细胞分离制片染色一体装置和循环肿瘤细胞捕获方法与流程

本申请属于体外诊断和微流控技术领域，特别是涉及一种细胞分离制片染色一体装置和循环肿瘤细胞捕获方法。

背景技术：

循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)是指从原发肿瘤扩散进入外周循环血液系统中的肿瘤细胞，它的出现标志着肿瘤细胞已经开始从病灶组织向四周扩散，从而可能导致更多器官组织产生病变。

循环肿瘤细胞可在肿瘤发生的早期出现，且研究表明约90％的癌症死亡案例与ctcs扩散有关，因此，ctcs检测在重大疾病的早期预防、治疗效果评估、药物敏感性测试及肿瘤复发监测等医学应用方面具有十分重要的意义。

循环肿瘤细胞检测的最大难题在于其数量极少：通常在临床上，人们研究的对象是一个非齐性总体，其中包含了大量的细胞信息，而ctcs对人体正常血细胞的比例仅约为1:109，或在1ml血液中仅有1～100个ctcs,因此在检测前必须对其进行分选富集，以去除血液中的大部分红细胞和白细胞。

理想的ctcs分选应能达到以下三点要求：首先要能将尽量多的非目标细胞分离出去，其次要在特定的出口收集到尽量多的目标细胞；最后要考虑到ctcs数量稀少导致需要处理的样本量较大以及细胞活性等因素，要求能在短时间内处理大量的样品。

传统的细胞分选多在宏观尺度下进行，如离心分选、化学溶解、基于荧光或磁珠技术的抗体标记分选等，这些方法虽然成熟可靠，但系统复杂、操作繁琐、需要样品量大，在细胞转移、容器更换及样品化学处理等环节极易造成目标细胞的损失，难以满足上述三点分选要求。

目前唯一通过美国食品药品监督管理局认证的用于血液中ctcs分选、计数的商业化产品，cellsearch采用外面包被了特异性抗体抗epcam(上皮细胞粘附因子)的免疫纳米磁珠，通过抗原抗体反应，与血液中表达epcam的ctcs结合，并进一步通过荧光反应识别ctcs。该计数虽然拥有较高的灵敏度，但存在仪器及消耗的试剂昂贵，并且采用抗体捕获细胞的局限性大，并不是所有的肿瘤细胞都表达epcam，检测效率较低。

兴起于20世纪90年代的微流控技术，通过微米级别的流道精确操控微升、毫升级别的样品。得益于其特征尺寸与细胞尺寸正好匹配，微流控技术在细胞分选方面优势巨大。与常规分选方法相比，微流控器件具有消耗样品量少，有较高的分辨精度及灵敏度、易于集成及微型化等优点，且在微流控器件中可以连续地实现样品注入-细胞分选-目标细胞识别的整个过程，极大简化操作，并减少细胞损失。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞分离制片染色一体装置和捕获方法，以克服现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请实施例公开一种细胞分离制片染色一体装置，包括基材以及沿第一方向延伸于基材内的沟道，所述沟通位于第一方向的两端分别形成有样品入口和样品出口，所述沟道内并列设置有n排微柱阵列，n≥2，每排所述微柱阵列沿第二方向延伸，所述第二方向垂直于所述第一方向，每排所述微柱阵列分别包括间隔设置的多个微柱，相邻所述微柱之间形成有捕捉间隙，并满足：

(a)、自样品入口至样品出口方向，第x排微柱阵列的捕捉间隙＞第x+1排微柱阵列的捕捉间隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱阵列的捕捉间隙小于循环肿瘤细胞的外径。

优选的，在上述的细胞分离制片染色一体装置中，所述基材包括上下叠加设置的聚二甲基硅氧烷和标准载玻片，所述沟通形成于聚二甲基硅氧烷和标准载玻片之间。

相应的，本申请还公开了一种细胞分离制片染色一体装置的循环肿瘤细胞捕获方法，包括步骤：

(1)、采用红细胞裂解液裂解肿瘤病人血样中的红细胞，离心吸取上清液，用细胞缓冲液重悬剩余细胞；

(2)、将获得的细胞悬液从样品入口通入微流控芯片中，将细胞固定液通入微流控芯片中，完成循环肿瘤细胞的捕获。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，步骤(1)中，所述的细胞裂解液为红细胞裂解液。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，细胞缓冲液为牛血清白蛋白和tewwn20的磷酸缓冲液。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，细胞固定液为4％多聚甲醛水溶液。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，还包括循环肿瘤细胞荧光染色步骤：

(3)、将细胞透膜液通入微流控芯片中，对细胞进行透膜；将细胞清洗液通入微流控芯片，对透膜后的细胞进行清洗；将免疫荧光染料通入微流控芯片中，避光孵育，对细胞进行免疫荧光染色；将细胞核染料通入微流控芯片中，静置，对细胞核进行染色；将细胞清洗液通入微流控芯片，对染色后的细胞进行清洗。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，所述细胞透膜液为表面活性剂tritonx100水溶液。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，所述细胞清洗液为磷酸缓冲液。

优选的，在上述的循环肿瘤细胞捕获方法中，所述的免疫荧光染料为抗细胞角蛋白荧光染料；所述的细胞核染料为hoechst染料。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用微流控芯片技术，与传统的方法相比具有消耗样品量少、有较高的分辨精度及灵敏度、易于集成及微型化等优点。另外基于循环肿瘤细胞与血细胞外形尺寸不同的特性进行循环肿瘤细胞的捕获，并不依赖于epcam抗体的表达，可以识别所有的循环肿瘤细胞，避免假阳性和假阴性的结果。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明具体实施例中细胞分离制片染色一体装置的结构示意图；

图2所示为图1中a的放大示意图；

图3所示为本发明具体实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞抗细胞角蛋白染料表达阳性的染色图；

图4所示为本发明具体实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞细胞核染料表达阳性染色图。

图5所示为本发明具体实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞白细胞共同抗原染料表达阴性染色图。

具体实施方式

循环肿瘤细胞：从原发肿瘤扩散进入外周循环血液系统中的肿瘤细胞。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

结合图1和图2所示，细胞分离制片染色一体装置，包括基材1以及沿第一方向延伸于基材内的沟道2，沟通2位于第一方向的两端分别形成有样品入口3和样品出口4，沟道2内并列设置有n排微柱阵列5，n≥2，每排微柱阵列5沿第二方向延伸，第二方向垂直于第一方向，每排微柱阵列5分别包括间隔设置的多个微柱6，相邻微柱6之间形成有捕捉间隙7，并满足：

(a)、自样品入口至样品出口方向，第x排微柱阵列的捕捉间隙＞第x+1排微柱阵列的捕捉间隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱阵列的捕捉间隙小于循环肿瘤细胞的外径。

进一步地，基材1包括上下叠加设置的聚二甲基硅氧烷(pdms)和标准载玻片，沟通形成于聚二甲基硅氧烷和标准载玻片之间。

该技术方案中，微流控芯片采用多段微住阵列结构串联而成，注入芯片中的细胞依据其自身尺寸的不同会在微柱阵列处被捕获。同时提供的检测试剂盒包括：红细胞裂解液、细胞缓冲液、细胞固定液、细胞透膜液、细胞清洗液、免疫荧光染料、细胞核染料。检测试剂盒主要用于血样的前处理以及在微流控芯片中捕获到的循环肿瘤细胞的识别。本案主要用于肿瘤的早期诊断、预后评估、肿瘤复发转移检测、快速判断化疗效果以及指导个体化医疗。

基于细胞分离制片染色一体装置的循环肿瘤细胞捕获和检测方法，包括步骤：

1)、血样的前处理：

a:肿瘤病人血样为2ml人体外周血，采用红细胞裂解液裂解肿瘤病人血样中的红细胞，红细胞裂解液优选为利用细胞内外存在盐离子浓度差而导致细胞膜胀破的原理来裂解无核红细胞。

b：红细胞裂解后离心吸取上清液。

c:红细胞裂解不完全时重复上述步骤1-2次。

d:上清液去除后，试管底部剩余白细胞和癌细胞，用细胞缓冲液重悬剩余细胞，细胞缓冲液优选为牛血清白蛋白(bsa)和tewwn20(非离子型去污剂)的磷酸缓冲液。

2)、微流控芯片捕获癌细胞。

a:将上述获得的细胞悬液按一定流速通入芯片中。

b:将细胞固定液通入芯片中，完成循环肿瘤细胞的捕获，细胞固定液优选为4％多聚甲醛水溶液。

3)、循环肿瘤细胞荧光染色。

a:将细胞透膜液通入芯片中，对细胞进行透膜，细胞透膜液优选为表面活性剂tritonx100(非离子型表面活性剂)水溶液。

b:将细胞清洗液通入芯片，对透膜后的细胞进行清洗，细胞清洗液优选为磷酸缓冲液。

c:将免疫荧光染料通入芯片中，避光孵育，对细胞进行免疫荧光染色，免疫荧光染料优选为抗细胞角蛋白荧光染料。

d:将细胞核染料通入芯片中，静置，对细胞核进行染色，细胞核染料优选为hoechst染料。

f:将细胞清洗液通入芯片，对染色后的细胞进行清洗。

g:在荧光显微镜下观察。

图3所示为本实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞抗细胞角蛋白染料表达阳性的染色图。

图4所示为本实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞细胞核染料表达阳性染色图。

图5所示为本实施例中被捕获后的循环肿瘤细胞白细胞共同抗原染料表达阴性染色图。

只有当抗细胞角蛋白染料和hoechst染料同时表达阳性，白细胞共同抗原染料表达阴性时，才能判定该细胞为循环肿瘤细胞。

综上所述，本案基于人体外周血中循环肿瘤细胞与血细胞间外形尺寸的差异，采用多段微住阵列结构串联而成的微流控芯片进行循环肿瘤细胞的捕获。并采用免疫组化的方法对捕获的循环肿瘤细胞进行识别。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。