩模可以由离散的细长构件(诸如细线)形成。在一些示例中，掩模可以具有不同形状的遮挡元件，诸如非细长形状(例如，圆形或正方形)以便形成点掩模。
线120可具有任何合适的尺寸和位置。该线可以比光束76的直径长，如图4所示。线120的宽度可以基本上小于光束的直径，诸如小于直径的约20％、10％或5％等。该线可以阻挡光束的横截面积(和/或光)的任何合适部分，诸如小于约10％、5％或2％等。线120的示例性宽度包括小于约1mm、700μm或400μm等。
图5示出检测和处理系统50的实施例130。光束76被点画以示出掩模90如何阻挡光束的一部分以便在光束中形成阴影区域132(可互换地称为暗区域)。阴影区域的部分可以位于照射区域(和通道60)的光学上游和下游。然而，在所描绘的实施例中，下游部分提供用于检测偏转光的位置。阴影区域可以表示由光束的发散区域限定的光束角度134的任何合适部分，该发散区域远离通道60朝向偏转检测器72延伸。例如，阴影区域可以限定小于大约8度、6度、5度、4度、3度或2度等的阴影区域角度136。
偏转检测器72具有与阴影区域132对准的光敏区域138。由光学元件94限定的光学狭缝140的尺寸和位置设置成防止光束76的未偏转光142撞击光敏区域138。换句话说，光学狭缝140可以窄于光束撞击光学元件94的阴影区域132的宽度。光学狭缝140可以位于掩模90的像平面中。偏转检测器72位于光学元件94及其狭缝140的后面(下游)，并检测来自偏转到阴影区域的光束76的光。用于狭缝140和/或偏转检测器72的合适位置可以通过掩模90与物镜92的后焦平面的接近度来确定。如果掩模放置在该焦平面中，则掩模的像平面位于通道60后面的无限远处。因此，掩模可以定位成与后焦平面偏移，以便将掩模的像平面移动到距通道60的适当距离。检测器72的光敏区域138可以位于掩模的像平面附近，诸如靠近狭缝140并且直接在狭缝140后面。作为另外一种选择或除此之外，可以用光学元件对已经通过照射区域的光、特别是偏转光进行聚焦，如下面示例1中所述。
为了实现高信噪比，狭缝可以位于掩模的像平面中。若将狭缝移近或远离物镜并因此移出像平面，则会迅速降低掩模像的对比度并增加噪声。由于狭缝具有有限的宽度，因此对比度降低，并且当入射到掩模上时，通过它的光可能不会被完美准直。如图1所示，理想化遮挡的光束图案(即，任何下游位置处的锐利掩模阴影)仅出现在插入完美准直光束中的掩模中。
形成在掩模的像平面中的掩模像可以相对于物理掩模放大或缩小。在所描绘的实施例中，掩模的像相对于物理掩模缩小0.5倍。例如，如果物理掩模的线具有300μm的宽度，则掩模像中的线的宽度可以是150μm。
检测和处理系统130示出了图1的系统50的另外的示例性方面。例如，系统130包括由两个或更多个透镜形成的物镜92，其可以彼此预组装以便形成单元。在所描绘的实施例中，物镜是具有40倍放大率、0.6的数值孔径和2.8mm的工作距离的明治(meiji)物镜。提供2倍放大率的空间滤光器143由透镜84和88以及狭缝形成光学元件110形成。而且，流体子系统54被设计成将液滴144(作为颗粒52)输送通过平面的通道形成构件146中的照射区域66。将液滴置于不混溶的载液148(例如油)中。接近照射区域66的液滴之间的间隔(如果有的话)可以通过在通道接合部154处从一个或多个稀释通道引入另外的载液150来增加，所述通道接合部154在辐射区域66的流体上游。通道构件146还可以具有用于供额外的载液进入的入口156和用于供液滴144在通过照射区域之后流出的出口158。
图6-图9示出当颗粒(例如，液滴144)穿过照射区域66时检测和处理系统50内的光的示例性偏转。在图6中，整个液滴在辐射区域66之外。未偏转的光到达偏转检测器72。在图7中，液滴的前沿已进入照射区域，其产生偏转光160，该偏转光160充分进入阴影区132以便穿过光学狭缝140并到达检测器72。在图8中，液滴在照射区域中大致居中并产生偏转光160，其从光束76的两个分支162进入阴影区域132。(如果线掩模以光束为中心，则每个分支162(也称为光束部分)可具有大约相同的强度。)在图9中，液滴的后沿已进入照射区域，其产生偏转光160，该偏转光160充分进入阴影区132以便穿过光学狭缝140并到达检测器72。
在2010年7月8日公开的美国专利申请公开第2010/0173394a1号中描述了利用用于液滴的检测和处理系统的示例性测定的其他方面，其通过引用并入本文。
ii.流体子系统
该部分描述了流体子系统和其中的示例性载液和颗粒的示例性方面。
流控子系统包括至少一个通道60，以便容纳和引导载液和颗粒的移动。通道可具有任何合适的横截面形状，诸如圆形、椭圆形、多边形等。通道可以具有与颗粒的直径大致相同或者更大的横截面尺寸。在示例性实施例中，通道是微流体通道，即具有小于约1mm的横截面尺寸的通道。示例性通道具有通道的最小横截面尺寸的至少约2、5、10或20倍的长度。通道可以是限定在平面构件中的周向封闭的通路，或者可以是限定在管内的封闭通路(例如，具有圆柱形外部的管)等。可以至少部分地通过模制、湿法蚀刻、干法蚀刻、激光蚀刻、机械加工等形成通道。
流体子系统可包括负压源(真空)以便沿着通道拉动流体、正压源以便沿着通道推动流体、或两者。在任一种或两种情况下，压力可以通过泵产生。泵可以是正排量泵，诸如注射泵等。其他示例性泵包括蠕动泵、旋转泵等。在其他示例中，压力可以由引入到系统并同时保持加压气体或真空的容器提供。
载液可以是能够沿着通道输送颗粒的任何合适的液相或气相。载液和颗粒都可以是液体，例如，由连续液相包封的分散液相，如在乳剂中。因此，载体相可包括油和任选的表面活性剂。合适的油可以包括含氟油、硅油或矿物油、或其任何组合等。在其他实施例中，载体相可以是气相或液相，并且颗粒可以是固相物，载体相可以是气相并且颗粒可以是液滴(例如，作为气溶胶)，或者载体相可以是液相(例如，水相)或气相，并且颗粒可以是生物细胞。
由本公开的检测和处理系统检测的颗粒可以以任何合适的相存在，诸如液相、固相或其组合等。示例性颗粒包括液滴、珠或其他小固相物体、生物细胞等。
颗粒可具有任何合适的尺寸。通常，颗粒的直径小于约1mm和/或体积小于约1μl。颗粒的直径可以为至少约1μm和/或体积为至少约1fl。
颗粒可具有任何合适的形状。示例性形状包括球形、圆柱形、子弹形、不规则形、随机形等。液滴和其他颗粒可具有对流体子系统的一个或多个参数敏感的尺寸和/或形状。液滴的直径和/或形状可受通道60的直径的影响。液滴的形状可以是球形的，并且液滴的直径可以与通道60的直径大约相同或者小于通道60的直径。在其他情况下，液滴可以是细长的，并且可以具有与通道直径相对应(或不对应)的直径。液滴的形状也可能受到载液的流速的影响，这可以确定液滴在通过照射区域时被拉伸或以其他方式变形的程度。在一些实施方案中，液滴可具有阻止液滴变形的表面层，使得液滴对流体子系统引起的变形相对不敏感。
颗粒可以是光致发光的，即，当用适当波长的激发光照射时能够发光。示例性类型的光致发光包括荧光、磷光等。每个颗粒可含有光致发光体，其是能够光致发光的任何原子、分子、部分、复合物或聚集体。合适的光致发光体包括荧光染料、量子点等。
iii.光学子系统
本节介绍光学子系统的其他方面。
光学子系统可以包含任何合适数量的光源，诸如1个、2个、3个、4个或更多。可以操作光源以便产生同时或在不同时间(例如，交替地或顺序地)到达照射区域的光辐射。
每个光源可以产生任何适合的波长的光辐射。在一些实施例中，每个光源或至少两个光源可以发出可见光(例如，与系统的其他光源的波长不同)，或者至少两个光源可以发出不同类型的光辐射(例如，一个光源可以发出紫外辐射，而另一个光源可以发出可见光)。
光源可以包括至少一个发光元件以便产生光，并且可选地包括一个或多个光学元件以便对产生的光进行收集和/或聚焦以便形成光束。示例性光源和/或发光元件包括电致发光灯(例如发光二极管和激光(诸如激光二极管))、高强度放电灯(例如水银弧光灯)等等。发光二极管(led)包括通过电致发光产生光的任何固态装置，包括半导体led、有机led和/或聚合物led等。
每个检测器(也称为光学检测器或光电检测器)可包括至少一个配置为检测任何适合的波长的光的光传感器。检测器可以是点检测器(例如光电二极管或光电倍增管)或图像检测器等等。示例性图像检测器包括多像素光子计数器(mpcc)(例如，硅光电倍增管(sipm))、电荷耦合器件(ccd)传感器，有源像素传感器(例如，互补金属氧化物半导体(cmos)传感器、n-类型的金属氧化物半导体(nmos)传感器等)等。检测器检测光并产生表示检测到的光的信号(例如，电信号)。检测器可以将光子转换成电流或电压。
iv.颗粒检测方法
本文公开的系统可用于执行检测颗粒信号的方法。本节中呈现的方法步骤可以以任何合适的顺序和组合来执行，并且可以通过本公开的任何其他特征和方面来修改。
可以产生光束。光束可以用至少一个光源产生，并且可以例如包含可见光，可选地至少主要包含可见光。在一些实施例中，可以利用至少一个发光二极管或至少一个激光器产生光束的光辐射。
可以将光束引导到通道以便在通道中产生照射区域，在该照射区域中，光束与通道相交。通道可包含沿着通道穿过辐射区域流动的载液，其中一个或多个颗粒设置在载液中。载液的流动可以使每个颗粒移动通过照射区域，可选为连续地移动。载液的流动可以由压差驱动，该压差可以由至少一个泵产生。
可以在通道的上游对光束进行空间滤光。空间滤光可以至少部分地在系统的(多个)光学元件的焦平面中执行。光束的尺寸可以通过空间滤光来限制，可选地具有细长的狭缝，诸如空气狭缝，光束的光通过该狭缝。狭缝可以与通道正交地布置(由照射区域处和周围的通道的长轴限定)。光束可以在狭缝的上游准直并聚焦在狭缝上。光束可以在光束被空间滤光的位置下游和通道上游的位置处再次被准直。
可以在照射区域的上游阻挡光束的横向部分以便产生阴影区域。阴影区域可以在光束被阻挡的区域的下游产生。可使用掩模来创建阴影区域。掩模可以设置在光束的准直区域中以便阻挡光束的一部分。
可以使用由一个或多个光学元件组成的物镜将光束聚焦在通道中的照射区域上。可以在通过阻挡光束而产生的光束的部分阻挡区域上执行聚焦光束。
光束可以通过与照射区域中的物质相互作用而偏转。光可以被通过照射区域的颗粒偏转。光可以偏转到阴影区域中，并且可以在照射区域的下游被检测到。通过照射区域的颗粒可以在由检测器在阴影区域中检测到的光的强度中产生暂时的增加(脉冲)。可以在通道的下游和检测器的上游对光束进行空间滤光，其中光学狭缝可操作地设置在通道和检测器之间的光路中。
可以检测由光束在照射区域处引起的光致发光。光致发光的检测可以是落射荧光，其中激发光和发射光共享沿着与照射区域相对应的相反方向的光路。
v.用于偏转光的检测配置
该节描述用于利用偏转检测器72检测在检测和处理系统50中的偏转光的示例性配置，其中一个或多个光学元件位于照射区域66和检测器之间；见图10-图15。该示例的每个配置可以合并到本公开的任何检测和处理系统中。
光可以通过各种机制在照射区域偏转，包括折射、反射、米氏散射等。每种机制的相对贡献可以通过颗粒尺寸、形状、组成等；载液性质；每个颗粒与载液之间界面的性质；等来确定。例如，在设置在包含油的载液中的液滴的一些实施例中，通过胶束和液滴内部及其表面上的大分子(例如蛋白质)进行的小角度偏转、以及在液滴和油之间的界面处的光折射和多次反射都可以将光辐射偏转到阴影区域。然而，后一种效应(折射和多次反射)可以使入射光辐射偏转更大的角度，以便产生“大角度”偏转。在任何情况下，检测系统可以被配置为仅从阴影区域的一部分检测感兴趣的偏转光，以便根据偏转角度选择性地包括和排除偏转光。大角度偏转可以在狭缝上产生均匀的光强度分布，而小角度偏转可以在狭缝边缘周围渗出。因此，当小角度偏转提供更多颗粒信息时，可以选择性地排除位于阴影区域更中心的大角度偏转的一部分。或者，当大角度偏转提供更多颗粒信息时，可以选择性地排除更靠近阴影区域边缘的小角度偏转。利用这种方法，可以减小偏转信号的背景水平，以便增加检测和处理系统的灵敏度。
图10示出了图5的检测和处理系统130的修改版本130’。系统130’在照射区域66和偏转检测器72之间添加中继透镜170。中继透镜可以位于掩模90的焦平面中并且将掩模90重新成像到距照射区域更远的距离(也参见图5)。因此，狭缝形成元件94位于距离照射区域更远的位置处的掩模的像平面中，这在系统50内靠近照射区域的空间受限的情况下可能更方便，并且可以增加掩模的暗像与由光束76在像附近照射的区域之间的对比度。在一些实施例中，可以减小中继透镜170的孔径以便排除光束，并且可选地，在阴影区域的相对边缘附近偏转光，以便选择性地排除仅偏转小角度的光。或者，可以增加中继透镜170的孔径，使得可选地主要检测更大量的大角度偏转。在一些实施例中，中继透镜可以具有使得不需要狭缝形成元件94的孔径。
图11示出了围绕流动通道60和偏转检测器72截取的图1的检测和处理系统50的局部视图。这里给出了图11的配置作为参考，用于与图12-图15的修改配置进行比较。
图12示出了图1的检测和处理系统的修改版本50a，其具有减小的小角度偏转的检测。系统50a具有沿着光路的与系统50的元件94相同的位置处的狭缝形成元件94a，即，在掩模90的像平面(参见图1)中，但是限定了更窄的光学狭缝140a。因此，可以调节狭缝的宽度以减小背景。
图13示出了检测和处理系统50的又一个修改版本50b。系统50b用具有较小光敏区域138b的检测器72b代替检测器72。区域138b可以位于掩模90的像平面中(参见图1)，来代替光学狭缝140(与图11相比)。光敏区域的尺寸和位置可以设置成使得光束76的任何部分都不会入射到区域138b上(或被检测到)。取而代之，只有在照射区域66中偏转的光可以到达区域138b并被检测到。可以选择区域138b的尺寸和纵横比以便至少大致匹配掩模的像平面中的阴影区域的尺寸和纵横比。例如，区域138b可以平行于光学狭缝86和/或平行于掩模90的线而伸长。区域138b可以具有至少约5：1或10：1等的纵横比。可以选择区域138b的宽度以包括或排除小角度偏转。
图14示出了检测和处理系统50的又一个修改版本50c。通过用具有彼此平行的一对光学狭缝140c的狭缝形成元件94c替换下游光学狭缝140来从系统50产生系统50c。这对光学狭缝各自可以位于掩模90的像平面中(参见图1)，并且可以由遮挡区域180分开。遮挡区域180减少了大角度偏转的检测。替代地或另外地，另一光学狭缝可设置在图11的光学狭缝140与检测器72之间。
图15示出了检测和处理系统50的又一个修改版本50d。掩模190附接到偏转检测器并覆盖光敏区域138的部分。掩模190可以位于掩模的像平面之外。因此，区域138上的点与可以到达该点的光的偏转角之间可能没有良好的相关性。然而，检测器72的额外遮挡或阻挡可以有效地控制由于在检测体积外部、例如来自通道形成构件的外表面区域或各种缺陷发生的光偏转而可能存在的一些不期望的光。
vi.偏转光的示例性强度分布
该节描述用光学建模软件计算的用于示例性检测和处理系统200的强度分布；见图16-图18。
图16示出了具有偏转检测器72的检测和处理系统200，该偏转检测器72的尺寸和位置设置成被光束76的整个横截面照射。检测器72可以是配置成检测光束76和阴影区域132的图像检测器。被偏转到阴影区域中的光可以被检测为表示阴影区域的图像像素的增加的强度。
图17示出了在与光束的光路正交并且平分照射区域的平面中的检测和处理系统200的照射区域66中的光的计算强度分布。用
图18示出了由检测和处理系统200的检测器72检测到的光的计算强度分布。用
vii.检测和处理系统实施例
该节描述了检测和处理系统130的其他方面；见图19(另见图5)。
检测和处理系统130具有光源70(例如，led)和一对光致发光检测器74a、74b，每个光致发光检测器74a、74b部分地通过光导220a或220b光学耦合到空间滤光器143和物镜92。每个光导包括光纤222，光纤222允许用于激发和发射的光路根据需要弯曲。
由光源70产生的激发光依次通过光导220a、准直透镜224和光谱滤光器226a。然后激发光被分束器82(这里是长通镜)反射向空间滤光器143，并通过物镜92和照射区域66传播，用于激发其中的(多个)光致发光体和偏转。
作为由激发光诱导的光致发光，从照射区域66发出的光反向穿过物镜92、空间滤光器143、分束器82、光谱滤光器226b、聚焦透镜228、光导220b和准直透镜230。准直的发射光的一部分然后通过分束器82a到达聚焦光导232a和检测器74a。准直的发射光的另一部分被分束器82a反射到聚焦光导232b和检测器74b。
检测和处理系统130可以包含一个或多个附加光源和/或一个或多个附加光致发光检测器。因此，检测和处理系统可以被配置为仅用一个检测器检测一个通道中的光致发光，用两个检测器检测至少两个通道中的光致发光(如图19所示)，或者用三个或更多个检测器检测三个或更多个通道中的光致发光。
viii.示例性偏转和光致发光信号
该示例描述了利用检测和处理系统130的工作模型从液滴形式的颗粒收集的示例性偏转和光致发光信号；见图20和图21。
产生含有一对荧光染料的液滴。染料发射光分别可用检测器74a和74b检测到(见图19)。由检测器74a和74b记录的信号分别在图20中被指定为通道1(ch1)和通道2(ch2)荧光。检测器72检测偏转信号，同时检测器74a和74b检测两个荧光通道的信号。将每个信号的强度(幅度)绘制为液滴通过检测体积所用的时间的函数。表示四个良好分离的液滴的信号部分由图20中的字母a、b、c和d表示。
图20示出了当每个液滴的前部区域进入照射区域时偏转信号如240处的虚线所指示从基线上升到第一局部最大值，并且当液滴的后部区域离开照射区域时偏转信号如242处的虚线所指示从第二局部最大值返回到基线，以便限定液滴的传输间隔或跨度244。在传输间隔期间由液滴引起的偏转信号的变化产生具有特性特征的液滴波形246。波形包括至少一个峰(即，局部最大值)，并且如图所示，可以包括前峰248(第一局部最大值(第一高度))和后峰250(第二局部最大值(第二高度)))以便形成双峰(两个局部最大值)。波形可具有液滴或其他颗粒的特性特征，如波形的一个或多个特征所限定。峰248、250可以由液滴的相应前部和后部区域(和相应的波形)、特别是由液滴的前部和后部区域形成的一对隆起252、254产生。隆起可以在时间上位于该对峰中间的谷256(局部最小值)处彼此连接。从(多个)波形和/或其特征计算出的任何合适的(多个)表征值可以有助于分析液滴尺寸、液滴形状和/或通过照射区域的流体的流速。波形的表征值可以包括波形的宽度。可以在波形的一对时间点之间的任何合适位置处测量宽度，并且可以对应于作为时间点之间的差计算出的时间间隔。时间点可以位于偏转信号的相同幅度(高度)处，在基线处，在最大幅度或波形高度的一部分(例如，一半)处，或者基于波形的特性幅度等。表征值还可以或可选地包括每个波形的宽度，该宽度被测量为对应于波形内的峰之间的时间间隔的分离值258等。表征值还可以或替代地可以包括波形的前部区域和后部区域相对于彼此的相对尺寸(高度和/或宽度)、峰或波形高度与峰之间的局部最小值的比率、连续波形之间的一段时间等。
图21示出了一系列曲线图(a-e)，其绘制了在检测和处理系统130中针对不同宽度的上游光学狭缝86从相同尺寸(120μm直径)的液滴检测到的偏转信号(也参见图5和图19)。对于曲线图a至曲线图e中所示的信号，在照射区域66处的狭缝86的投影宽度分别为48、64、79、95和111μm。狭缝的投影宽度(s)与液滴直径(d)的比率(s/d)显示在每个曲线图的右上角。更一般地，该比率可以描述为检测体积尺寸与平均颗粒尺寸的比率，其中检测体积尺寸和颗粒尺寸分别是检测体积和平行于通过检测体积的颗粒的行进方向而测量到的平均颗粒的特性尺寸。每张曲线图的时间尺度相同，强度尺度使用相同的任意测量单位。
对于每个投影的狭缝宽度，示出了针对通过照射区域66的单个液滴检测到的示例性液滴波形246a-246e。由每个波形的峰248和250限定的分离值258a-258d被指示在每个波形上方。如图所示，波形的形状可以随着狭缝宽度的变化而显著变化。由曲线图a至曲线图c中的较窄狭缝86产生的两个隆起在曲线图d中变得很难分辨，然后合并以便在曲线图e中产生单个峰。因此，选择适当的狭缝宽度可以允许产生更多信息的波形。较窄的狭缝可以产生具有更深的谷256(较小的局部最小值)的波形(比较曲线图a至曲线d)，但是减少了检测到的偏转光的量。在其他实验中，投影的狭缝宽度保持恒定并且液滴的尺寸被改变。随着液滴直径减小，检测到的偏转波形的形状遵循图21的趋势并按所示顺序。换言之，当液滴尺寸充分减小时，两个隆起合并为一个。因此，投影狭缝宽度与液滴直径的比率可以影响波形形状，并且可以被选择以便提供相对于噪声的足够信号，同时仍然产生峰之间具有足够分离的波形。在示例性实施例中，检测体积尺寸与颗粒尺寸的比率(如上所限定)可以是，例如，或约为0.3-1.2、0.4-1.0、0.5-0.9、0.5-0.8或0.6-0.8等。在一些实施例中，该比率可以小于或小于约1.5、1.2、1.0、0.8等。
图21的液滴在皮肤形成蛋白质bsa的存在下形成，并被加热以便在每个“皮肤”液滴和周围载体相之间的界面处产生界面皮肤。也利用与图21中大约相同体积的液滴进行类似的实验，但缺少界面皮肤。这些“无皮”液滴更易变形，并且对于图21中所示的每个投影的狭缝宽度产生双峰波形。实验表明，检测体积尺寸与颗粒尺寸的可接受或合适的比率可随乳剂的组成、通过照射区域的流速、照射区域的直径等而变化。
ix.用颗粒测定的概述
该节提供利用颗粒(诸如液滴)执行的示例性方法，诸如数字测定；见图22。本节中描述的测定可以至少部分地利用检测和处理系统50(参见第i节和图1)来执行，并且任何信号处理步骤可以通过具有处理器的算法来执行。
图22示出颗粒分析的示例性方法280。为方法280呈现的步骤可以以任何合适的顺序和组合来执行。换言之，方法280的任何单个步骤或两个或更多个步骤的组合是可选的并且可以省略。方法280可以由本公开的任何其他合适方面修改或与其组合。
可以获得颗粒，如在282处所示。颗粒可通过任何合适的(多个)程序或(多个)机制获得，诸如分离、化学反应(例如交联)、流体分散等。颗粒可包括至少一种分析物，其是进行分析的任何物质。分析物可以是例如核酸(例如，多核苷酸，诸如dna或rna，或其序列)、蛋白质、肽、氨基酸、大分子复合物、脂质、原子、金属、激素、病毒颗粒、生物细胞和/或类似物。每种分析物可以在获得的一组颗粒中以“部分占据”的形式存在，这意味着该组颗粒的仅一个子集中的每个颗粒包含分析物的至少一个拷贝或分子。在一些实施例中，可以通过形成液滴来获得颗粒，所述液滴可以通过分配连续相(诸如连续水相)来产生。液滴可以是基本相同的尺寸(单分散)。液滴可以通过任何合适的机制形成，诸如流动聚焦、剪切、喷射到空气中、超声处理等。
可以在颗粒中进行反应，如在284处所示，以便能够检测每种分析物的存在。反应可以在颗粒的表面和/或内部进行。该反应可以是，例如，酶催化反应。在示例性实施例中，反应包括扩增反应，其可以扩增核酸的靶序列。扩增可以或可以不是等温进行的。在一些情况下，可以通过在高于室温的温度(诸如在变性温度(例如，大于约90摄氏度))、退火温度(例如，约50-75摄氏度)、和/或延伸温度(例如，约60至80摄氏度)下加热颗粒和/或温育颗粒一个或多个循环来促进扩增。在一些示例中，可以对颗粒进行热循环以便通过聚合酶链反应和/或连接酶链反应等来促进扩增。可能合适的示例性等温扩增方法包括基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增、多重置换扩增、链置换扩增、滚环扩增、dna的环介导扩增、解旋酶依赖性扩增和单引物扩增等。
可以从颗粒检测信号，如286处所示。信号可包括偏转信号和至少一个光致发光信号。每个光致发光信号可以具有对应于各个颗粒中的一种或多种分析物的水平(例如，存在或不存在)的幅度(例如，强度)。可以从颗粒包含的标记中检测每个光致发光信号。标记例如可以由染料提供，该染料可以是光致发光的(例如荧光的)。
偏转和光致发光信号可以由两个或更多个检测器检测，诸如用于偏转信号和(多个)每个光致发光信号的相应检测器。每个检测器可以通过检测从被照射的检测体积(和其中的流体/颗粒)接收到的光并且产生代表检测到的光的信号来检测信号。在其他实施例中，检测器可以例如检测不同类型的辐射、电特性、磁特性等。无论是否光学地执行，检测和信号创建在本文中被共同描述为信号检测。
可以从每个颗粒包含的标记中检测每个光致发光信号。标记可以例如是光学可检测的标记，诸如光致发光体(例如荧光团或荧光体)等。因此，光致发光信号可以表示从颗粒发射的光的强度。适用于扩增反应的示例性标记包括与寡核苷酸连接的荧光团、嵌入染料等。
可以从通过检测系统的照射区域(检测体积)的流体流中检测每个信号。可以在相同的时间段内从检测体积检测偏转和光致发光信号。偏转信号的各个时间点可以与光致发光信号的各个时间点同步地被收集或不收集。因此，偏转信号时间点可以或可以不以与光致发光信号时间点相同的频率被收集，并且具有或不具有时间偏移。例如可以通过以任何合适的采样频率用模数转换器对模拟检测器信号进行数字化来收集时间点。
可以识别偏转信号中的颗粒波形，如288处所示。每个波形可以对应于单个颗粒，并且可以跨越对应于颗粒尺寸的时间间隔。波形可以具有单个局部最大值(例如，高于阈值)或至少一对局部最大值(例如，每个都高于阈值)，其可以在时间上彼此由至少一个局部最小值(例如，低于阈值)隔开。可以实时识别波形，即在检测到偏转信号时识别波形，或者可以在完成一组颗粒的偏转信号的检测之后识别波形。所识别的波形可以是单峰波形、双峰波形或其组合等。在一些实施例中，波形可以由状态机识别，如第x节中进一步描述的。状态机可以被配置为仅识别双峰波形、仅识别单峰波形、或者识别双峰和单峰波形两者等。在任何情况下，可以基于任何合适的标准来识别每个波形，例如，使用针对第viii节中的液滴描述的任何标准。
对于各个波形，可以获得(例如，计算)至少一个表征值，如290处所示。该至少一个表征值可以包括第viii节中描述的任何表征值。在一些实施例中，表征值可以是宽度值。可以将宽度值计算为每个波形的任何合适的时间点对之间的时间差。波形的时间点可以具有彼此相同的幅度(例如，强度)、或不同的幅度(例如，强度)。在一些实施例中，计算宽度值所采用的(多个)幅度可以在波形之间不同，并且可以特定于每个波形。例如，在一些实施例中，可以以与每个波形的特性幅度成比例的幅度计算宽度值。特性幅度可以是波形的最大幅度、波形(或其区域)具有最大斜率时的幅度等。具有最大斜率的波形区域可以是前部区域(在基线和第一或唯一峰之间)、后部区域(在最后(例如，第二)或仅峰和基线之间)、或者在波形的前部区域与后部区域中间的区域。在一些情况下，宽度值可以是通过找到双峰波形的两个局部最大值之间的时间差而计算出的分离值。在一些实施例中，可以通过将一对曲线拟合到双峰波形的点(例如，形成一对脉冲/突起(例如，驼峰)的点)来限定局部最大值，如下面在第x节中进一步描述的。
可以基于表征值和/或一个或多个其他标准来排除颗粒(和相应的波形/幅度)，如292处所示。可以基于其他考虑来排除颗粒及其数据。可以基于它们对应的表征值来排除颗粒。排除步骤从该方法的后续步骤中排除一个或多个颗粒及它们对应的幅度/波形。在一些实施例中，可以将每个表征值与参考值进行比较，该参考可以是预定义的，或者可以根据表征值来计算。在一些实施例中，参考值可以是表征值的平均值。每个偏离参考值超过阈值的表征值(即，范围外的每个值)可以触发颗粒及其对应的(多个)幅度和/或波形从后续步骤中被排除。阈值或范围可以在计算出表征值之前预定义，或者可以例如基于表征值相对于表征值的平均值的分布来确定。在一些实施例中，阈值可以对应于与表征值的平均值的标准偏差，诸如对应于标准偏差乘以常数(例如，整数，诸如1、2或3等)。
可以限定针对各个颗粒的每个光致发光信号中的边界，如294处所示。每个单独颗粒的边界可以是通过对用于计算波形的表征值(例如，宽度值)的两个时间点中的每一个应用时间偏移而沿时间轴限定的前沿边界和后沿边界。时间偏移对于每个波形可以是相同的，可以在波形内具有相同的时间尺寸，和/或可以在波形内沿着时间轴是彼此相反的方向。例如，可以通过从用于宽度值的前沿时间点减去时间值，并通过将相同的时间值加到用于该宽度值的后沿时间点来计算波形的前沿边界和后沿边界。在一些情况下，可以分别将相同的时间值加到波形的前沿和后沿峰的时间点上，并从前峰和后峰的时间点减去该相同的时间值，以便获得边界，如下面第x节中进一步描述的。每对前沿边界和后沿边界可以从时间上对应的波形限定，然后应用于每个光致发光信号的时间上对应的部分。
可以从每个光致发光信号获得各个颗粒的幅度，如296处所示。每个幅度可以表示在时间上以任何合适的重叠量与波形重叠的光致发光信号的一部分。因此，每个幅度可以与偏转信号的波形之一相关联并与其对应。幅度可以直接从光致发光信号获得，或者可以诸如通过减去背景、积分和/或调整等来计算。因此，在一些实施例中，每个幅度可以表示光致发光信号的积分部分，诸如积分强度、可选地减去背景。可以对在时间上对应于偏转信号的波形的光致发光信号的部分进行积分，以便获得各自的积分幅度(即，积分强度)。积分可以包括在从前沿边界到后沿边界的跨度上对光致发光信号的点的值(例如，强度值)求和，包括或排除位于每个边界处的点(如果有的话)。因此，边界可以发挥积分边界的作用。在一些实施例中，可以通过从光致发光信号中检索而直接获得各个幅度(例如，在时间上对应的波形的时间跨度上的光致发光信号的最大强度)，而无需进行积分或其他操作。
可以使用幅度分配个体颗粒的分析物含量，如298处所示。分析物含量可以指示给定颗粒对于单个分析物或两种或多种不同分析物为阳性(包含至少一个拷贝/分子)还是阴性(不包含拷贝/分子)，和/或可以指示存在于给定颗粒中的每种分析物的拷贝/分子(例如，整数个拷贝/分子)的数量。任选地在至少一次调整或校正之后，可以将幅度与至少一个阈值进行比较，以便将分析物含量分配给每个颗粒。在一些实施例中，可以将来自同时从颗粒检测到的(例如，在两个或更多个不同波长处检测到)两个或更多个不同光致发光信号的幅度与多个阈值进行比较，以便将分析物含量分配给颗粒。分配可以包括将各个颗粒分配为具有两种或更多种可能的分析物含量(例如，对于分析物a和b为阳性或对于分析物c为阳性)。
可以基于分析物含量对颗粒进行计数，如300处所示。在计数步骤期间，可以仅考虑在步骤292中未排除的颗粒。计数过程可包括确定具有给定分析物含量的未排除的颗粒(例如，对于特定分析物为阳性或为阴性的颗粒)的数量。给定的分析物含量可以针对单个分析物或两种或更多种分析物来限定，并且可以例如限定为每种分析物的分析物拷贝的存在(阳性)或不存在(阴性)或数量。在一些实施例中，可确定对于每种分析物为阳性的未排除的颗粒的数量，可确定对于分析物为阴性的未排除的颗粒的数量，或可确定这两个数量。还可以确定未排除的颗粒的总数，并且该总数可以对应于对于分析物为阳性的未排除颗粒的数量与对于分析物为阴性的未排除颗粒的数量之和。
可以确定分析物的浓度，如302处指示。可以使用通过计数步骤确定的至少一个数量的颗粒来计算浓度(步骤300)。在示例性实施例中，浓度可以用等式1计算：
c1＝-ln(nn/nt)(1)
在等式1中，c1是表示为每个颗粒的平均拷贝数的浓度，nn是阴性颗粒的数量，nt是颗粒的总数。nn与nt的比率是对于分析物为阴性的颗粒的分数。也可以使用等式2计算浓度：
c2＝-ln(nn/nt)÷vd(2)
在等式2中，c2是表示为每单位体积的拷贝的浓度，vd是颗粒的平均体积。
由于阳性颗粒的数量np等于nt和nn之间的差，因此可以用np和nt计算浓度c1或c2。例如，每单位体积的浓度可以等效地用公式3确定：
c2＝-ln(1-np/nt)÷vd(3)
np与nt的比率是对于分析物为阳性的颗粒的分数。
x.用于信号处理的示例性算法
该节描述用于处理从诸如液滴的颗粒检测到的偏转和光致发光信号的示例性算法；参见图23a、图23b和图24-图31。该算法是关于液滴描述的，并且用从液滴检测出的示例性信号示出，但是可以用于处理从任何合适的颗粒检测到的信号。本节中公开的算法或其方面的任何合适组合可以存储在第i-viii节的检测和处理系统50的存储器中和/或可以结合到第ix节或本文其他部分公开的任何方法中。
图23a和图23b共同示出可被执行以便执行颗粒分析方法的示例性算法310及其信号处理步骤的流程图(也参见图22)。算法310的步骤可以以任何合适的顺序和组合来执行。
可以检测偏转信号和分析物信号(例如，光致发光信号)，如312处所示。信号检测可以如本文其他部分(诸如在第i-ix部分中)所述那样执行(例如，参见图22的步骤286)。
可以对偏转信号进行滤波，如314处所示。例如，偏转信号可以用基于频率的滤波器滤波，诸如低通滤波器(例如，小于约100、75、50、40、30、20或10khz等)。可以在偏转信号的数字或模拟形式上执行频率滤波。滤波可以降低噪声并且使得能在随后的步骤中识别液滴波形。
可以在偏转信号中识别液滴波形，如316处所示。偏转信号可以包括满足一个或多个条件(诸如满足一个或多个标准(例如，具有预定义的颗粒(液滴)特征))的所需波形，并且还可以包括不满足所有标准的其他波形。识别过程可以将所需波形与其他波形区分开。具有颗粒特征的波形的识别可以如本文其他部分(诸如在第ix节中)(例如，参见图22的步骤288)和本节下文中关于状态机进一步所述那样执行。
可以针对液滴波形计算宽度值，如318处所示。宽度值可以如本文其他部分(诸如在第ix节)(例如，参见图22的步骤290)和本节下文所述那样计算。
可以对光致发光信号的一部分(例如，片段)进行积分以便获得幅度(例如，积分强度，也称为积分强度值)，如在320处指示(并且关于图22的步骤296更多地描述那样)。该片段在时间上与偏转信号中的波形重叠。在与波形的至少一部分相同的时间跨度上检测至少部分或全部片段。可以基于波形的特征(例如，峰)利用时间上对应的波形来限定针对片段的积分边界，如本节下文进一步描述的。
接着可以决定是否继续识别波形，如322处所示。算法310可以基于，例如，是否正在识别液滴波形所用的频率已经改变(增加或减少)超过阈值量和/或是否在至少一对连续的液滴波形之间的一个或多个时间段(或时间间隙)超过阈值或超出范围等来决定。如果答案为否，则算法可以返回到步骤316以识别另一个液滴波形，以便形成环路。如果答案为是，则算法可以停止识别液滴波形(步骤316)并且可选地可以停止检测信号(步骤312)和/或停止使液滴通过检测体积。因此，可以继续执行步骤312，同时循环地执行步骤314、316、318和/或320，直到检测到运行结束。运行的结束可以通过例如供应液滴的乳剂的耗尽、一个或多个气泡引入检测体积、阻止流体流过检测体积的阻塞(障碍)、机械误差等来触发。
接着可以决定是否执行颜色校准，如324处所示。如果答案为是，则算法可以进行到步骤326。如果答案为否，则算法可以跳过颜色校准。算法可以基于例如是否已从用户接收到指示算法跳过颜色校准的输入来决定是否执行颜色校准。在一些情况下，用户可能希望跳过颜色校准，以便在使用特定标签产生信号时测量光致发光信号之间的耦合常数。
可以执行颜色校准，如326处所示。颜色校准可以校正不同光致发光信号之间的耦合(也称为串扰)，其中至少一个光致发光信号受到另一个光致发光信号的影响。例如，耦合可以在用两种或更多种光致发光标记执行的测定中发生，所述光致发光标记可以通过不同的检测器在各自的不同波长(即，在不同的检测通道中)中检测到。在许多情况下，至少一个标记主要可在一个检测通道中检测到，但在一个或多个其他检测通道中如串扰那样可被低效率地检测到。颜色校准通过消除串扰来解耦光致发光信号。因此，颜色校准可以调整在步骤320中从每个光致发光信号获得的幅度，并且可以利用调整后的幅度执行一个或多个后续步骤。
可以调整宽度值，如328处所示。更具体地，可以调整在步骤318中针对波形循环计算的宽度值，以便校正在运行期间通过检测体积的流速的波动(如果有的话)。可以通过监测偏转信号来检测波动。波动通常是不希望的，但可能难以完全防止并且可能由于各种原因而发生。如果在运行期间流过检测体积的流体的流速增加，则每个波形跨越更短的时间段(变得更窄)，从而产生更低的宽度值(和更低的积分光致发光幅度)。或者，如果在运行期间流过检测体积的流体的流速减小，则每个波形跨越更长的时间段(变得更宽)。算法310可以利用样条来调整宽度值。样条可以用不同的函数(诸如不同的多项式函数)分段地调整时间分组的宽度值集。例如，宽度值可以用样条拟合代替，并且拟合的残差可以用于调整宽度值。
可以对液滴进行过滤，如在330处所示。可以单独或以任何合适的顺序和组合执行的示例性过滤步骤在332、334和336处指示。可互换地过滤可以被描述为选通(gating)。过滤过程从算法执行的后续步骤的任何合适组合中排除所选择的液滴和每个信号的相应部分。因此，也可以将过滤过程描述为过滤波形和/或幅度。
可以根据它们对应的宽度值来过滤液滴，如332处所示。可以如针对图22的步骤292所描述的那样执行步骤332。在示例性实施例中，每个宽度值可以与一个范围进行比较，以便排除对应于具有比平均宽度值大出阈值偏差(例如，三个标准偏差)的宽度值的液滴。因此，可以从一个或多个后续步骤中排除对应于所排除的液滴的每个幅度。
也可以根据时间上对应的偏转信号波形的质量对液滴进行过滤，如334处所示。可以排除波形不满足与其宽度值不同的一个或多个标准的液滴，以及来自光致发光信号的相应幅度。这些标准可以包括波形的至少一个局部最大值和局部最小值的比率、波形的局部最大值彼此的比率、波形从其前沿边界到其后沿边界的跨度、波形从其前沿边界到其前峰或其谷的跨度，波形从其谷或后峰到其后沿边界的跨度、波形是否能从相邻波形中很好地分辨(即，从基线开始并返回到基线)等。
还可以或替代地根据满足条件的偏转信号的变化的位置对液滴进行过滤，如336处所示。例如，该变化可以是由(多个)气泡进入流体子系统并行进通过检测体积时产生的气隙引起的突然变化，这可能表明供应液滴的乳剂已经耗尽。空气的引入会导致流速发生显著变化并变得不稳定。在剩余运行的突然变化之后检测到的每个偏转信号波形(以及因此的液滴)、以及来自(多个)光致发光信号的(多个)时间上对应的幅度可以被排除。
可以分配分析物含量，可以对液滴进行计数，并且可以计算至少一种分析物浓度，如338、340和342处所指示。上面针对图22的步骤298、300和302描述了用于执行这些步骤的示例性方法。
图24示出了利用图19的检测和处理系统130的工作模型检测的偏转信号350和荧光信号352、354(通道1(ch1)和通道2(ch2)荧光)的曲线图。这里仅示出了每个信号的短区域，以便说明当单个液滴通过系统130的照射区域时三个信号如何变化。每个信号由一系列时间点组成，这些时间点可以沿时间轴均匀地间隔开。每个时间点可以由时间值和信号值限定。信号值可以分别描述为针对偏转信号和光致发光信号的偏转值或光致发光值。信号值可以是表示为强度的幅度，其可以在减去或不减去背景的情况下表示。信号值可以被组合、平均、调整等以便生成其他信号值。
偏转信号350产生液滴波形246，其在曲线图中上升并返回到基线356。波形246具有前峰248和后峰250，它们是前隆起252(或脉冲)和后隆起254(或脉冲)的相应波峰。例如，每个隆起可以在播出处和周围是圆形的或尖锐的。谷256被限定在时间上在峰中间。在一些实施例中，波形可以具有至少一个附加局部最大值和至少一个附加局部最小值。如本文其他地方所述，可以在波形的任何一对局部最大值(或局部最大值和局部最小值)之间计算分离值。
光致发光信号352、354产生在时间上分别与波形246重叠的脉冲358、360。在该图中，每个脉冲358、360在与波形246大致相同的时间从信号352、354的基线上升并返回到基线。然而，脉冲360比脉冲358小得多，使得该脉冲难以准确地表征，并且在噪声很大的情况下难以可靠地识别。使用偏转波形246来识别每个液滴的时间位置使得允许以更大的置信度识别和表征脉冲360。
图25示出了用于识别偏转信号中存在的液滴(或其他颗粒)波形的示例性状态机370。状态机可以识别偏转信号中的双峰波形。如本节下面进一步描述的，状态机也可以(或者可选地)配置成识别偏转信号中的单峰波形。在任何情况下，可以在检测到偏转信号时实时识别波形，并且可以帮助确定何时停止偏转信号和(多个)光致发光信号的收集。当状态机监视偏转信号的值时，状态机可以变换到多个状态。用于识别双峰波形的示例性状态包括空闲372、头部374、倾斜-1376、倾斜-2378、尾部380、检测到液滴382和假液滴384。用于识别单峰波形的示例性状态可以是用于识别双峰波形的状态的子集，诸如空闲、头部、尾部、检测到液滴和假液滴状态。状态机可以使用不同的标准识别双峰波形和单峰波形。
当状态机被激活时，状态机可以在空闲状态372下开始。状态机370可以保持在空闲状态，直到偏转信号上升超过基线以上的阈值(“头部阈值”)。状态机然后改变到头部状态374。图26示出了对应于波形246的头部状态374的头部或第一上升部分386。上升部分386从波形的前端延伸到局部最大值。状态机可以保持在头部状态，直到找到大于局部最大值阈值的局部最大值，然后转换到倾斜-1状态376，或者如果局部最大值小于局部最大值阈值则改变到假液滴状态384并且返回到空闲状态372。
当偏转信号下降时，状态机370保持在倾斜-1状态376。图26示出了对应于波形246的倾斜-1状态376的第一倾斜或下降部分388。下降部分388从第一局部最大值延伸到局部最小值。状态机可以保持在倾斜-1状态，直到找到小于局部最小值阈值的局部最小值，然后改变到倾斜-2状态378，或者如果局部最小值大于局部最小值阈值则改变为假液滴状态384并且返回到空闲状态372。
当偏转信号上升时，状态机370保持在倾斜-2状态378。图26示出了对应于波形246的倾斜-2状态378的第二倾斜或上升部分390。上升部分390从局部最小值延伸到第二局部最大值。状态机可以保持在倾斜-2状态，直到找到大于局部最大值阈值的局部最大值，然后改变到尾部状态380，或者并且如果局部最大值小于局部最大值阈值则改变到假液滴状态384并且返回到空闲状态372。
当偏转信号下降时，状态机370保持在尾部状态380。图26示出了对应于波形246的尾部状态380的第二下降或尾部部分392。下降部分392从波形的第二局部最大值延伸到尾端。状态机可以保持在尾部状态，直到偏转信号下降到尾部阈值以下，然后改变为检测到液滴状态382并返回到空闲372，或者如果偏转信号未能降至尾部阈值以下则改变到假液滴状态384并且返回到空闲状态372。因此，状态机可以配置或不配置为排除彼此重叠超过阈值量的波形(和相应的液滴)。
状态机还可以被配置为基于任何其他合适的标准(诸如大于阈值的一个局部最大值或者双方、小于阈值的局部最小值等)来排除波形(和相应的液滴)。
图27示出了利用图24的偏转信号350和光致发光信号354创建的一对曲线图。标记该曲线图以便示意性地示出由偏转信号350产生的波形246如何由图23a和图23b的算法310分析以便获得波形的峰到峰分离值258。各个曲线400a、400b可以被拟合到每个隆起252、254的点。每条曲线可以是例如二阶多项式。峰248、250可以由每条曲线各自的最大值限定。曲线拟合的过程相对于选择每个隆起的一个数据点作为局部最大值而言，为每个峰提供更准确的时间值，并因此产生更准确的分离值258。
可以通过相应的偏移402a、402b来调整每个峰248、250的时间值，以便限定用于光致发光信号354的脉冲360的积分边界404a、404b。更具体地，可以从峰248的时间值中减去偏移402a，并且可以将偏移402b加到峰250的时间值，以便限定脉冲360的相应积分边界。每个偏移可以是用于每个波形的固定值，并且偏移402a、402b可以彼此相同或不同。在运行开始之前，可以预定义或不预定义每个偏移量。偏移可以表示从一组波形确定的平均偏移。可以在积分边界404a、404b之间延伸的跨度406上对光致发光信号354进行积分，以便获得积分幅度(积分强度)。
图28-图30示出了一系列曲线图，其示意性地描绘了可以对偏转信号350的波形和从光致发光信号354获得的幅度执行的液滴过滤处理。将每个偏转信号绘制为作为时间的函数的偏转强度(def.int.)。将光致发光信号绘制为作为时间的函数的光致发光强度(plint.)。每个过滤过程基于进一步考虑消除了液滴并因此消除了光致发光信号(和偏转信号)的部分，如信号350的各个波形246和信号354的脉冲360下的“x”所示。过滤过程基于偏转信号350过滤液滴。
图28示出了基于宽度值、即峰到峰分离值258过滤的液滴(经由信号350和354)。在410和412处指示的分离值偏离分离值的平均值超过阈值。时间上对应于产生分离值410、412的波形的液滴、波形和脉冲414、416被排除。
图29示出基于偏转信号350的波形的一个或多个质量度量被过滤的液滴(经由信号350和354)。在418、420处指示的波形各自具有不满足阈值条件的质量度量，其导致与波形418、420和脉冲422、424相关联的液滴被排除。在图29的示例中，波形418具有超过阈值的一对局部最大值的比率。而且，波形420具有超过阈值的局部最大值与局部最小值的比率。在其他实施例中，状态机370可以被配置为执行任何合适的波形的质量过滤，使得不需要额外的质量过滤。可以认为波形的识别仅由状态机370执行或者与附加的质量过滤组合执行。
图30示出基于偏转信号350的波形246之间的周期430过滤的液滴(经由信号350和354)。周期430与波形的频率成反比。超过周期或频率的阈值变化可以导致在变化之后检测到的其余偏转信号和/或光致发光信号被忽略。在图30中，明显更长的周期432导致偏转信号的偏转波形434(以及所有随后的偏转波形，如果有的话)和光致发光脉冲436(以及所有随后的光致发光脉冲)被忽略。
图31示出相对于图28而言不太严格的方法，用于识别液滴波形和过滤波形，以便基于进一步的考虑排除相应液滴的子集。图31的方法允许更宽尺寸范围的液滴被用于计算分析物含量。在图28中，每个液滴在偏转信号中产生双峰波形，并且只有双峰波形(以及由此相应的液滴)的一个子集被认为具有从每个波形内的峰到峰测量出的可接受的宽度值。然而，液滴的尺寸在乳剂内或乳剂中可能变化太大，从而仅接受产生双峰波形的液滴来用于计算分析物含量。否则，太多的液滴(和整个乳剂)可能对于分析物分析无用。
图31示出一对曲线图，其示意性地描绘了在相同时间段内从连续通过通道的照射区域的液滴(或其他颗粒)检测到的偏转信号350和光致发光信号354。偏转信号350包括由一系列液滴产生的颗粒波形440a至440e。光致发光信号表示分析物并且具有一系列信号脉冲442a至442e，其也由一系列液滴产生并且在时间上对应于波形。
由于液滴体积的变化，波形440a、440c和440d是双峰波形，包括大致相同幅度的一对局部最大值。相反，波形440b和440e是仅具有一个局部最大值的单峰波形。双峰波形可以由较大的液滴产生，而单峰波形可以由较小的液滴产生。
两种类型的波形可以通过上面针对图25描述的状态机的修改版本来识别。特别地，状态机可以在偏转信号中寻找满足各组标准的双峰波形和单峰波形。在一些情况下，状态机可以搜索偏转信号的每个连续部分以获得双峰波形，并且如果搜索不成功，则搜索单峰波形。
可以为每个颗粒波形440a至440e计算各自的宽度值444a至444e。宽度值可以描述为波形宽度并且示意性地示出。可以以相同幅度在相应波形的前沿时间点446和后沿时间点448之间测量每个宽度。(时间点446和448在每个波形中通过虚线450连接。)用于测量每个宽度的幅度可以例如与波形的特性幅度成比例(可选地在从两个幅度减去基线之后)。在所描绘的实施例中，用于每个波形的宽度测量的相应幅度是在时间点452处的特性幅度的恒定分数，在该时间点452处波形的前沿区域454的斜率达到最大值。前沿区域454至少大致从基线上升到波形的第一(或唯一)局部最大值。
如上所述，可以过滤宽度值444a至444e以便排除在可接受的尺寸范围之外的液滴。宽度值偏离宽度值的平均值超过阈值的液滴可以排除并且不会有助于测定的最终结果。例如，波形440b具有低于可接受的最小宽度值的宽度值，如波形440b和时间上对应的光致发光脉冲442b下的“x”所示。因此，脉冲442b对分配为对于分析物为阳性或阴性的液滴的数量或液滴总数没有贡献。可以在任何合适的时间来执行基于进一步考虑的波形440b、脉冲442b和/或相应液滴的排除。
可以从脉冲442a、442c、442d和442e获得幅度，诸如通过光致发光信号的积分。如上所述，用于每个脉冲的积分的边界可以是用于计算相应偏转波形的宽度值的前沿时间点和后沿时间点，可选地具有到每个时间点的时间偏移。可以将幅度与至少一个阈值进行比较，以便将每个液滴分配为对于分析物为阳性或阴性。可以对对于分析物为阳性或阴性的液滴的数量进行计数，并且可以对液滴的总数进行计数。每个数量可以不表示不满足如上所述的一个或多个标准的任何液滴。可以使用液滴的数量和体积来计算分析物的浓度。
xi.示例
以下实施例描述了与颗粒测定的检测和信号处理有关的本公开的所选方面和实施方案。为了说明而包括了这些示例，且这些示例并不旨在限定本公开的范围。
示例1.检测和处理系统的其他光学方面
该示例描述了检测和处理系统的其他示例性光学方面。
检测和处理系统可以基于被颗粒(诸如液滴)偏转的任何可检测波长的聚焦光，同时该颗粒处于检测体积中。对于光学透明颗粒的情况，可以起到至少三种机制(例如，米氏散射、折射和反射)的作用。偏转光的检测可伴随测量源自颗粒(诸如液滴)内的染料分子的荧光强度。相同的光源可用于产生偏转和荧光信号，因此来自光源的光辐射可称为激发光。同步获取的偏转和荧光信号的处理增加了每个颗粒的荧光信号的幅度和跨度的准确度，特别是对于仅具有弱(或没有)荧光的颗粒。
检测和处理系统基于在准直的激发光被物镜聚焦到检测体积之前阻挡一部分该准直的激发光。空气狭缝和由准直透镜和聚焦物镜产生的放大率可以限定流动通道内的检测体积。线掩模可以位于聚焦物镜的后焦平面处，或者当后焦平面不可接近时，尽可能靠近它。大多数大放大倍率物镜的后焦平面它们的主体内。使用由细的直黑线构成的线掩模进行测试。线安装在聚焦物镜的后孔上。线的方向与空气狭缝的方向对齐。聚焦物镜在检测体积后面一定距离处产生线掩模的像。线掩模越接近物镜的后焦平面，检测体积与线掩模像之间的距离越大；当线遮掩模正好位于物镜后焦平面时，像产生在无穷远处。因此，在流动通道的后侧的外侧(即，图1中的通道60的右侧)，存在由线掩模产生的阴影区域。另一个空气狭缝可以阻挡阴影区域外的光，并且光检测器可以检测空气狭缝正后方的光强度。
可以选择偏转检测器前面的空气狭缝使其宽度略窄于线掩模像，并且其方向可以与线掩模像的方向对齐。因此，偏转检测器保持在黑暗中直到颗粒进入检测体积。颗粒的存在改变了穿过检测体积的光路，并且一些光到达偏转检测器，产生偏转信号。
所公开的检测方案不同于许多流式细胞仪中使用的前向散射通道的布局。在前向散射的情况下，用相对长焦距的透镜(例如，50-100mm)聚焦到流动通道中的窄激光束完全被通道另一侧的不透明光阑阻挡，而在光阑周围检测到小角度散射光。
与具有前向散射通道的流式细胞仪相比，本文公开的检测和处理系统具有各种优点。首先，可能不需要使用高质量的激光束，即既窄又良好准直的光束。相反，本文公开的检测和处理系统使用耦合到多模光纤的低成本、高功率led以及耦合到相同的多模光纤的二极管激光器进行测试，并且证明与不同光源具有相当的性能。实际上，如本文所述，可以耦合到大芯光纤中然后准直的任何光源可以适合于检测偏转光。其次，可能不需要使用第二物镜来收集荧光。在许多流式细胞仪器中，相对于激发激光光路以90度安装的单独的高数值孔径物镜收集由荧光发射的光。本公开的聚焦物镜可以被配置为具有短工作距离和高数值孔径，这允许构造落射荧光共聚焦布局，如图1所示，其中相同物镜将照射/激发光束聚焦在检测体积并收集荧光发出的光。在落射荧光共聚焦模式下获得图21中所示的记录荧光幅度。
主物镜后孔处的黑线掩模在流动芯(限定流动通道的平面构件)的相对侧处在照射区域中产生阴影。阴影半角为2度。在其前面有空气狭缝的光电二极管通常留在阴影中。一旦液滴进入检测体积，液滴就会使一些激发光偏转，这些激发光通过狭缝并产生光电流。由于液滴直径与波长之比约为100，mie理论预测在高于2度的角度下可忽略不计的散射，因此检测机制可能基于液滴“透镜”，因为水的折射率(1.33)低于硅油(1.39)。由于用作负屈光柱面透镜的圆形流动通道，掩模优选地可以是长线，使得圆形斑点掩模(点掩模)产生较少的阴影。掩模不会干扰望远镜的狭缝的像形成，即，检测区域仍然是锐利的、均匀照射的线。由掩模遮挡的激发光和荧光引起的总光损失可以保持在5％、4％、3％或2％以下等。
示例2.信号处理其他方面
该示例描述了信号处理的其他示例性方面。本公开提供了用于分析从诸如液滴的颗粒检测到的数据的方法和装置。在一些实施例中，该方法和装置包括和/或利用用于识别液滴位置和表征来自偏转信号的液滴峰的算法。
本公开提供了使用从液滴收集的数据自动确定液滴位置、尺寸和一个或多个荧光通道中的荧光信号值的方法。示例性方法包括：a)提供算法以便确定来自偏转信号的液滴的时间位置，b)根据偏转信号计算每个液滴的尺寸特性，c)利用偏转信号计算每个液滴的一个或多个荧光通道的信号值，和d)提供液滴表征信息来用于进一步分析，包括通过对信号值应用选通、阈值/聚类来过滤/选通液滴。
利用偏转信号的算法可以包括以下步骤。首先，可以通过识别偏转信号中的液滴波形的特征来检测液滴的峰。可以利用多个特征(例如，单个液滴的双峰、前沿和后沿等)来识别液滴。一旦找到液滴特征，就计算液滴位置。其次，可以基于偏转信号中的液滴的两个峰值之间的距离，或者液滴波形的前沿和后沿(端)之间的时间距离来计算液滴尺寸特性。第三，可以通过用减去基线对每个荧光信号进行积分来确定每个荧光通道中的液滴幅度。第四，算法可以重复前面的三个步骤，直到它完成分析数据中的所有波形。第五，该算法可以对不同荧光通道的液滴幅度应用颜色校准，以便解耦它们之间的串扰。之后可以应用宽度校正、选通和聚类以便进行进一步的数据分析。
示例3.所选实施例a
本示例将本公开的所选择的实施例描述为一系列有索引的段落。这些实施例不应该限制本公开的整个范围。
段落1一种用于检测和处理来自颗粒的信号的系统，包括：(a)两个或更多个检测器，所述检测器被配置为检测来自通过检测体积的颗粒的至少一个光致发光信号和偏转信号；(b)处理器，所述处理器被配置为(i)识别所述偏转信号中的波形，所述波形的至少一个子集具有颗粒特征，所述颗粒特征包括与进入和离开所述检测体积的颗粒相对应的一对峰，(ii)获得在时间上对应于来自每个光致发光信号的多个波形中的每一个的幅度，以及(iii)基于所述幅度的至少一个子集确定具有给定分析物含量的颗粒的数量。
段落2如段落1所述的系统，其中所述处理器被配置为获得针对各个波形的表征值，并从基于所述表征值确定的所述数量中排除颗粒。
段落3如段落2所述的系统，其中具有颗粒特征个体波形的波形的至少一个子集的表征值是表示个体波形的所述一对峰之间的时间间隔的分离值。
段落4如段落2或3所述的系统，其中所述处理器被配置为调整从所述多个个体波形获得的所述表征值，以便在检测到所述信号时校正通过所述检测体积的流速的波动，并基于调整后的表征值排除颗粒。
段落5如段落4所述的系统，其中所述处理器被配置为用样条调整所述表征值。
段落6如段落2所述的系统，其中每个个体波形的所述表征值是所述个体波形的所述一对峰之间的至少一个峰与局部最小值的比率。
段落7如段落2至6中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为将每个表征值与阈值进行比较，并且如果所述表征值超过所述阈值则排除对应于所述表征值的颗粒。
段落8如段落2至7中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为计算所述表征值的平均值，并且排除偏离所述平均值超过阈值的表征值所对应的颗粒。
段落9如段落8所述的系统，其中所述处理器被配置为基于所述表征值相对于所述平均值的分布来计算所述阈值。
段落10如段落9所述的系统，其中所述处理器被配置为计算所述表征值的标准偏差，并基于所述标准偏差计算所述阈值。
段落11如段落1至10中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为利用状态机实时识别波形。
段落12如段落1至11中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为通过基于利用所述多个波形中的一个限定的积分边界对光致发光信号的一部分进行积分来获得每个幅度，可选地使用所述一个波形的至少一个峰的时间位置来限定至少一个边界。
段落13一种用于检测和处理来自颗粒的信号的系统，包括：(a)两个或更多个检测器，所述检测器被配置为检测来自通过检测体积的颗粒的至少一个光致发光信号和偏转信号；(b)处理器，所述处理器被配置为(i)识别所述偏转信号中的波形，每个波形具有颗粒特征，所述颗粒特征包括对应于进入和离开所述检测体积的颗粒的一对峰，(ii)获得多个个体波形的峰到峰分离值，(iii)至少部分地基于所述分离值排除颗粒，(iv)获得在时间上与来自每个光致发光信号的多个波形中的每一个对应的幅度，以及(v)基于所述幅度的至少一个子集确定具有给定的分析物含量的未排除颗粒的数量。
段落14如段落13所述的系统，其中所述处理器被配置为使用仅表示未排除颗粒的幅度来确定对于分析物为阳性或者为阴性的颗粒的数量。
段落15如段落13或14所述的系统，其中所述处理器被配置为利用状态机识别波形。
段落16如段落15所述的系统，其中所述状态机包括表示波形的第一上升部分、第一下降部分、第二上升部分和第二下降部分的四个状态。
段落17如段落13至16中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为在检测到所述信号时实时识别波形。
段落18如段落13至17中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为当所述偏转信号中的波形的频率或波形之间的周期满足条件时，停止使来自同一组乳剂的颗粒通过所述检测体积。
段落19如段落13至18中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为将一对曲线拟合到所述多个个体波形中的每一个，限定表示所述个体波形的所述一对峰的所述曲线的一对点，并针对所述个体波形将所述分离值计算为所述一对点之间的时间差。
段落20如段落19所述的系统，其中每条曲线由二阶多项式限定。
段落21如段落13至30中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为对每个光致发光信号的部分进行积分以便获得所述幅度，并且其中每个幅度可选地表示减去背景后的经积分强度。
段落22如段落13至21中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为为所述多个波形中的每一个限定前沿边界和后沿边界，并且在所述前沿边界和所述后沿边界之间限定的间隔上对每个光致发光信号进行积分以便获得对应于来自所述光致发光信号的波形的幅度，并且其中，可选地，每个边界限定在沿着时间轴距离所述波形的峰的固定距离处。
段落23如段落13至22中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为调整从所述多个个体波形计算出的所述分离值，以便校正在检测到所述信号时通过所述检测体积的流速的波动，并且其中所述处理器被配置为在调整完所述分离值后基于所述分离值排除颗粒。
段落24如段落23所述的系统，其中所述处理器被配置为用样条调整所述分离值。
段落25如段落13至24中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为计算所述分离值的平均值，并且排除在时间上对应于偏离所述分离值的所述平均值超过阈值的分离值的每个颗粒。
段落26如段落25所述的系统，其中所述处理器被配置为基于所述分离制值相对于所述分离值的所述平均值的分布来计算所述阈值。
段落27如段落26所述的系统，其中所述处理器被配置为计算所述分离值的标准偏差，并基于所述标准偏差计算所述阈值。
段落28如段落27所述的系统，其中通过将所述标准偏差乘以值来计算所述阈值。
段落29如段落13至28中任一段所述的系统，其中所述处理器还被配置为在确定所述数量之前基于除所述分离值之外的一个或多个波形标准来排除颗粒。
段落30如段落13至29中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为至少部分地通过使用所述幅度的至少一个子集将多个个体颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性来确定所述数量。
段落31如段落30所述的系统，其中所述处理器被配置为将多个所述幅度中的每一个与至少一个阈值进行比较，并基于比较所述多个幅度中的每一个来将多个个体颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性。
段落32如段落13至31中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为使用所确定的数量来计算分析物的浓度。
段落33一种检测和处理来自颗粒的信号的方法，所述方法包括：(a)检测来自通过检测体积的颗粒的至少一个光致发光信号和偏转信号；(b)识别所述偏转信号中的波形，每个波形具有颗粒特征，所述颗粒特征包括与进入和离开所述检测体积的颗粒相对应的一对峰；(c)获得在时间上对应于来自每个光致发光信号的多个所述波形中的每一个的幅度；以及(d)基于所述幅度的至少一个子集确定具有给定分析物含量的颗粒的数量。
段落34如段落33所述的方法，还包括获得多个个体波形的表征值的步骤、以及从基于所述表征值确定的所述数量中排除颗粒的步骤。
段落35如段落34所述的方法，其中每个波形的所述表征值是表示所述波形的所述一对峰之间的时间间隔的分离值。
段落36如段落34或35中任一段所述的方法，还包括调整从所述波形计算出的所述表征值以便在检测到所述信号时校正通过所述检测体积的流速的波动的步骤，其中排除颗粒的步骤使用调整后的表征值。
段落37如段落36所述的方法，其中调整所述表征值的步骤包括利用样条调整所述表征值的步骤。
段落38如段落34所述的方法，其中每个单独波形的所述表征值是涉及所述个体波形的所述一对峰之间的至少一个峰与局部最小值的比率。
段落39如段落34至38中任一段所述的方法，其中排除颗粒的步骤包括将每个表征值与阈值进行比较的步骤、以及如果所述表征值超过所述阈值则排除对应于所述表征值的颗粒的步骤。
段落40如段落34至39中任一段所述的方法，还包括计算所述表征值的平均值的步骤，其中排除颗粒的步骤包括排除在时间上对应于偏离所述平均值超过阈值的表征值的颗粒的步骤。
段落41如段落40所述的方法，还包括基于所述表征值相对于所述平均值的分布来计算所述阈值的步骤。
段落42如段落41所述的方法，还包括计算所述特征值的标准偏差的步骤、以及基于所述标准偏差计算所述阈值的步骤。
段落43如段落33至42中任一段所述的方法，其中利用状态机来实时执行识别波形的步骤。
段落44如段落33至43中任一段所述的方法，其中获得幅度的步骤包括通过基于利用所述多个波形中的一个限定的积分边界对光致发光信号的一部分进行积分的步骤，可选地使用所述一个波形的至少一个峰的时间位置来限定至少一个边界。
段落45如段落33至44中任一段所述的方法，还包括当波形的频率或波形之间的周期满足条件时阻止来自同一乳剂的颗粒通过所述检测体积的步骤。
段落46一种检测和处理来自颗粒的信号的方法，所述方法包括：(a)检测来自通过检测体积的颗粒的至少一个光致发光信号和偏转信号；(b)识别所述偏转信号中的波形，每个波形具有颗粒特征，所述颗粒特征包括对应于进入和离开所述检测体积的颗粒的一对峰；(c)计算多个个体波形的峰到峰分离值，(d)至少部分地基于所述分离值排除颗粒；(e)获得在时间上与来自每个光致发光信号的多个波形中的每一个对应的幅度；以及(f)基于所述幅度的至少一个子集确定具有给定的分析物含量的未排除颗粒的数量。
段落47如段落46所述的方法，其中确定数量的步骤包括使用仅表示未排除颗粒的幅度来确定对于分析物为阳性或者为阴性的颗粒的数量的步骤。
段落48如段落46或47所述的方法，其中利用状态机来执行识别波形的步骤。
段落49如段落46至48中任一段所述的方法，其中在检测到所述信号时实时地执行识别波形的步骤。
段落50如段落46至49中任一段所述的方法，还包括当波形的频率或波形之间的周期满足条件时阻止颗粒通过所述检测体积的步骤。
段落51如段落46至50中任一段所述的方法，还包括将一对曲线拟合到所述多个个体波形的每一个的步骤、以及限定表示所述一对峰的所述曲线的一对点的步骤，其中计算峰到峰分离值的步骤包括计算所述一对点之间的时间差的步骤。
段落52如段落46至51中任一段所述的方法，其中获得幅度的步骤包括对每个光致发光信号的部分进行积分以便获得所述幅度的步骤，并且其中每个幅度可选地表示减去背景后的经积分强度。
段落53如段落46至52中任一段所述的方法，还包括为所述多个波形中的每一个限定前沿边界和后沿边界的步骤，并且获得幅度的步骤包括在所述前沿边界和所述后沿边界之间限定的间隔上对每个光致发光信号进行积分的步骤，并且其中，可选地，每个边界限定在沿着时间轴距离所述波形的峰的固定距离处。
段落54如段落46或53中任一段所述的方法，还包括调整从所述多个个体波形计算出的所述分离值以便在检测到所述信号时校正通过所述检测体积的流速的波动的步骤，其中排除颗粒的步骤使用调整完所述分离值后的分离值。
段落55如段落54所述的方法，其中调整所述分离值的步骤包括利用样条调整所述分离值的步骤。
段落56如段落46至55中任一段所述的方法，还包括计算所述分离值的平均值的步骤，其中排除颗粒的步骤包括排除在时间上对应于偏离所述平均值超过阈值的分离值的颗粒的步骤。
段落57如段落56所述的方法，还包括基于所述分离值的分布来计算所述阈值的步骤。
段落58如段落57所述的方法，还包括从所述分离值计算标准偏差的步骤、以及基于所述标准偏差计算所述阈值的步骤。
段落59如段落58所述的方法，其中计算所述阈值的步骤包括将所述标准偏差乘以常数的步骤。
段落60如段落46至59中任一段所述的方法，其中排除颗粒的步骤包括基于除所述分离值之外的一个或多个波形标准来排除颗粒的步骤。
段落61如段落46-60中任一段所述的方法，其中确定数量的步骤包括将多个个体颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性的步骤。
段落62段落61的方法，其中分配步骤包括将多个幅度中的每一个与至少一个阈值进行比较的步骤、以及基于所述比较步骤将多个个体颗粒分配为阳性或阴性的步骤。
段落63如段落46至62中任一段所述的方法，还包括使用所确定的数量计算分析物浓度的步骤。
段落64如段落46至63中任一段所述的方法，还包括当波形的频率或波形之间的周期满足条件时阻止来自同一乳剂的颗粒通过所述检测体积的步骤。
示例4.所选实施例b
本示例将本公开的其他所选择的实施例描述为一系列有索引的段落。这些实施例不应该限制本公开的整个范围。
段落1一种检测和处理来自颗粒的信号的方法，所述方法包括：(a)使颗粒通过通道的区域，其中每个颗粒包括标记，并且仅所述颗粒的一个子集包括分析物；(b)用至少一个光源产生的光照射所述区域，其中所述光与所述颗粒的相互作用使一部分所述光偏转并从所述标记引起光致发光；(c)用一对检测器检测来自所述区域的偏转信号和光致发光信号；(d)识别所述偏转信号中的颗粒波形，所述颗粒波形对应于各个颗粒，所述颗粒波形的至少一个子集是双峰波形，包括对应于进入和离开所述区域的颗粒的一对峰；(e)从所述光致发光信号获得幅度，所述幅度对应于各个颗粒以及它们的颗粒波形，所述幅度的至少一个子集对应于所述双峰波形；以及(f)基于对应的幅度将各个颗粒分配为对于所述分析物为阳性或阴性。
段落2如段落1的方法，还包括确定分配为对于所述分析物为阳性或分配为对于所述分析物为阴性的颗粒的数量的步骤。
段落3如段落1或段落2所述的方法，还包括计算所述颗粒波形的相应宽度值的步骤、以及基于所述相应宽度值排除所述颗粒的子集的步骤。
段落4如段落3所述的方法，还包括确定分配为对于所述分析物为阳性或分配为对于所述分析物为阴性的颗粒的数量的步骤、以及使用所述颗粒的所述数量和总数计算所述分析物的浓度的步骤，并且其中所排除的所述颗粒的所述子集既不贡献于分配为对于所述分析物为阳性或对于所述分析物为阴性的所述数量，也不贡献于所述总数。
段落5如段落3或段落4所述的方法，还包括调整从所述颗粒波形计算的所述宽度值以便获得调整后的宽度值的步骤，所述调整后的宽度值校正在检测到所述信号时通过所述区域的流速的波动，其中所述排除步骤基于所述调整后的宽度值，并且其中根据所述偏转信号确定所述流速的波动。
段落6如段落3至5中任一段所述的方法，还包括确定所述偏转信号的相应幅度的步骤，在该幅度下，基于所述波形的特性计算每个波形的所述宽度值。
段落7如段落6所述的方法，其中所述偏转信号的所述相应幅度是第一幅度，其中所述波形的所述特性是所述偏转信号的第二幅度，在该第二幅度处，所述偏转信号的斜率在所述波形的至少一个区域内处于最大值，还包括使用所述第二幅度计算所述第一幅度的步骤。
段落8如段落3至7中任一段所述的方法，还包括将每个宽度值与至少一个阈值进行比较的步骤、以及如果所述比较步骤满足预定义条件则排除对应于所述宽度值的颗粒的步骤。
段落9如段落8所述的方法，还包括计算所述宽度值的平均值的步骤，其中排除所述颗粒的子集的步骤包括排除对应于偏离所述平均值超过限定量的宽度值的颗粒的步骤。
段落10如段落9所述的方法，还包括基于所述宽度值相对于所述平均值的分布来计算所述限定量的步骤。
段落11如段落9或段落10所述的方法，还包括计算所述宽度值的标准偏差的步骤、以及基于所述标准偏差计算所述限定量的步骤。
段落12如段落1至11中任一段所述的方法，其中所述识别颗粒波形的步骤包括实时识别所述颗粒波形的双峰波形的步骤。
段落13如段落1至12中任一段所述的方法，其中所述识别颗粒波形的步骤包括利用状态机识别双峰波形的步骤，所述状态机包括表示所述双峰波形的第一上升部分、第一下降部分、第二上升部分、以及第二下降部分的四个状态。
段落14如段落1至13中任一段所述的方法，其中所述识别颗粒波形的步骤包括识别双峰波形和单峰波形的步骤。
段落15如段落14所述的方法，其中所述识别双峰波形和单峰波形的步骤包括使用双峰标准识别双峰波形的步骤和使用与所述双峰标准中的任何一个均不同的至少一个单峰标准识别单峰波形的步骤。
段落16如段落1至15中任一段所述的方法，其中获得幅度的步骤包括通过在用相应的颗粒波形限定的积分边界之间对所述光致发光信号的一部分进行积分来计算每个幅度的步骤。
段落17如段落16所述的方法，还包括计算所述颗粒波形的相应宽度值的步骤、以及使用一对时间点为所述光致发光信号的所述部分建立积分边界的步骤，其中从所述一对时间点计算用于所述相应颗粒波形的所述宽度值。
段落18如段落17所述的方法，其中建立所述积分边界的步骤包括将时间偏移应用于所述一对时间点的每个时间点的步骤。
段落19如段落1至18中任一段所述的方法，还包括当所述偏转信号中的颗粒波形的频率或颗粒波形之间的周期满足条件时阻止来自同一组颗粒的颗粒通过所述区域的步骤。
段落20如段落1-19中任一段所述的方法，其中所述区域具有平行于颗粒行进通过所述区域的方向而测量到的宽度，其中所述颗粒具有在每个颗粒通过所述区域时平行于颗粒行进的所述方向而测量到的尺寸，并且其中所述区域的所述宽度小于所述颗粒的所述尺寸。
段落21一种用于检测和处理来自颗粒的信号的系统，包括：(a)通道；(b)一个或多个光源，所述一个或多个光源配置成照射所述通道内的区域；(c)至少一个正/负压源，所述至少一个正/负压源配置成驱动载液中的颗粒通过所述区域；(d)偏转检测器，所述偏转检测器被配置为检测来自通过所述区域的颗粒的偏转信号；(e)光致发光检测器，所述光致发光检测器被配置为检测来自通过所述区域的颗粒的光致发光信号；(f)处理器，所述处理器被配置为(i)识别所述偏转信号中的颗粒波形，所述颗粒波形的至少一个子集是双峰波形，包括对应于进入和离开所述区域的颗粒的一对峰，(ii)从所述光致发光信号获得幅度，所述幅度对应于各个颗粒及它们的颗粒波形，所述幅度的至少一个子集对应于所述双峰波形，并且(iii)基于对应的所述幅度将多个个体颗粒分配为对于分析物为阳性或阴性。
段落22如段落21所述的系统，其中所述处理器被配置为计算针对所述颗粒波形的相应宽度值，并基于所述相应宽度值排除所述颗粒的子集。
段落23如段落22所述的系统，其中所述处理器被配置为为每个颗粒波形定义前沿边界和后沿边界，并且在所述波形的所述前沿边界和所述后沿边界之间限定的间隔上对所述光致发光信号进行积分以便获得所述振幅中的一个，并且其中每个边界限定在沿着时间轴距离一对时间点中的一个时间点的固定距离处，其中利用所述一对时间点计算每个对应宽度值。
段落24如段落22或段落23所述的系统，所述处理器被配置为对于所述分析物为阳性或分配为对于所述分析物为阴性的颗粒的数量，并使用所述颗粒的所述数量和总数计算所述分析物的浓度，并且其中所排除的所述颗粒的所述子集既不贡献于对于所述分析物为阳性或对于所述分析物为阴性的所述数量，也不贡献于所述总数。
段落25如段落22至24中任一段所述的系统，所述处理器被配置为调整从所述颗粒波形计算的所述宽度值以便获得调整后的宽度值，所述调整后的宽度值校正在检测到所述信号时通过所述区域的流速的波动，并且所述处理器被配置为基于所述调整后的宽度值排除所述颗粒的所述子集，并且其中根据所述偏转信号确定所述流速的波动。
段落26如段落25所述的系统，其中所述处理器被配置为用样条调整所述宽度值。
段落27如段落22至26中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为确定所述偏转信号的幅度，在该幅度下，基于所述波形的特性计算针对每个波形的所述宽度值。
段落28如段落27所述的系统，其中所述幅度是第一幅度，其中波形的特性是所述偏转信号的第二幅度，在该第二幅度处，所述偏转信号的斜率沿着所述波形的区域处于最大值，并且其中所述处理器被配置为使用所述第二幅度计算所述第一幅度。
段落29如段落22至28中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为将每个宽度值与至少一个阈值进行比较，并且如果将所述宽度值与至少一个阈值进行比较满足预定义条件，则排除对应于所述宽度值的颗粒。
段落30如段落29所述的系统，其中所述处理器可以被配置为计算所述宽度值的平均值，并且排除对应于偏离所述平均值超过限定量的宽度值的颗粒。
段落31如段落30所述的系统，其中所述处理器被配置为基于所述宽度值相对于所述平均值的分布来计算所述限定量。
段落32如段落21至31中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为实时识别所述颗粒波形的所述双峰波形。
段落33如段落21至32中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为利用状态机识别所述颗粒波形的所述双峰波形，所述状态机包括表示双峰波形的第一上升部分、第一下降部分、第二上升部分、以及第二下降部分的四个状态。
段落34如段落21至33中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为识别作为颗粒波形的双峰波形和单峰波形。
段落35如段落34所述的系统，其中所述处理器被配置为使用至少一个不同的标准来相对于单峰波形识别双峰波形。
段落36如段落21至35中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为通过在用相应的颗粒波形限定的积分边界之间对所述光致发光信号的一部分进行积分来获得每个幅度。
段落37如段落36所述的系统，所述处理器被配置为计算针对所述颗粒波形的相应宽度值，并且其中使用一对时间点针对所述光致发光信号的所述部分建立所述积分边界，其中从所述一对时间点计算针对所述相应的颗粒波形的所述宽度值。
段落38如段落37所述的系统，其中所述处理器被配置为将时间偏移应用于所述一对时间点的每个时间点来建立所述积分边界。
段落39如段落21至38中任一段所述的系统，其中所述处理器被配置为当所述偏转信号中的颗粒波形的频率或离子波形之间的周期满足条件时，停止使来自同一组颗粒的颗粒通过所述区域。
本文中用于描述规定值的术语“约”是指该规定值的10％以内。例如，尺寸描述为“约10”指该尺寸大于9并且小于11。
以下的权利要求特别地指出视为新颖的以及非显而易见的某些组合以及子组合。可以在要求该申请或相关申请的优先权的申请中请求保护特征、功能、元素和/或特性的其他组合以及子组合中体现的发明。这些权利要求无论是针对不同发明还是针对同一发明，以及无论相对于原始权利要求的范围更宽、更窄、相等或不同，也被认为包括在本公开的本发明的主题内。此外，除非另有具体说明，否则用于所标识元素的诸如第一、第二或第三的顺序指示符用于区分元素，并且不指示这些元素的特定位置或顺序。
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