一种动物源性食品中安眠酮和地西泮残留量的测定方法与流程

本发明属于食品中兽药残留的检测
技术领域：
，具体涉及动物源食品中安眠酮和地西泮残留量的测定方法。
背景技术：
：安眠酮和地西泮在临床上作为镇静催眠药，属于精神管制药，长期服用有成瘾性和依赖性。近年来，随着畜牧养殖业的发展，有不法分子在经济利益的驱动下，擅自在畜禽饲养中添加使用，以期增加产肉量。另外，在运输过程中使用也可起到保活、保重的效果。安眠酮和地西泮的滥用，将导致动物源性食品中药物的残留，最终严重影响消费者的身体健康。我国农业部235号公告已明确规定地西泮允许作治疗用但不得在动物性食品中检出；安眠酮禁止使用。目前动物源食品中安眠酮和地西泮残留量的测定方法主要有GB29697-2013《食品安全国家标准动物性食品中地西泮和安眠酮多残留的测定气相色谱-质谱法》(简称：对比标准1)和SN/T3039-2011《出口动物源性食品中安眠酮残留量的测定高效液相色谱法》(简称：对比标准2)。但是，前者气相色谱-质谱法操作繁琐，且干扰较多，不适合大批量样品的快速分析；后者高效液相色谱法测定低限10μg/kg，达不到监管部门下达的技术要求1.0μg/kg，高效液相色谱法灵敏度低，基质干扰大，没有应用价值；以下是具体的对比结果。另外，经查得到对比文献3：质谱学报2012,33(1)《液相色谱-串联质谱法测定养殖鱼中痕量安眠酮的残留量》，与之相比，本发明采用QuEChERs净化管操作简便，无需使用有机溶剂，方便又环保。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种动物源性食品中安眠酮和地西泮残留量的测定方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种食品中安眠酮和地西泮残留量的测定方法，步骤为：取待测试料，提取，上清液经过QuEChERs净化管净化后，浓缩挥干，残渣以流动相溶解，再用液相色谱-串联质谱法检测，最后用内标法进行定量；所述的流动相为乙腈-5mmol/L甲酸，体积比例为30：70；所述QuEChERs净化管的制备方法为：称取10份C18填料、40份NH2填料和1份PSA填料于离心管中，混匀，即得。所述提取过程为：在所述待测试料中，加入地西泮同位素内标物标准工作液，再加入乙酸乙酯做为提取溶剂，匀浆，振荡提取，离心，分离上清液备用。所述净化过程为：移取提取液至所述QuEChERs净化管中，涡旋振荡，离心，取上清液即得。所述内标法定量的标准曲线的制备方法为：精密量取100μg/L安眠酮和地西泮混合标准工作液和100μg/L地西泮同位素内标标准工作液适量，用所述流动相稀释，配制成安眠酮和地西泮浓度为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10μg/L，地西泮同位素内标浓度为2.0μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以安眠酮和地西泮与地西泮同位素内标的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。所述液相色谱的色谱条件为：进样量：10μL；柱温：40℃；流动相：A：5mmol/L甲酸溶液；B：乙腈；梯度洗脱条件如下表1：表1：梯度洗脱条件所述的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压IS：4500V；安眠酮定性离子对和碰撞能量：251.2>132.1，碰撞能量35V；251.2>91.1，碰撞能量52V；定量离子对：251.2>132.1；地西泮定性离子对和碰撞能量：285.1>193.0，碰撞能量45V；285.1>154.1，碰撞能量38V；定量离子对：285.1>154.1。所述的测定方法的定性方法为：通过试料色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性；试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差范围满足下表3范围，则可判断试样中存在相应的被测物。表3：定性、定量离子对和碰撞能量相对离子丰度％＞50＞20～50＞10～20≤10允许的相对偏差％±20％±25±30±50所述的测定方法的定量方法为：取试料溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算，由标准曲线求得供试溶液中安眠酮、地西泮的浓度；标准溶液及试料溶液中的安眠酮、地西泮和地西泮同位素内标的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；标准曲线校准：由求得a和b，则试料中安眠酮和地西泮残留量按式2计算：式中：As____标准溶液中安眠酮和地西泮的峰面积；A'is____标准溶液中地西泮同位素内标的峰面积；cs____标准溶液中安眠酮和地西泮的浓度，单位为纳克每毫升；c'is____标准溶液中地西泮同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升；c____试料溶液中安眠酮和地西泮的浓度，单位为纳克每毫升；cis____试料溶液中地西泮同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升；A____试料中安眠酮和地西泮的峰面积；Ais____试料中地西泮同位素内标的峰面积；X____供试试料中安眠酮和地西泮的残留量，单位为微克每千克；V____溶解残余物的体积，单位为毫升；m____供试试料质量，单位为克；D____稀释倍数；本公式中稀释倍数为5；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示。所述食品为动物源性食品。所述动物源性食品包括猪肉、鱼肉、猪肝脏或猪肾脏。有益作用：本发明首次提供了动物源性食品中，特别是猪肉、鱼肉、猪肝脏和猪肾脏中安眠酮和地西泮残留量的检测方法，填补了本领域技术空白。本发明回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.5μg/kg，在0.5μg/kg～5μg/kg添加浓度水平上的回收率为90％～120％，实验室内相对标准偏差≤15％。本发明方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，基质适应范围广，定性定量科学准确，适用于大批量样品的快速分析，能够满足我国相关监管部门的技术要求。附图说明图1：安眠酮标准溶液特征离子质量色谱图(0.5μg/L)，(251.2>132.1)图2：安眠酮标准溶液特征离子质量色谱图(0.5μg/L)，(251.2>91.1)图3：地西泮标准溶液特征离子质量色谱图(0.5μg/L)，(285.1>193)图4：地西泮标准溶液特征离子质量色谱图(0.5μg/L)，(285.1>154.1)图5：地西泮同位素内标标准溶液特征离子质量色谱图(2.0μg/L)，(290.2>198.2)图6：猪肉空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图7：猪肉空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图8：猪肉空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>193)图9：猪肉空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)图10：猪肉空白试样特征离子质量色谱图，(290.2>198.2)图11：猪肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>132.1)图12：猪肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>91.1)图13：猪肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>193)图14：猪肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>154.1)图15：猪肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(290.2>198.2)图16：罗非鱼肉空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图17：罗非鱼肉空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图18：罗非鱼肉空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>193)图19：罗非鱼肉空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)图20：罗非鱼肉空白试样特征离子质量色谱图，(290.2>198.2)图21：罗非鱼肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>132.1)图22：罗非鱼肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>91.1)图23：罗非鱼肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>193)图24：罗非鱼肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>154.1)图25：罗非鱼肉空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(290.2>198.2)图26：猪肾脏空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图27：猪肾脏空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图28：猪肾脏空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>193)图29：猪肾脏空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)图30：猪肾脏空白试样特征离子质量色谱图，(290.2>198.2)图31：猪肾脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>132.1)图32：猪肾脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>91.1)图33：猪肾脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>193)图34：猪肾脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>154.1)图35：猪肾脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(290.2>198.2)图36：猪肝脏空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图37：猪肝脏空白试样特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图38：猪肝脏空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>193)图39：猪肝脏空白试样特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)图40：猪肝脏空白试样特征离子质量色谱图，(290.2>198.2)图41：猪肝脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>132.1)图42：猪肝脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(251.2>91.1)图43：猪肝脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>193)图44：猪肝脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(285.1>154.1)图45：猪肝脏空白添加安眠酮和地西泮试样特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)，(290.2>198.2)图46：未净化的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图47：净化过的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(251.2>132.1)图48：未净化的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图49：净化过的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(251.2>91.1)图50：未净化的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(285.1>193)图51：净化过的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(285.1>193)图52：未净化的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)图53：净化过的空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图，(285.1>154.1)具体实施方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例11.原理试料用乙酸乙酯提取，提取液经QuEChERs(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)净化管净化，浓缩挥干，残渣以流动相溶解，采用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。2.试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。2.1安眠酮标准溶液：0.1mg/mL,LGC公司。2.2地西泮标准溶液：100μg/mLCerilliant公司。2.3地西泮同位素内标物标准溶液：氘代地西泮(D5-地西泮)1.0mg/mLCerilliant公司。2.4乙腈：色谱纯，Fisher公司。2.5乙酸乙酯：广州化学试剂厂。2.6甲酸：色谱纯，Merck公司。2.7C18填料：LC-C1840-63μm，CNW公司。2.8NH2填料：振翔公司。2.9PSA填料：40-63μm，60A，CNW公司。2.10QuEChERs净化管：称取100mgC18填料、400mgNH2填料和10mgPSA填料于15mL塑料离心管，混匀。2.115mg/L安眠酮和地西泮混合标准中间液：分别精密量取安眠酮和地西泮标准溶液0.5mL，于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为5mg/L的安眠酮和地西泮混合标准中间液。2.12100μg/L安眠酮和地西泮混合标准工作液：精密量取5mg/L的安眠酮和地西泮混合标准中间液1.00mL，于50mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为100μg/L安眠酮和地西泮混合标准工作液。2.1310mg/L地西泮同位素内标标准中间液：精密量取地西泮同位素内标物标准溶液100μL，于10mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10mg/L地西泮内标标准中间液。2.14100μg/L地西泮同位素内标标准工作液：精密量取10mg/L地西泮同位素内标标准中间液1.00mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为100μg/L地西泮同位素内标标准工作液。3仪器和设备3.1液相色谱-串联质谱仪：UFLC-XR岛津液相色谱仪；API3000三重四极杆串联质谱仪，ESI源，ABSciex公司。3.2分析天平：感量0.00001g，Sartorius公司。3.3天平：感量0.01g，Sartorius公司。3.4肉类组织捣碎机：GM200型，Retsch公司。3.5旋涡振荡器：MS3basic，IKA公司。。3.6振荡器:Heidolph公司。3.7组织匀浆机：T25，IKA公司。3.8离心机：3-30K，SIGMA公司。3.9氮吹仪：BiotageTurboVap。3.10滤膜：0.22μm，尼龙膜。4试料的制备与保存4.1试料的制备分别取猪肉、罗非鱼肉、猪肝脏和猪肾脏空白组织，绞碎，并使均质。——取均质后的供试样品，作为供试试料。——取均质后的空白样品，作为空白试料。——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。4.2试料的保存－18℃以下保存。5测定步骤5.1提取分别称取上述四种肉类制备得到的试料5g±0.05g，于50mL具塞离心管中，加100μg/L地西泮同位素内标标准工作液100μL，加无水硫酸钠粉末5g，加乙酸乙酯10mL，12000r/min匀浆30s，另取一50mL离心管加乙酸乙酯15mL，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液保留备用。匀浆后振荡提取10min，4000r/min离心5min，上清液置于另一洁净50mL离心管中。残余物用洗涤液再振荡提取一次，4000r/min离心5min，上清液合并，混合均匀，待净化。5.2净化移取提取液5mL至QuEChERs净化管中，涡旋振荡2min，4000r/min离心5min，上清液转移至玻璃试管，40℃氮吹至干，加乙腈-5mmol/L甲酸(30+70，v/v)1mL涡旋振荡2min，充分溶解残渣，过0.22μm尼龙滤膜，供LC-MS/MS测定。5.3标准曲线的制备精密量取100μg/L安眠酮和地西泮混合标准工作液和100μg/L地西泮同位素内标标准工作液适量，用乙腈-5mmol/L甲酸(30+70，v/v)稀释，配制成安眠酮和地西泮浓度为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10μg/L，地西泮同位素内标浓度为2.0μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以安眠酮和地西泮与地西泮同位素内标的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。5.4测定5.4.1液相色谱条件5.4.1.1色谱柱：AtlantisT3(4.6mm×100mm，粒径3μm)。5.4.1.2流动相：A：5mmol/L甲酸溶液；B：乙腈，洗脱梯度见表1。表1梯度洗脱程序5.4.1.3柱温：40℃。5.4.1.4进样量：10μL。5.4.2质谱条件5.4.2.1离子源：电喷雾离子源。5.4.2.2扫描方式：正离子扫描。5.4.2.3检测方式：多反应监测。5.4.2.4喷雾电压：4500V。5.4.2.5雾化气：10。5.4.2.6气帘气：9。5.4.2.7碰撞气：10。5.4.2.8辅助加热气温度：500℃。5.4.2.9聚焦电压：-110V。5.4.2.10入口电压：-10V。5.4.2.11碰撞池出口电压：-15V。5.4.2.12驻留时间：0.1s。5.4.2.13定性、定量离子对、去集簇电压和碰撞能量见表2。表2定性、定量离子对和碰撞能量5.4.3测定法5.4.3.1定性测定通过试料色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。表3相对离子丰度的允许偏差范围相对离子丰度％＞50＞20～50＞10～20≤10允许的相对偏差％±20％±25±30±505.4.3.2定量测定取试料溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算。标准溶液及试料溶液中的安眠酮、地西泮和地西泮同位素内标的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱-质谱条件下，标准溶液、空白试料溶液和空白添加试料溶液中特征离子质量色谱图见说明书附图。5.5空白试验除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。5.6结果计算和表述标准曲线校准：由求得a和b，则试料中安眠酮和地西泮残留量按式(2)计算：式中：As____标准溶液中安眠酮和地西泮的峰面积；A'is____标准溶液中地西泮同位素内标的峰面积；cs____标准溶液中安眠酮和地西泮的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；c'is____标准溶液中地西泮同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；c____试料溶液中安眠酮和地西泮的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；cis____试料溶液中地西泮同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A____试料中安眠酮和地西泮的峰面积；Ais____试料中地西泮同位素内标的峰面积；X____供试试料中安眠酮和地西泮的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；V____溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；m____供试试料质量，单位为克(g)；D____稀释倍数。本公式中稀释倍数为5。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5.7检测方法灵敏度、准确度和精密度5.7.1灵敏度定量限的确定，是根据信噪比(S/N)的值来确定的。在空白猪肉、鱼肉、猪肝脏和猪肾脏中分别添加0.5μg/kg的安眠酮和地西泮标准溶液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限。实验结果：本方法的定量限为0.5μg/kg。5.7.2准确度准确称取5.0g空白试料于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含安眠酮和地西泮药物浓度分别为0.5、1.0、5.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率。实验结果：本方法在0.5μg/kg～5μg/kg添加浓度水平上的回收率为90％～120％。5.7.3精密度准确称取5.0g空白试料于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含安眠酮和地西泮药物浓度分别为0.5、1.0、5.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差。实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤15％。6.结果：本方法用于日常检测，已检测猪肉、鱼肉、猪肝脏和猪肾脏样品共180个，尚未有检出的样品。按照本发明的方法分别与对比标准1、对比标准2和对比文件3的比较结果分别见下表4、5、6。表4：对比标准1与本发明方法的比较结果表5：对比标准2与本申请的特征对比表6：对比文献3与本申请的特征对比本发明的净化效果明显，去除了基质中的干扰物，以干扰较多的空白猪肝脏样品为例，未净化与净化过的同一样品色谱图比较见说明书附图46-53，对比结果见表7。表7：未净化与净化过的同一空白猪肝脏样品的特征离子质量色谱图对比结果当前第1页1 2 3