本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒。
背景技术：
在我国，随着社会经济发展方式的转变，养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业，其规模在不断扩大；随着人们生活质量的不断提高，宠物犬的饲养量在也逐年增加，而对这些行业发展造成最大影响的就是犬类传染病的爆发，对于这些传染病的预防与控制形式也愈加严峻。在犬类疫病中，犬瘟热和犬细小是发病率及死亡率都较高的疫病。犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，传染性极强，死亡率可达80％以上。犬瘟热初期狗的体温高达39.5-41摄氏度，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻症状。在以后2-14天内再次出现胃肠道疾病，呕吐、拉稀，有脓性笔体、脓性眼屎，精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期会出现典型的神经症状，口吐白沫，抽搐，但以冬、春多发，犬是主要的自然宿主。而犬类感染细小病毒后发病急，死亡率高，常呈爆发性流行；不同年龄、性别、品种的犬均可感染，但八月龄以内的幼犬最易感染且死亡率高达70％。病犬和康复带毒犬经粪便、尿液、唾液和呕吐物向外界排毒后污染饲料、饮水、食具及周边环境。健康犬直接接触病犬或者进入被污染环境通过消化道感染。
我国的犬类疫病防控缺乏有效的综合防控体系，既不利于犬类疫病防控，也不利于人类的身体健康。犬类经过接种疫苗后往往存在一种情况，即不知道免疫效果如何，导致了有些犬接种疫苗以后仍然发病，而市面上流行的试剂盒往往只能检测犬瘟热或犬细小，这两种常见病通常需要购买2个试剂盒进行检测，无形中增大了工作量，工作繁琐。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种方便、高效、通过检测血清抗体来判断接种疫苗后的犬类免疫保护状况的犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种犬瘟热、犬细小抗原的elisa检测试剂盒，包括elisa板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照和阴性对照；
上述elisa板条：每个试剂盒装有1块elisa微孔板，每块elisa板条为能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原为原核表达的h蛋白及vp2基因，规格为6孔×10条；
上述血清稀释液为即用型；
上述浓缩洗涤液为20倍浓缩；
上述底物显色液为即用型tmb显色液，10ml；
上述终止液为2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶标单克隆抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗犬igg多克隆抗体，使用前100倍稀释；
上述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后的犬血清稀释液；
上述阴性对照为：经高温灭活的未患病，且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
本发明还公开了上述的检测犬瘟热、犬细小抗原的elisa检测试剂盒在检测犬瘟热、犬细小igg抗原中的应用。
本发明一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒具有如下优点：两种检测方法整合至一个试剂盒，给使用者提供了方便且降低了使用成本。
附图说明
图1是本发明中犬瘟热、犬细小抗原的elisa检测试剂盒；
其中：1.犬瘟热病毒h蛋白；2.犬细小病毒vp2基因。
具体实施方式
本发明一种犬瘟热、犬细小抗原的elisa检测试剂盒，包括elisa板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照和阴性对照；
上述elisa板条：每个试剂盒装有1块elisa微孔板，每块elisa板条为能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原为原核表达的h蛋白及vp2基因，规格为6孔×10条；
上述血清稀释液为即用型；
上述浓缩洗涤液为20倍浓缩；
上述底物显色液为即用型tmb显色液，10ml；
上述终止液为2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶标单克隆抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗犬igg多克隆抗体，使用前100倍稀释；
上述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后的犬血清稀释液；
上述阴性对照为：经高温灭活的未患病，且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
本发明还公开了上述的检测犬瘟热、犬细小抗原的elisa检测试剂盒在检测犬瘟热、犬细小igg抗原中的应用。
一、抗原制备
1.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的表达：
根据genbank中犬瘟热病毒h基因序列及犬细小病毒vp2基因序列，设计合成2对引物，采用pcr方法从dna中扩增出h基因片段及vp2基因片段，将其克隆到表达载体pet28b中，构建了重组质粒pet-h及pet-vp2基因，测序验证后转化入表达宿主菌bl21(de3)，经iptg诱导表达。
2.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用pbs洗涤重悬菌体，超声裂解，具体为：超声1.5s，间隔2s，共10min。然后10000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行sds-page分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经sds-page、westernblotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用bca法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒h蛋白纯化后od值为2.05，与标准品比较后，其浓度为1500μg/ml；犬细小病毒vp2纯化后od值为1.85，与标准品比较后，其浓度为1200μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬igg的制备：
1.纯化犬igg的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化igg方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/lph为5.0的醋酸缓冲液，用1mol/lhcl调节ph至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清液经尼龙筛过滤，尼龙筛孔径为125um，加入1/10体积的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh溶液调ph至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量pbs中，对50-100倍体积的pbs透析，4℃过夜；取出后，12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬igg多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
以上述制备的纯化犬igg作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬igg多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mmph为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；向其中再加入20μl、0.2m、ph为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4溶液，混匀，4℃放置2小时；所得产物在0.1m、ph为7.4的pbs中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph为7.4的pbs中。将溶液装入透析袋中，对0.1mph为7.4的pbs缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明试剂盒的检测原理：
采用间接elisa法，将重组的犬瘟热蛋白h、犬细小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒h蛋白；2为犬细小病毒vp2基因。用1％bsa将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小igg抗体与酶标板中包被的h、vp2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬igg多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的h、vp2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物tmb显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，od值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小igg抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法：
用ph9.6的0.05m的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组h、vp2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的h、vp2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
ph为7.4，浓度为0.15m的pbs洗涤液中各组分及含量如下：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤液至100ml；
底物缓冲液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml，ph为5.0；
四甲基联苯胺tmb显色液：tmb(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％h2o232ul：
终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml。
c)检测犬瘟热、犬细小igg抗体的elisa试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒igg抗体的elisa试剂盒，包含以下组分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬igg多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
tmb底物；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小igg抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬igg多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl2mh2so4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析：
1)检测中阳性对照血清(pc)的od值与阴性对照血清(nc)的od值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝阴性对照血清od值；
pc＝阳性对照血清od值；
2)检测时使用复孔，最终使用od值为两个的平均值。
当血清样本的od值低于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阴性。
当血清样本的od值高于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阳性。
实例2：
一、抗原制备：
1.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的表达：
根据genbank中瘟热病毒h基因序列及犬细小病毒vp2基因序列，设计合成2对引物，采用pcr方法从dna中扩增出h基因片段以及vp2基因片段，将其克隆到表达载体pet28b中，构建了重组质粒pet-h及pet-vp2基因，测序验证后转化入表达宿主菌bl21(de3)，经iptg诱导表达。
2.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用pbs洗涤重悬菌体，超声裂解，具体过程为：超声1.0s，间隔1s，共10min；然后10000rpm离心，分别收集上清液和沉淀，进行sds-page分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经sds-page、westernblotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用bca法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒h蛋白纯化后od值为2.25，与标准品比较后，其浓度为1600μg/ml；犬细小病毒vp2纯化后od值为1.75，与标准品比较后，其浓度为1100μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬igg的制备：
1.纯化犬igg的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化igg方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/lph为5.0的醋酸缓冲液，用1mol/lhcl调节ph至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh调ph至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清液；沉淀溶于适量pbs中，对50-100倍体积的pbs透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬igg多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
上述制备的纯化犬igg作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬igg多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl0.2mph为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.1mph为7.4pbs中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph为7.4的pbs中。将上述溶液装入透析袋中，对0.1mph7.4的pbs缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明重试剂盒的检测原理：
采用间接elisa法，将重组的犬瘟热蛋白h、犬细小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒h蛋白；2为犬细小病毒vp2基因。用1％bsa将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小igg抗体与酶标板中包被的h、vp2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬igg多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的h蛋白及vp2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物tmb显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，od值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小igg抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法
用ph为9.6的0.05m的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组h蛋白、vp2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的h蛋白、vp2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
浓度0.15m，ph为7.4的pbs洗涤液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml；
底物缓冲液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml；
四甲基联苯胺tmb底物显色液：tmb(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml；
c)检测犬瘟热、犬细小igg抗体的间接elisa试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒igg抗体的elisa试剂盒，包含以下组分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬igg多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
tmb显色液；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小igg抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬igg多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl2mh2so4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析
1)检测中阳性对照血清(pc)的od值与阴性对照血清(nc)的od值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝阴性对照血清od值；
pc＝阳性对照血清od值；
2)检测时使用复孔，最终使用od值为两个的平均值。
当血清样本的od值低于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阴性。
当血清样本的od值高于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阳性。
实例3：
一、抗原制备：
1.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的表达：
根据genbank中瘟热病毒h基因序列及犬细小病毒vp2基因序列，设计合成2对引物，采用pcr方法从dna中扩增出h基因片段以及vp2基因片段，将其克隆到表达载体pet28b中，构建了重组质粒pet-h及pet-vp2基因，测序验证后转化入表达宿主菌bl21(de3)，经iptg诱导表达。
2.犬瘟热病毒h蛋白、犬细小病毒vp2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用pbs洗涤重悬菌体，超声裂解，具体过程如下：超声1.0s，间隔2s，共15min；然后12000rpm离心，分别收集上清液和沉淀，进行sds-page分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经sds-page、westernblotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用bca法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒h蛋白纯化后od值为2.15，与标准品比较后，其浓度为1500μg/ml；犬细小病毒vp2纯化后od值为1.55，与标准品比较后，其浓度为900μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬igg的制备：
1.纯化犬igg的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化igg方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/lph为5.0醋酸缓冲液，用1mol/lhcl调节ph至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清液经尼龙筛过滤，筛网孔径为125um，加入1/10体积的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh调节ph至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量pbs中，对50-100倍体积的pbs透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬igg多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
上述制备的纯化犬igg作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬igg多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mmph为4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl0.2mph为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.1mph为7.4pbs中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph为7.4的pbs中。将上述溶液装入透析袋中，对0.1mph7.4的pbs缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明试剂盒的检测原理：
采用间接elisa法，将重组的犬瘟热蛋白h、犬细小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒h蛋白；2为犬细小病毒vp2基因。用1％bsa将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小igg抗体与酶标板中包被的h蛋白、vp2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬igg多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的h蛋白、vp2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物tmb显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，od值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小igg抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法：
用ph为9.6的0.05m的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组h蛋白、vp2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的h、vp2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
浓度为0.15m，ph为的7.4pbs洗涤液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml；
底物缓冲液(ph5.0磷酸柠檬酸)：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml；
四甲基联苯胺tmb底物显色液：tmb(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml；
c)检测犬瘟热、犬细小igg抗体的间接elisa试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒igg抗体的elisa试剂盒，包含以下组分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬igg多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
tmb底物；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小igg抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬igg多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl2mh2so4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析：
1)检测中阳性对照血清(pc)的od值与阴性对照血清(nc)的od值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝阴性对照血清od值；
pc＝阳性对照血清od值；
2)检测时使用复孔，最终使用od值为两个的平均值。
当血清样本的od值低于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阴性。
当血清样本的od值高于cutohh值时，该样本为犬细小病毒igg抗体阳性。