一种检测饮料中苯甲酸的方法与流程

本发明属于食品分析研究领域，具体涉及一种检测饮料中苯甲酸的方法，尤其是一种薄膜微萃取结合表面增强拉曼光谱技术检测饮料中苯甲酸的方法。

背景技术：

苯甲酸是一种酸性防腐剂，未离解酸具有抗菌活性。苯甲酸可作为食品和药品防腐剂，能够有效防止食品和药品变质，延长保质期。由于苯甲酸在ph2.5～4.0的液体环境中抗菌活性最强，因此被广泛用作饮料的防腐剂。有研究表明，摄入过量的苯甲酸可能会引起腹泻、腹痛和心跳加快等症状。过量的苯甲酸还会干扰人体的中间代谢过程，包括尿素循环，糖异生，脂肪酸代谢和三羧酸循环等。目前用于检测苯甲酸含量的主要方法有高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、分光光度法等，这些方法存在不同的缺点，或者样品前处理过程较为复杂，或者检测需要贵重的仪器设备，或者检测花费较长的时间。因此，有必要发展一类快速高效、低成本、高灵敏度地检测饮料中苯甲酸的新方法。

薄膜微萃取技术(tfme)是一种新型的固相微萃取(spme)技术，当具有相同体积的萃取相时，薄膜微萃取技术与传统的纤维式固相微萃取技术相比，拥有更大的表面积和更薄的萃取层厚度，从而缩短了分析时间。近年来，薄膜微萃取被广泛应用于生物化学分析、环境污染分析、食品安全分析等各种领域中。此外，表面增强拉曼光谱(sers)是指当被分析物分子吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上，其拉曼光谱强度可提高10³～10⁶倍的一类光谱技术。相较于传统分析检测技术，表面增强拉曼光谱可以实现非侵入性检测，适用于水溶液等多种体系，并且几乎无需试样制备，测量过程方便快捷，这些优点使得sers技术成为近年来的研究热点。但目前还未有一种薄膜微萃取结合表面增强拉曼光谱技术检测苯甲酸的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种检测饮料中苯甲酸的方法，将薄膜微萃取技术与表面增强拉曼光谱技术联用，既可以实现对苯甲酸的选择性分析，又可对苯甲酸进行快速检测，从而提高分析灵敏度并且缩短检测时间。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种检测饮料中苯甲酸的方法，包括：

1)制备硅胶萃取基板：

1-1)对玻璃片基底进行羟基化处理：将0.8～1.2cm×0.8～1.2cm的玻璃片依次在超纯水、乙醇、丙酮中各超声清洗8～12min，氮气吹干；另将浓硫酸和双氧水按照体积比6～8:2～4混合，冷却；将氮气吹干的玻璃片加入至该浓硫酸和双氧水混合液中，85～95℃水浴加热0.5～1.5h后，取出玻璃片，超纯水冲洗，氮气吹干；

1-2)往55～65℃的超纯水中加入羧甲基纤维素钠，搅拌溶解，得到浓度为0.3～0.5％的羧甲基纤维素钠溶液；

1-3)将步骤1-2)得到的羧甲基纤维素钠溶液与薄层色谱硅胶按照2～4ml:0.5～1.5g的配方比例混合，搅匀，得到糊状物；

1-4)将步骤1-3)得到的糊状物迅速涂在步骤1-1)得到的玻璃片上，不断振动玻璃片使其上的糊状物分布均匀；

1-5)将步骤1-4)得到的涂覆了糊状物的玻璃片放置在水平面上自然晾干，然后在100～110℃干燥20～40min，即得所述硅胶萃取基板，该硅胶萃取基板呈宏观平面形态，玻璃片基底上涂覆的硅胶层厚度为100～150μm，硅胶层中的硅胶材料呈多孔洞粗糙无定型状态；

硅胶材料是一类具有开放多孔结构、吸附性强、对多种有机物质均具有吸附性能的萃取材料，并且硅胶化学惰性很强，耐溶剂，不容易发生化学变化。将其作为薄膜微萃取材料，不仅成本低廉，更可以达到苯甲酸的良好富集效果。

此外，宏观平面形态的硅胶萃取基板可以提供更大的比表面积，并且成本低廉，制备快速；经羟基化处理的玻璃基底亲水性增加，使硅胶更容易铺开，有利于硅胶材料的均匀分布，具有更好的检测效果；宏观平面形态的硅胶萃取基板有利于喷洒或滴加适用于表面增强拉曼光谱分析的增强基底，并且便于拉曼激光的照射，从而可用于表面增强拉曼光谱分析。

2)薄膜微萃取富集待测样品中目标物苯甲酸：待测样品无需任何预处理，将待测样品移入薄膜微萃取装置中，将步骤1)制得的硅胶萃取基板浸入待测样品中，在室温、800～1500rpm搅拌速率下进行薄膜微萃取，萃取15～25min后，取出硅胶萃取基板，挥干水分；

3)表面增强拉曼光谱技术检测待测样品中目标物苯甲酸：将4～12μl浓缩的aunps滴加于步骤2)得到的硅胶萃取基板表面，之后用拉曼仪器进行检测。

一实施例中：所述步骤2)中，薄膜微萃取装置包括萃取支架和瓶身；该萃取支架包括瓶盖、密封垫和支撑架；该瓶盖与所述瓶身适配装接，所述密封垫设于该瓶盖内，所述支撑架位于瓶身内，支撑架上部与密封垫固接，支撑架下部设有用于安放所述硅胶萃取基板的u型平台。

一实施例中：所述瓶身的容积为10～50ml；

一实施例中：所述支撑架长度为5～7cm；

一实施例中：所述支撑架的宽度为0.5～1.0cm。

一实施例中：所述支撑架为铝片制成。

一实施例中：所述步骤3)中，浓缩的aunps的制备方法为：将4.5ml商品化的金纳米溶液原液(厦门普识纳米科技有限公司，型号为cp-1，金纳米颗粒浓度约为0.3mmol/l，平均粒径为55nm。)于3000～5000rpm条件下离心10～20min后弃去上清液以浓缩至0.1ml。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明将薄膜微萃取技术与表面增强拉曼光谱技术结合，利用薄膜微萃取技术分离富集样品中的苯甲酸，再采用表面增强拉曼光谱技术进行检测；苯甲酸分子的苯环结构具有很强的拉曼信号，可在一定程度上排除其他分子的干扰。该方法成本低廉，操作简单，灵敏度高，检测快速高效，适用于饮料等各种样品中苯甲酸的测定。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1(a)为本发明实施例中制备的硅胶萃取基板上硅胶层中硅胶材料的sem图；(b)为硅胶萃取基板的截面sem图。

图2为本发明实验例2中同一硅胶萃取基板上不同取样点sers光谱重现性结果示意图，图中横坐标为拉曼位移(cm^-1)，纵坐标为强度(a.u.)。

图3为本发明实验例2中不同硅胶萃取基板萃取同浓度苯甲酸的重现性结果示意图，图中纵坐标为峰强(a.u.)。

图4为本发明实验例3中用本发明的tfme-sers法测定不同浓度苯甲酸溶液的拉曼光谱图及其线性范围，图4(a)坐标分别为拉曼位移(cm^-1)、浓度(μg/ml)、强度(a.u.)；图4(b)中横坐标为浓度(μg/ml)，纵坐标为峰强(a.u.)。

图5为本发明实验例4中用本发明的tfme-sers法测定不同饮料样品中苯甲酸浓度的拉曼光谱图：(a)样品1，(b)样品2，(c)样品3，(d)样品4，(e)样品5以及(f)苯甲酸标准溶液(500μgml^-1)，图中横坐标为拉曼位移(cm^-1)，纵坐标为强度(a.u.)。

图6为本发明的薄膜微萃取装置的结构及组装过程示意图，其中a为萃取支架，b为瓶身，1为支撑架上部，2为密封垫，3为支撑架，4为支撑架下部，5为瓶盖。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例

一种检测饮料中苯甲酸的方法(tfme-sers法)，包括：

1)制备硅胶萃取基板：

1-1)对玻璃片基底进行羟基化处理：将1.0cm×1.0cm尺寸大小的的玻璃片依次在超纯水、乙醇、丙酮中各超声清洗10min，氮气吹干；另向烧杯中加入35ml浓硫酸，边搅拌边向其中加入15ml的双氧水，混合液冷却后，将清洗过后氮气吹干的玻璃片加入至该浓硫酸和双氧水混合液中，90℃水浴加热1h后，取出玻璃片，超纯水冲洗，氮气吹干；

1-2)往60℃的30ml超纯水中加入0.12g羧甲基纤维素钠，搅拌溶解，得到浓度为0.4％的羧甲基纤维素钠溶液；

1-3)将步骤1-2)得到的羧甲基纤维素钠溶液30ml倒入研钵中，然后加入10g薄层色谱硅胶(g型或者gf254型，本实施例中选用的薄层色谱硅胶购自阿拉丁试剂有限公司，g型，sku号t116946)，搅匀，得到糊状物；

1-4)用玻璃棒将步骤1-3)得到的糊状物迅速涂在步骤1-1)得到的玻璃片上，不断振动玻璃片使其上的糊状物分布均匀；

1-5)将步骤1-4)得到的涂覆了糊状物的玻璃片放置在水平面上自然晾干，然后在105℃烘箱中干燥30min，取出，即得所述硅胶萃取基板，放入干燥器中，备用；该硅胶萃取基板呈宏观平面形态，玻璃片基底上涂覆的硅胶层厚度为130μm，硅胶层中的硅胶材料呈多孔洞粗糙无定型状态；

2)薄膜微萃取(tfme)富集待测样品中目标物苯甲酸：将待测样品移入薄膜微萃取装置中，所述薄膜微萃取装置如图6所示，包括萃取支架a和瓶身b；该萃取支架a包括瓶盖5、密封垫2和支撑架3；该瓶盖5与所述瓶身b适配装接，所述密封垫2设于该瓶盖5内，所述支撑架3位于瓶身b内，支撑架上部1与密封垫2固接，支撑架下部4设有用于安放所述硅胶萃取基板的u型平台。

所述薄膜微萃取装置的瓶盖5与瓶身b可以采用现有的血清瓶瓶盖与瓶身改制而成，支撑架3采用长度5.5～6.5cm、宽度0.6～0.8cm的铝片制成。薄膜微萃取装置的组装过程如图6所示：根据需要，选用容积10～30ml的血清瓶，将瓶盖5内的密封垫2取出并在中部开一小口，将铝片上端穿过小口并超出约0.5cm，将超出部分翻折固定于密封垫2上表面，铝片下端取1cm垂直于铝片平面折叠，其末端再取0.2～0.3cm沿垂直方向折起，使下部呈现u型形成所述u型平台，用于放置硅胶萃取基板，防止掉落；然后将密封垫2放回瓶盖5内，如此即形成萃取支架a。

将待测样品10ml加入至薄膜微萃取装置的瓶身b内，硅胶萃取基板放在萃取支架a的u型平台上，再将萃取支架a通过瓶盖5与瓶身b螺纹配合装接，支撑架3下部及硅胶萃取基板浸入待测样品液面下，并使硅胶萃取基板位于待测样品液体中部；随后在室温、磁子搅拌速率1000rpm的条件下进行薄膜微萃取，萃取20min后，取出萃取支架a，取下硅胶萃取基板并挥干水分，留待下一步检测；

3)表面增强拉曼光谱技术(sers)检测待测样品中目标物苯甲酸：将5～10μl浓缩的aunps滴加于步骤2)得到的硅胶萃取基板表面，之后用拉曼仪器进行检测。该浓缩的aunps的制备方法为：将4.5ml商品化的金纳米溶液原液于4000r/min条件下离心15min后，弃去上清液，以浓缩至0.1ml。

上述实施例可实现下述实验例之效果：

实验例1

本实验例对实施例中得到的硅胶萃取基板进行了表征。图1a为硅胶萃取基板上硅胶层中硅胶薄膜萃取材料的扫描电镜图，图中表明该硅胶材料表面微观呈粗糙无定型状态，具有较多孔洞，这使得该涂层具有较多的吸附位点与较大的吸附面积。如图1b所示，从硅胶萃取基板的截面sem图可知，该硅胶萃取涂层的厚度约为130μm，较薄的涂层厚度有利于传质过程的快速进行，并且较大的萃取面积保证了较大的吸附容量，有助于分析方法灵敏度的提高。

实验例2

本实验例检验了实施例中检测方法的重现性，对同一硅胶萃取基板的不同取样点sers信号的重现性及不同硅胶萃取基板对同一分析物信号的重现性进行了考察。首先，实验采用500μg/ml的苯甲酸的标准溶液作为萃取液，选取单片硅胶萃取基板进行tfme过程，随后在萃取片喷洒金胶纳米粒子的范围内随机选取10个区域点采集其sers信号，所得结果如图2所示。可以看出硅胶萃取基板不同区域内所得分析物苯甲酸的sers信号十分明显，且具有较高的一致性。

其次，实验随机选取5片不同硅胶萃取基板，并将其应用于同一浓度苯甲酸标准溶液tfme-sers检测的重现性考察中，每个硅胶萃取基板的信号采集5次，所得苯甲酸特征峰的强度差异如图3所示。不同硅胶萃取基板萃取苯甲酸检测的sers信号rsd为10.2％，显示出较高的重现度。

实验例3

本实验例考察了实施例中检测方法的线性范围以及检测限，实验用该方法分别对25μg/ml～500μg/ml的苯甲酸标准溶液进行了测定。测定时，分别将10ml25μg/ml～500μg/ml的苯甲酸标准溶液移入10ml血清瓶中，将硅胶萃取基板置于薄膜微萃取装置中浸入样品中。萃取过程中溶液处于搅拌状态，磁子搅拌速率为1000rpm，萃取时间为20min，萃取温度为室温，萃取过程完成后，将硅胶萃取基板从薄膜微萃取装置中取下。待硅胶萃取基板表面水分挥发后，将10μl金胶溶液浓缩后的aunps滴加在硅胶萃取基板表面，之后用表面增强拉曼光谱进行检测。所有测定样品均一式三份，表面增强拉曼光谱数据均采集3次，所得数据为测定结果的平均值。

所得sers谱图及线性关系如图4a及4b所示，从图4a可看出随着苯甲酸浓度的降低，苯甲酸的sers谱图强度也相应降低，至较低浓度25μg/ml时，其特征谱图仍然清晰可见，说明该方法的灵敏度较高。图4b以苯甲酸最强的特征峰994cm^-1的相对峰强为纵坐标，苯甲酸浓度为横坐标来绘制标准曲线，其线性相关系数达到0.995，显示出较好的线性。经计算，该方法检测限为3.6μg/ml(s/n＝3)，完全符合饮料中苯甲酸的检测要求。

实验例4

本实验例考察了实施例中检测方法的可靠性，实验采用gb/t5009.29-2003中高效液相色谱法作为对照方法，对8种不同市售饮料中苯甲酸的含量进行了测定，其结果如表1和图5所示。从结果可看出，两种方法的测定结果基本一致，说明建立的新方法具有较高的可靠性。并且tfme-sers法可实现多个样品的同时萃取分析，从而大大缩短分析时间。由图5可知，实际样品与苯甲酸标准溶液经过tfme-sers得到的拉曼光谱图谱峰较为一致，并且实际样品的谱图中并未出现强度较大的杂峰，说明该方法可大大降低检测的背景干扰，在一定程度上实现选择性检测。

表1tfme-sers与国标方法测定饮料中苯甲酸结果对比

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。