一种用于定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的试剂盒的制作方法

本发明属于生物化学分析检测领域，具体涉及一种定量检测血清（浆）样本中同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的试剂盒。

背景技术：

同型半胱氨酸(homocysteine,hcy)、半胱氨酸(cysteine,cys)和甲硫氨酸(methionine,met,也称蛋氨酸)是体内甲硫氨酸循环的3个重要产物。正常情况下，同型半胱氨酸通过两条途径转化：一是再甲基化，约50%的同型半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化作用下，以叶酸作为甲基供体，发生甲基化，重新合成甲硫氨酸。二是转硫基途径，另外约50%的同型半胱氨酸在胱硫醚β合成酶的作用下，最终生成半胱氨酸^[1]。

正常人体内空腹血中总同型半胱氨酸水平5~15μmol/l。当血中总同型半胱氨酸水平高于15μmol/l，则可诊断为高同型半胱氨酸血症^[2]。而高同型半胱氨酸血症是冠心病、卒中、深静脉血栓形成的独立危险因素，血浆总同型半胱氨酸水平每升高5μmol/l，冠状动脉疾病的风险增加1.6倍，脑血管疾病风险增加1.8倍^[3]。

近年来，科学研究证明不仅同型半胱氨酸，半胱氨酸、甲硫氨酸的水平对心脑血管疾病危险程度也有指导作用。2010年，pagejh研究结果表明高浓度的同型半胱氨酸和半胱氨酸显著增加心梗的发生风险高达3.3~3.5倍^[4]。2011年，xiaoy指出高浓度同型半胱氨酸和半胱氨酸的联合效应显著增加冠心病的发生风险^[5]。而当甲硫氨酸浓度<20.6μmol/l时，将显著增加复发性静脉血栓发生风险高达3.5倍^[6]；低浓度的甲硫氨酸和高浓度的同型半胱氨酸是中心视网膜静脉阻塞的危险因素^[7]。以上的临床研究表明血中同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的异常变化都与心血管疾病、微血管疾病的发生有极强的相关性。因此，同时检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的水平，有助于全面评价患者的生理病理状态。

目前临床常用的检测方法和试剂盒主要集中于对同型半胱氨酸水平的检测，如沪食药监械（准)字2013第2401487号，上海复星长征医学科学有限公司的同型半胱氨酸测定试剂盒（酶循环法)；还有国食药监械(进)字2013第2402998号，abbottgmbh&co.kg公司的architethomocysteinereagentkit（化学发光微粒子免疫检测法），都是对人血清或血浆中单一的同型半胱氨酸水平进行检测。相关检测方法主要有免疫法和高效液相色谱法两种。免疫法灵敏度低，检测结果偏差较大，且受到结构类似药物s-腺苷-甲硫氨酸的干扰。高效液相色谱法曾是测定总同型半胱氨酸最广泛的一种方法，具有良好的特异性、精密度和灵敏度，虽然该方法近年来不断被改进，但其在处理条件、层析条件和样品测定的诸多变异使其难以标准化，同时检测通量也较低^[8]。

因此，迫切需要一种快速、准确、高灵敏度的方法来辅助临床更全面的诊断和评价患者的生理病理状态。

lc-ms/ms是一种新的实验室常规检测技术，具有高灵敏度、高特异性和高准确度的特点，使其在临床检验中获得更多的关注。本试剂盒基于lc-ms/ms技术，采用非衍生化的方法，构建了血清（浆）样品中同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的前处理模型，首次实现了同时定量甲硫氨酸循环中的3个重要代谢物，前处理简便，结果准确，评价全面，具有良好的临床应用前景。

[1]welchgn,loscalzoj.nengljmed,1998,338(15):1042-1050.

[2]tsikasd,sandmannj,rossas,etal.analbiochem,1999,70:231-241.

[3]bousheycj,beresfordsa,omenngs,etal.probablebenefitsofincreasingfolicacidintakes.jama.1995,274(13):1049-1057.

[4]pagejh,etal.amheartj.2010,159(4):599-604.

[5]xiaoy,etal.lipidshealthdis.2011,12,10:137.

[6]keijzermb,etal.thrombhaemost.2006,96(4):492-749.

[7]narayanasamya,etal.investophthalmolvissci.2007,48(4):1441-6.

[8]王宇.血浆同型半胱氨酸临床常用检测方法及影响因素.检验医学与临床,2010,7(24):2808-2810。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种检测血清（浆）中同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的试剂盒，首次实现同时定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸3个甲硫氨酸循环的代谢产物，同时克服了现有检测方法的技术缺陷。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于定量检测血清（浆）中同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的试剂盒，所述如下：

1.试剂盒包括如下试剂：

1)标准品工作液：含同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的混合标准品溶液。

2)混合内标溶液：含有d4-同型半胱氨酸、d2-半胱氨酸、d3-甲硫氨酸的溶液。

3)稀释液：小牛血清溶液

4)还原剂：二硫苏糖醇（dtt）

5)沉淀剂：乙腈、水、稀盐酸/甲酸/乙酸组成

6)质控品：含同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸的混合质控品溶液，分高中低3个浓度：qc(l)、qc(m)、qc(h)。

7)流动相：

a:0.1%甲酸水溶液

b:乙腈

优选地，上述1）中5个标准工作液浓度如下表：

优选地，上述5）中的沉淀剂为乙腈、水、稀盐酸/甲酸/乙酸的混合溶液，其中乙腈：水：酸体积比为100:10~30:0.001~0.01；其中酸优选为稀盐酸。

优选地，上述2）中的混合内标溶液浓度为：

d4-同型半胱氨酸：10μmol/l

d2-半胱氨酸：100μmol/l

d3-甲硫氨酸：20μmol/l

优选地，上述6）中的质控品浓度qc(l)、qc(m)、qc(h)如下表

进一步地，本发明试剂盒适用于血清或血浆中的同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸水平的检测。

所述的样本为血清或血浆。

2.一种用于定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)还原剂的配置：室温条件下，准确加入50ml纯化水，涡旋溶解。

2)标准曲线（质控品）制备方法：取5μl标准工作液（质控品）于1.5ml离心管中，依次加入45μl稀释液、50μl内标液、100μl还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μl沉淀剂，涡旋振荡3min后，高速离心（14000g）3min，吸取100μl上清液进串联质谱分析。

3)样本的制备方法：取50μl样本溶液于1.5ml离心管中，依次加入50μl内标液、100μl还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μl沉淀剂，涡旋振荡3min后，高速离心（14000g）3min，吸取100μl上清液进串联质谱分析。

本发明的有益效果是：该试剂盒包括标准工作液、混合内标液、稀释液、还原剂、沉淀剂、质控品和流动相。该发明试剂盒基于质谱技术，采用非衍生化的方法，构建了血清（浆）样品中同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的前处理模型，操作简便、灵敏度高、结果准确，首次实现同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸这3个甲硫氨酸循环中重要代谢产物的浓度检测，为临床提供一种更全面的评价患者心脑血管疾病危险的检测方法。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸标准品及内标溶液的mrm色谱图。

图2是血清中同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸及内标的mrm色谱图。

具体实施方式

一种用于定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的试剂盒，使用串联质谱技术检测经过处理的血清（浆）样本，利用高效液相色谱将同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和杂质进行分离，采用同位素内标法定量，以标准品的浓度为x轴，标准品和内标物峰面积比值为y轴，建立标准曲线，计算同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸浓度。以下结合具体实施例进行说明：

具体实施例：实施例中为血清样本

1.材料

1.1仪器：watersxevotq-s高效液相-质谱联用仪，eppendorf单道可调量程移液器（researchplus系列），thermo-shaker恒温混匀仪msc-100（1.5ml），labnetvortexmixers0200离心震荡仪，labnetvortexmixers0200离心震荡仪，量筒

1.2试剂/耗材：色谱柱、试剂盒

色谱柱：watersxbridge，4.6×50mm，3.5μm；

试剂盒：所述试剂盒的组成配方如下表；

2.色谱质谱方法：

2.1色谱条件：

流动相：0.1%甲酸水溶液（a），乙腈（b）；

流速：0.6ml/min；

柱温：40℃；

进样量：1μl

梯度洗脱条件：

2.2质谱条件：

离子源：esi+

源温：150℃

脱溶解气温度：500℃；

脱溶剂气流速：800l/h；

毛细管电压：3kv；

待测物mrm扫描参数见表2

表2hcy、cys、met及内标的mrm扫描参数

3.前处理方法：

3.1标准工作液/质控品前处理方法：

取5μl标准工作液（质控品）于1.5ml离心管中，依次加入45μl稀释液、50μl内标液、100μl还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μl沉淀剂，涡旋振荡3min后，高速离心（14000g）3min，吸取100μl上清液进色谱分析。

3.2血清样本前处理方法：

取50μl血清样本溶液于1.5ml离心管中，依次加入50μl内标液、100μl还原剂，涡旋30s混匀后，30℃水浴反应15min。加入600μl沉淀剂，涡旋振荡3min后，高速离心（14000g）3min，吸取100μl上清液进色谱分析。

4.标准曲线绘制方法：

5个标准工作液的峰面积与内标峰面积比值（y）对标示浓度（x）进行加权（w=1/x²）最小二乘法回归运算，获得回归方程：y=bx+a，并计算r（相关系数），r应不低于0.99。

表3hcy、cys和met的线性方程，线性相关系数及保留时间

5.结果计算：

记录样本中目标物和内标物峰面积之比（y），代入标准曲线回归方程，计算同型半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸浓度。

表4血清中hcy、cys和met的浓度

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。