一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种黄曲霉毒素的适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和纯化柱利用黄曲霉毒素b1的核酸适配体，修饰后通过共价键连接固相载体上。再用此载体填料装柱，制备成适配体亲和柱。该亲和柱具有特异性强，黄曲霉毒素纯化效率高和使用简便的特点。

背景技术：

黄曲霉毒素（aflatoxin，aft）主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题。黄曲霉毒素是一类毒性极强的物质，具有强致癌性和强免疫抑制性。1993年aft被世界卫生组织（who）的癌症研究机构划定为i类致癌物。黄曲霉毒素广泛的分布于发霉的粮食及其制品中，特别是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳制品，发霉的饲料中也有发现含有较多的黄曲霉毒素。迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2等17种结构相似且特征已知的化合物。其中黄曲霉毒素b1是（aftb1）是自然发生潜力最大、最为常见的一种毒素。是黄曲霉毒素中的主要成份。其毒性和致癌性也最强。

世界各国和地区均制定了严格的aft限量标准，且限量要求日益严格。

目前黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（hplc）、酶联免疫吸附法（elisa）、放射免疫分析法、微柱法等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测黄曲霉毒素的方法，但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间较多，容易受到杂质的干扰。比较适合黄曲霉毒素的定性检测。

放射免疫分析法由于使用到放射性元素，容易造成放射性污染，目前已经很少人使用。酶联免疫分析法操作简便，使用较为安全。但由于酶本身不稳定，用此方法检测有可能带来一定的假阳性和假阴性的问题。微柱法主要用于快速筛选出超标样本，很难对毒素进行种类区分和定量检验。仅仅适用于定性检测。

高效液相色谱法在操作上较为简便，可同时检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量的样品分析。但是高效液相色谱检测收到前期样本处理的限制，只有前期将样本进行纯化才能得到更好的检测结果。而免疫亲和纯化柱很好的解决了这一问题。利用免疫亲和纯化柱和高效液相色谱联用能快速、准确的得到结果，并且灵敏度很高。目前已经被国家标准gb/t18979-2003采用。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为dna或者rna序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[science287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[song.trendsanaly.chem2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利cn105505940a中，描述了一种黄曲霉毒素b1的适配体dna传感器。通过黄曲霉毒素b1的适配体，及多条互补探针序列制备dna传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素b1的检测。在专利cn105400790a中，描述了一种黄曲霉毒素的检测方法。利用黄曲霉毒素b1的适配体与蔗糖酶结合，通过酶与糖底物的相互作用，依靠血糖仪实现黄曲霉毒素b1的检测。上述都是利用黄曲霉毒素适配体实现毒素的检测。

在毒素分离中，专利cn104651369a中描述了一种黄曲霉毒素磁性分离方法，将黄曲霉毒素b1核酸适配体序列与磁珠结合，实现分离。在专利cn104399283中，描述了一种黄曲霉毒素b1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素b1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

在本发明中，我们利用selex系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的黄曲霉毒素b1的dna适配体。适配体修饰后与n-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到黄曲霉毒素b1的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的黄曲霉毒素毒素b1适配体亲和柱

该亲和柱操作简便，纯化黄曲霉毒素毒素效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的黄曲霉毒素毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：

本发明最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对黄曲霉毒素b1的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列

核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性

以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，黄曲霉毒素毒素结合量大，纯化效率高的特点。

黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法说明如下

1.载体活化

选择n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）修饰的琼脂糖载体sepharose4b，进行活化

取1gn-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mmhcl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗涤3次。加入20mol/l的氨基修饰的黄曲霉毒素b1适配体，室温偶联8小时

3.将偶联好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

4.封闭

将偶联好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室温反应2小时

5.将封闭好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

6.装柱

将黄曲霉毒素b1—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的黄曲霉毒素b1亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的黄曲霉毒素b1核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的黄曲霉毒素，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高

核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合真菌毒素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低

此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本发明使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别

3.使用本发明纯化黄曲霉毒素操作简便，几步就可以得到纯度较高的黄曲霉毒素。更方便操作者使用

4.使用本发明的产品得到的黄曲霉毒素纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1：黄曲霉毒素适配体亲和柱结构组份示意图

a：进样口塞；b：活塞适配器；c：稳定箍；d：上筛板；e：柱体；f：载体填料；g：下筛板；h：出样口堵头

图2：黄曲霉毒素适配体亲和柱外观结构图

a：进样口塞；b：活塞适配器；c：稳定箍；d：上筛板；e：柱体；f：载体填料；g：下筛板；h：出样口堵头

图3：玉米样品中加入黄曲霉毒素b1标准品的液相色谱检测图

图4：饲料样品中加入黄曲霉毒素b1标准品的液相色谱检测图

图5：酱油中加入黄曲霉毒素b1的液相色谱检测图。

具体实施方式

实施例1：利用氨基修饰的黄曲霉毒素b1适配体制备亲和柱

本发明制备黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.选择n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）修饰的琼脂糖载体sepharose4b，进行活化

2.取1gn-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mmhcl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

3.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗涤3次。加入20mol/l的氨基修饰的黄曲霉毒素b1适配体，室温偶联8小时

4.将偶联好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

5.封闭

将偶联好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室温反应2小时

6.将封闭好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

7.将黄曲霉毒素b1—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的黄曲霉毒素b1亲和纯化柱

8.装柱

将交联后的黄曲霉毒素b1-琼脂糖凝胶用10毫升20mmpbsph7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlpbs，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器有一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlpbs，将注射器接在进样口上，缓慢的将pbs注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的黄曲霉毒素b1适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例2：利用生物素修饰的黄曲霉毒素b1适配体制备亲和柱

本发明制备黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.取1ml链霉亲和素（sa）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4b，用10ml超纯水洗涤3次

2.将（sa）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.02m的pbs，0.8mnacl，ph7.4）洗涤3次。加入20mol/l的生物素修饰的黄曲霉毒素b1适配体，室温偶联4小时

3.将偶联好的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

4.装柱

将黄曲霉毒素b1—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的黄曲霉毒素b1亲和纯化柱

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlpbs，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的黄曲霉毒素b1适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlpbs，将注射器接在进样口上，缓慢的将pbs注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的黄曲霉毒素b1适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例3：利用黄曲霉毒素b1适配体亲和柱纯化和检测玉米样品中的黄曲霉毒素b1

本实施例利用正常的玉米样本定量加入黄曲霉毒素b1的标准品，然后用黄曲霉毒素适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率

1.玉米样品处理

1)将玉米样品粉碎

2)按照每克样品5ng的标准，在粉碎后的玉米样品中添加黄曲霉毒素b1标准品

3)称取25g样品，加入100ml的提取液

4)高速匀浆2min

5)用快速定性滤纸过滤

6)取1.5ml滤液，加入36ml稀释液，振荡混匀

7)用微纤维滤纸过滤

8)取全部滤液用于上样检测

2.取出黄曲霉毒素b1适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上

3.打开出样口塞，用10mmol/lpbsph7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出

4.将样品加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱

5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物

7.洗脱产物用高效液相色谱hplc检测

8.高效液相色谱检测结果见表1，色谱图见附图3：

从检测结果可以看出，在1g的粉碎后玉米样品中加入5ng的黄曲霉毒素b1，用本发明的适配体亲和柱可以回受到4.975ng。回收率为99.5%。

实施例4：利用黄曲霉毒素b1适配体亲和柱纯化和检测饲料样品中的黄曲霉毒素b1

按照每克样品5ng的标准，在饲料样品中添加黄曲霉毒素b1标准品

1前处理

1）25g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛）加入5g氯化钠与125ml提取液（70%甲醇-水溶液）混匀

2）高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液

3）取10ml滤液加入20ml蒸馏水稀释（稀释后的液体ph值应保证在6~8之间，可用1m“naoh”或“hcl”进行调节），再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液

4）取15ml上样液过免疫亲和柱净化

净化

1）将亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出

2）待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10ml

3）待液体排干后，上样1ml甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1ml

4）洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于hplc分析

5）检测结果见下表

色谱图见附图4。

实施例5：利用黄曲霉毒素b1适配体亲和柱纯化和检测酱油中的黄曲霉毒素b1

按照每克样品5ng的标准，在酱油中添加黄曲霉毒素b1标准品

1.提取

1)准确称取50g±0.01g样品，置于250ml三角瓶中，加入2.5g氯化钠，加入80%甲醇定容至100ml

2)高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液

3)取10ml滤液加入40ml水稀释（稀释后的液体ph值应保证在6~8之间，可用1m“naoh”或“hcl”进行调节），再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液

4)取10ml上样液过免疫亲和柱净化

2.净化

1)将免疫亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出

2)待液体排干后，先用1%吐温-20水溶液洗涤10ml，再用蒸馏水或去离子水洗涤10ml，

3)待液体排干后，上样1ml甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1ml

洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于hplc分析

4）洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于hplc分析

酱油中黄曲霉毒素b1加标回收率为97.2%。色谱图见附图5。

实施例6：黄曲霉毒素b1适配体亲和柱重复使用柱容量的变化

本实施例利用定量的黄曲霉毒素b1的标准品，然后用黄曲霉毒素b1适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上的黄曲霉毒素b1用有机溶剂洗脱后，用高效液相色谱检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的黄曲霉毒素b1浓度。主要目的是测试黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的重复使用性

1.配制10ug/ml的黄曲霉毒素b1标准品

2.取出黄曲霉毒素b1适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上

3.打开出样口塞，用10mmol/lpbsph7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的黄曲霉毒素b1标准品，总量1ug，加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱

5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物

7.洗脱产物用高效液相色谱hplc检测

8.亲和柱用超纯水洗涤3次，每次10ml，然后用10mmol/lpbsph7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升

9.再次上样100ul黄曲霉毒素b1标准品，总量1ug

10.按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱检测其浓度

11.再重复步骤8.9.10三次。检测洗脱产物的浓度

12.计算总共5次的黄曲霉毒素b1适配体亲和柱纯化的回收率

高效液相色谱检测结果见表4：

从上述结果可以看出，黄曲霉毒素b1适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。

黄曲霉毒素b1适配体序列

5’-tttaaaccattgagcgcatgatagcaccatctgacctctgtgctgct-3