一种杉寄生中鞣花酸和3,3`‑二甲氧基鞣花酸含量检测方法与流程

本发明涉及药用植物中特定成分含量的测定方法，特别是一种杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量检测方法。

背景技术：

杉寄生为桑寄生科鞘花属植物鞘花（拉丁名：Macrosolen cochinchinensis （Lour.）Van Tiegh.）的茎枝。植物鞘花，分布于华南、西南及福建、西藏等地。具有祛风湿，补肝肾，活血止痛，止咳，止痢之功效。主治风湿痹痛，腰膝酸痛，头晕目眩，脱发，跌打损伤，痔疮肿痛，咳嗽，咳血，痢疾。具体的，杉寄生具有以下功效：1.杉寄生是植物福氏鞘花的全株，在夏天和秋天之中采收，性平、味甘淡，有止咳和散瘀的功效。平时多用于胃气痛以及疝气和内伤咳血等多种病症的治疗；2.杉寄生可治胃气痛：杉寄生有理气止痛的作用，对人类的胃气痛有很好的治疗作用，可单独食用也可以与猪瘦肉同时煎制后食用，在与猪瘦肉一起煎制食用时，治疗效果会更出色。这种食用方法对人类的疝气也同样适合，而且治疗效果比较不错；3.杉寄生可治苦伤和咳血：杉寄生对人类的苦伤以鼐咳血症状都有很好的治疗效果，在治疗时以内服为主，可以取杉寄生30克用清水煎制后服用，每天服用一次连用七天，效果不错；4.杉寄生可治关节痛：杉寄生对人类的关节痛和风湿病治疗作用明显，在治疗既可煎制后内服，也可用药液清洗自己疼痛的部位，也能起到消炎止痛和消肿的作用。经研究，杉寄生中含有多种化学成分，中国文献：中国实验方剂学杂志，2015年第21卷第3期发表《杉寄生化学成分》，作者：陆国寿、陆文杰、陈家源等；单位：广西中医药研究院，作者对杉寄生化学成分进行了研究，从中分离得到并鉴定了10个化学成分，分别为羽扇豆醇（1），环桉烯醇（2），表木栓醇（3），（23Z）-9,19-cycloart-23-ene-3α，25-diol(4),木栓酮（5），正三十二烷醇（6），β-谷甾醇（7），三十二酸（8），芦丁（9）荭草苷（10）。而本发明人研究发现杉寄生对肿瘤具有一定防治效果，经对杉寄生不断分离研究，发现其中含有的酚类物质对肿瘤具有较高的活性，发明人分离提取了杉寄生中的酚类物质鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸。

鞣花酸(2，3，7，8-tetrahydroxy benzopyrano5，4，3一cdebenzopyran-5,10一dione)是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分，鞣花酸与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色。鞣花酸表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤等有很好的抑制作用。

为了进一步明确杉寄生的化学组成，我们对其进行了化学成分的研究并从中分离鉴定得到两个酚性化合物，分别为鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸。鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸均为首次从杉寄生中分得，同时也首次建立了它化合物的HPLC含量测定方法，并初步比较了它们在不同产地杉寄生中的含量变化。鞣花酸不仅具有明显的抗氧化作用，还对多种癌变有一定的抑制作用，甚至能引起癌细胞的凋亡。本实验进行的研究，为开发以杉寄生为原料的药品、保健品、天然抗氧化剂提供理一定的论依据，使杉寄生在医疗、保健甚至化妆品领域起到更广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简便，准确度高，重复性好的杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的测定方法。

本发明是这样实现的：

本发明杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量检测方法，包括如下步骤：

（A）对照品储备液的制备：精密称取鞣花酸对照品和3,3'-二甲氧基鞣花酸对照品，置同一250mL量瓶中，加入30-50ml甲醇，超声溶解15-20min至完全透明，并用甲醇稀释至刻度，即为对照品储备液。

（B）供试品溶液的制备:取杉寄生药材，预先粉碎至40-80目，精密称定其重量，精密加入60%的乙醇（g/g），称定重量，放水浴上回流40-70 min，优选55-65min，放冷，再称定重量，用60%乙醇(g/g)补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

(C)取制备好的对照品及供试品样品注入液相色谱仪，进样，检测，即得；色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.2 %磷酸水溶液，体积比为47:53；流速为0.8 mL·min^-1；检测波长为254nm；柱温为25℃；进样量为10μL；在此条件下鞣花酸的理论塔板数不低于3000；3,3'-二甲氧基鞣花酸的理论塔板数不低于5000。

按照上述条件要求对检测方法的重复性、精密度等进行了试验，具体过程为：

一、对照品储备液的制备

精密称取鞣花酸对照品15.31 mg，3,3'-二甲氧基鞣花酸对照品9.43 mg，置同一250 mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解并用甲醇稀释至刻度，即为对照品储备液。鞣花酸的浓度为61.24 μg·mL^-1，3,3'-二甲氧基鞣花酸的浓度为37.72 μg·mL^-1。

二、供试品溶液的制备

取经粉碎的药材约0.5 g，精密称定其重量，精密加入60 %乙醇，称定重量，放水浴上回流60 min，放冷，再称定重量，用60 %乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

三、线性关系的考察

分别从对照品储备液中精密移取0.5，1，3，5，7，9 mL，分别置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得系列浓度的混合对照品溶液。分别取上述6个不同浓度的对照品溶液10 μL按权利要求下色谱条件进样测定，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果得出鞣花酸的线性方程：Y = 27856X + 3884.5，r= 0.9998；3,3'-二甲氧基鞣花酸的线性方程：Y = 39151X - 4588.1，r = 0.9998。结果表明鞣花酸对照品溶液在进样量为0.0306 μg～0.5512 μg范围内呈良好线性关系，3,3'-二甲氧基鞣花酸对照品溶液在进样量为0.0189 μg～0.3395 μg范围内呈良好线性关系。

四、精密度实验

精密吸取鞣花酸浓度为18.372 μg·mL^-1和3,3'-二甲氧基鞣花酸浓度为11.316 μg·mL^-1的对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，按权利要求色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。结果鞣花酸峰面积RSD值为0.17 %，3,3'-二甲基鞣花酸峰面积RSD值为0.26 %，表明所用高效液相色谱仪精密度非常好。

五、稳定性试验

取杉寄生药材（产地：广西上林）粗粉约0.5 g，精密称定，按供试品制备方法制备，室温保存，分别在0，2，4，8，12，24 h精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按权利要求规定色谱条件进样测定，考察其稳定性。结果样品中鞣花酸峰面积的RSD值为0.46 %，3,3'-二甲氧基鞣花酸峰面积的RSD值为1.01%。结果表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

六、重复性试验

取杉寄生药材（产地：广西上林）粗粉约0.5 g，精密称定重量，共取6份，按要求供试品溶液的制备方法制备。精密吸取供试品溶液10 μL，按权利要求规定下色谱条件进样测定，计算鞣花酸含量为0.738 mg·g^-1，其RSD值为1.64 %；3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量为0.443 mg·g^-1，其RSD值为2.45 %。

七、加样回收试验

精密吸取对照品储备液3 mL至100 mL圆底烧瓶中，水浴上挥干溶剂，平行制备6份，再在每一份中加入已知含量的杉寄生药材（产地：广西上林）粗粉约0.25 g，按要求供试品溶液的制备方法制备。精密吸取供试品溶液10 μL，按要求色谱条件分别测定各样品中鞣花酸、3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量，计算回收率（杉寄生药材中鞣花酸含量以0.738 mg·g^-1计，3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量以0.443 mg·g^-1计），结果见表1。

本发明的有益效果是：

本发明对杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的检测方法，分别对对照品溶液及供试品溶液在本发明色谱条件下进行测定鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸的色谱分析图，并通过对鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸的峰面积响应值的线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率等方面的测定，从而掌握杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的测定方法。本测定方法操作简单、准确度高、重复性好，值得在杉寄生鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量测定方面推广应用。

附图说明：

图1：3,3'-二甲氧基鞣花酸结构式；

图2：鞣花酸结构式；

图3：鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸标样及杉寄生药材中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸液相色谱图。

具体实施方式

实施例一

发明人分别在广西金秀、广西南宁和广西上林取杉寄生药材，并对杉寄生中的鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸进行含量测定，步骤如下：

（A）对照品储备液的制备

精密称取鞣花酸对照品15.31 mg，3,3'-二甲氧基鞣花酸对照品9.43 mg，置同一250 mL量瓶中，加甲醇30-50ml，超声溶解15-20min，并用甲醇稀释至刻度，即为对照品储备液。鞣花酸的浓度为61.24 μg·mL^-1，3,3'-二甲氧基鞣花酸的浓度为37.72 μg·mL^-1。

（B）供试品溶液的制备

取经粉碎的药材约0.5 g，精密称定其重量，精密加入60 %乙醇（g/g），称定重量，放水浴上回流60 min，放冷，再称定重量，用60 %乙醇（g/g），补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

(C)取制备好的对照品及供试品样品注入液相色谱仪，进样，检测，即得；色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.2 %磷酸水溶液，体积比为47:53；流速为0.8 mL·min^-1；检测波长为254nm；柱温为25℃；进样量为10μL；在此条件下鞣花酸的理论塔板数不低于3000；3,3'-二甲氧基鞣花酸的理论塔板数不低于5000。

检测结果见表3。

实验结果表明，本实验采用的HPLC法测定杉寄生药材中鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量，方法简单方便，操作性强，具有较好的稳定性重现性，为杉寄生药材质量控制方法提供了参考，为鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸含量测定方法的研究提供了重要依据。