一种制备组织切片的方法与流程

本发明涉及一种制备切片的方法，具体涉及一种制备组织切片的方法。

背景技术：

石蜡切片是组织学常规制片技术中应用最广泛的方法。该方法不仅可用于观察正常细胞组织的形态结构，亦用以病理学和法医学等学科研究、观察及判断细胞组织的形态变化；教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。石蜡切片也已相当广泛地应用于许多学科领域的研究。

生物体活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经组织切片制成切片后方能清晰辨认其形态结构。在制作组织切片过程中，组织块须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、透明、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。其中，脱水是制片中一个十分关键的问题，需要特别小心处理。一般操作中，用不同梯度的乙醇作为脱水剂，处理过程中易引起组织块收缩或脆化，且高浓度的乙醇会吸收空气中的水分而使组织块脱水不彻底。对未脱好水的组织块切片，必然导致组织出现破碎或空洞等现象，而使切片失败。此外，选择乙醇等非石蜡溶剂作为脱水剂，组织块脱水后必须经过透明才能进行透蜡包埋。常规的组织切片技术步骤繁多，制片耗时久，结果存有多处风险。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种制备组织切片的方法。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明公开了一种制备组织切片的方法，包括如下步骤：

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的二氧六环水溶液中进行脱水；

3)透蜡包裹：将脱水后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；

4)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；

5)再水化：将石蜡切片依次置于浓度从高到低的二氧六环水溶液中水化；

6)染色：采用染色剂对切片进行染色；

7)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；

8)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签。

优选地，步骤1)中，所述固定剂为波恩氏液、戊二醛、甲醛溶液、多聚甲醛溶液中的一种。更优选地，所述甲醛溶液的质量分数为30～50wt％。更优选地，所述甲醛溶液的质量分数为40wt％。优选地，所述多聚甲醛溶液的质量分数为1～5wt％。更优选地，所述多聚甲醛溶液的质量分数为4wt％。

优选地，步骤1)中固定剂的体积为组织块体积的12～18倍。优选地，步骤1)中固定时间为8～24h。优选地，步骤1)中固定温度为低于环境温度。

优选地，步骤2)中，浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％。

优选地，步骤2)中在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25～35min。

优选地，步骤2)中在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25～35min。

优选地，步骤2)中在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25～35min。

优选地，步骤2)中在浓度为100wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为10～20min。

优选地，步骤3)中，浸入熔融的石蜡中的时间为每次25～35min。优选地，步骤3)中浸入次数为3次。

优选地，步骤4)中，所述粘片剂为多聚赖氨酸、3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、铬矾明胶液和甲醛明胶液中的一种或多种。

优选地，步骤5)中，浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％和30wt％。

优选地，步骤6)中，染色剂为苏木精和伊红溶液。即染色时采用苏木精-伊红染色法染色。

本发明为一种简易的组织切片制作方法，要解决的主要问题是提供一种操作更简单的、效果更好的石蜡组织切片技术方法。为解决上述问题，本发明选用二氧六环作为脱水剂，脱水后无需透明便可透蜡包裹，减少制片步骤，缩短了制片时间，并且选用二氧六环防止了组织块收缩，使切片质量更高，优化组织切片技术；为组织学及生物学等研究提供支持。

说明书附图

图1为采用实施例1中方法制备的七彩神仙鱼躯干部切片效果图；

图2为采用实施例1中方法制备的七彩神仙鱼雌性性腺切片效果图；

图3为采用对比例1中方法制备的七彩神仙鱼躯干部切片效果图；

图4为采用对比例1中方法制备的七彩神仙鱼雌性性腺切片效果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

本发明公开了一种制备组织切片的方法，包括如下步骤：

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；所述固定剂为波恩氏液；固定剂的体积为组织块体积的15倍；固定时间为8h；固定温度为低于环境温度；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的二氧六环水溶液中进行脱水；浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为30min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为30min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为30min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为30min；在浓度为100wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为15min；

3)透蜡包裹：将脱水后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；浸入熔融的石蜡中的时间为每次30min；步骤3)中浸入次数为3次；

4)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；烘干温度为35℃；粘片剂为多聚赖氨酸；

5)水化：将组织块依次置于浓度从高到低的二氧六环水溶液中进行水化；浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在浓度为100wt％的二氧六环溶液中水化时间为5min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；

6)染色：采用染色剂对切片进行染色；染色剂为苏木精和伊红溶液；

7)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；浸入二甲苯的次数为3次；每次更换新的二甲苯；每次浸入二甲苯的时间为2min

8)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签。

采用实施例1中方法制备出来的12日龄七彩神仙鱼躯干部切片效果和七彩神仙鱼雌性性腺切片效果见图1和图2所示。

实施例2

本发明公开了一种制备组织切片的方法，包括如下步骤：

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；所述固定剂为4wt％多聚甲醛溶液；固定剂的体积为组织块体积的18倍；固定时间为24h；固定温度为低于环境温度；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的二氧六环水溶液中进行脱水；浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为30min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为25min；在浓度为100wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为10min；

3)透蜡包裹：将脱水后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；浸入熔融的石蜡中的时间为每次25min；步骤3)中浸入次数为3次；

4)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；烘干温度为30℃；粘片剂为3-氨基丙基)三乙氧基硅烷apes；

5)水化：将组织块依次置于浓度从高到低的二氧六环水溶液中进行水化；浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在浓度为100wt％的二氧六环溶液中水化时间为5min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；

6)染色：采用染色剂对切片进行染色；染色剂为苏木精和伊红溶液；

7)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；浸入二甲苯的次数为2次；每次更换新的二甲苯；每次浸入二甲苯的时间为5min

8)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签。

实施例3

本发明公开了一种制备组织切片的方法，包括如下步骤：

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；所述固定剂为40wt％甲醛溶液；固定剂的体积为组织块体积的12倍；固定时间为10h；固定温度为低于环境温度；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的二氧六环水溶液中进行脱水；浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为35min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为35min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为35min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为35min；在浓度为100wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为20min；

3)透蜡包裹：将脱水后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；浸入熔融的石蜡中的时间为每次35min；步骤3)中浸入次数为3次；

4)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；烘干温度为40℃；粘片剂为铬矾明胶液；

5)水化：将组织块依次置于浓度从高到低的二氧六环水溶液中进行水化；浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在浓度为100wt％的二氧六环溶液中水化时间为5min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；

6)染色：采用染色剂对切片进行染色；染色剂为苏木精和伊红溶液；

7)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；浸入二甲苯的次数为5次；每次更换新的二甲苯；每次浸入二甲苯的时间为3min

8)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签

实施例4

本发明公开了一种制备组织切片的方法，包括如下步骤：

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；所述固定剂为戊二醛；固定剂的体积为组织块体积的12～18倍；固定时间为8～24h；固定温度为低于环境温度；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的二氧六环水溶液中进行脱水；浓度从低到高的二氧六环水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为32min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为32min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为32min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为32min；在浓度为100wt％的二氧六环水溶液中脱水时间为18min；

3)透蜡包裹：将脱水后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；浸入熔融的石蜡中的时间为每次28min；步骤3)中浸入次数为3次；

4)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；烘干温度为30℃；粘片剂为甲醛明胶液；

5)水化：将组织块依次置于浓度从高到低的二氧六环水溶液中进行水化；浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在浓度为100wt％的二氧六环溶液中水化时间为5min；在浓度为90wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为70wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为50wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；在浓度为30wt％的二氧六环水溶液中水化时间为5min；

6)染色：采用染色剂对切片进行染色；染色剂为苏木精和伊红溶液；

7)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；浸入二甲苯的次数为4次；每次更换新的二甲苯；每次浸入二甲苯的时间为4min

8)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签。

对比例1

1)固定组织块：将组织块固定在固定剂中；所述固定剂为波恩氏液；固定剂的体积为组织块体积的15倍；固定时间为8h；固定温度为低于环境温度；

2)脱水：将组织块依次置于浓度从低到高的无水乙醇溶液中进行脱水；浓度从低到高的无水乙醇水溶液的浓度依次为30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在浓度为30wt％的无水乙醇水溶液中脱水时间为60min；在浓度为50wt％的无水乙醇水溶液中脱水时间为60min；在浓度为70wt％的无水乙醇水溶液中脱水时间为60min；在浓度为90wt％的无水水溶液中脱水时间为60min；在浓度为100wt％的无水乙醇水溶液中脱水时间为35min；

3)透明：将脱水后的组织块浸入二甲苯中透明，置换出组织内的脱水剂，浸入二甲苯次数为3次，每次更换新的二甲苯，第一次浸入二甲苯的时间为40min，第二次和第三次浸入二甲苯的时间为20min；

4)透蜡包裹：将透明后的组织块全部浸入熔融的石蜡中用石蜡包裹好；浸入熔融的石蜡中的时间为每次30min；步骤3)中浸入次数为4次；

5)切片烘干：将组织块进行切片，并将切片投入温水中，使得切片充分展开后，贴于涂有粘片剂的载玻片中，烘干；烘干温度为35℃；粘片剂为多聚赖氨酸；

6)脱蜡：将切片浸入二甲苯中使石蜡溶解，浸入二甲苯的次数为2次，每次更换新的二甲苯，第一次浸入二甲苯时间为10min，第二次浸入二甲苯时间为5min。

7)水化：将组织块依次置于浓度从高到低的无水乙醇水溶液中进行水化；浓度依次为100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。浸入浓度为100wt％的无水乙醇溶液2次，每次更换新的无水乙醇，每次浸入100wt％无水乙醇溶液的时间为5min；在浓度为90wt％的无水乙醇溶液中水化时间为5min；在浓度为70wt％的无水乙醇水溶液中水化时间为5min；在浓度为50wt％的无水乙醇水溶液中水化时间为2min；在浓度为30wt％的无水乙醇水溶液中水化时间为2min；

8)染色：采用染色剂对切片进行染色；染色剂为苏木精和伊红溶液；

9)透明：将染色后切片浸入二甲苯中使得切片脱蜡；浸入二甲苯的次数为3次；每次更换新的二甲苯；每次浸入二甲苯的时间为2min；

10)封藏：取出切片，用滤纸吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片剂，盖上盖玻片，贴上标签。

使用对比例1中方法制备的12日龄七彩神仙鱼躯干部切片效果图和七彩神仙鱼雌性性腺切片效果图分别如图3和图4所示。实施例1～4中制备切片时间比对比例1短200多分钟，制备出来的组织块不会产生收缩及硬化现象，能够维持组织块的形态和组织细胞的原有形态。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。