一种六神曲发酵过程在线质量检测系统的制作方法

本发明涉及一种六神曲发酵过程高效液相色谱在线质量检测系统。

背景技术：

六神曲又名六曲、神曲，最早收载于《药性论》，是一味最具代表性的传统中药发酵炮制品，部颁标准其处方组成为辣蓼500g，苍耳草500g，青蒿500g，苦杏仁100g，赤小豆100g，麦麸5000g，面粉2500g，具有健脾和胃、消食调中的功效。

发酵技术在中药炮制过程中的应用具有悠久的历史，它是指在一定的湿度和温度条件下，经处理或者净制后的药材或药材拌加辅料等，利用酶和微生物的分解催化作用，使药物发泡、生衣的炮制方法。

目前，对于六神曲传统发酵炮制过程的控制多凭借主观经验，控制技术滞后，缺乏客观的指标和有效的方法，六神曲发酵产品的质量稳定性不佳，不同批次产品之间的质量差异较大。采用现代发酵工艺生产的六神曲也仅仅是对发酵过程的温度、湿度等工艺参数进行控制，部颁标准和地方标准中仅有处方、制法、性状及用法用量等简单描述，而对生产的主体——处于动态变化的发酵物料并不进行相关质量指标的检测，缺乏有效成分鉴别及含量、水分、灰分等常规检查项目，难以控制药材质量。

因此，为了实时了解发酵过程中间产品质量的动态变化，有利于通过控制工艺参数优化中间产品质量的发展方向，从而提高终产品的质量合格率，需要一种能更全面、准确、可靠反映六神曲发酵过程质量指标的在线检测方法。

技术实现要素：

本发明涉及一种六神曲发酵过程高效液相色谱在线质量检测系统。

本发明提供了一种六神曲发酵过程在线质量检测系统，它包括如下步骤：

a、在六神曲发酵过程不同时间点取样；

b、采用高效液相色谱法获取每个样品的液相色谱数据；分别测定每个样品中青蒿素、槲皮素、芦丁和苦杏仁苷的含量；

c、蛋白酶酶活力预测：

y＝0.0021x1+3.1067x2-1.4643x3+0.0116x4+0.2095x5+27.6106；

淀粉酶的酶活力预测:

y＝0.3054x1+89.2468x2-16.0689x3-0.0748x4+0.2888x5+352.1262；

其中，x1为青蒿素，x2为槲皮素，x3为芦丁，x4为苦杏仁苷，x5为发酵时间，y为淀粉酶和/或蛋白酶活力。

d、根据蛋白酶酶活力、淀粉酶酶活力监测六神曲的发酵进展。

其中，a步骤所述的六神曲的发酵为自然发酵；发酵条件为：温度30-35℃，湿度70-80％。

其中，b步骤所述的高效液相色谱法条件为：

色谱柱：c18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)，线性梯度洗脱，洗脱程序为0～15min，5％～10％(a)；15～50min，10％～30％(a)；50～80min，30％～60％(a)；80～100min，60％～95％(a)；100～110min，95％(a)；110～120min，95％～5％(a)；120～125min，5％(a)；检测波长210nm；流速1ml/min；柱温：30℃。

六神曲是传统发酵制剂，青蒿、辣蓼、苍耳草、苦杏仁、赤小豆为主要原料，组成复杂。六神曲的原料药材质量对六神曲的质量有着较大的影响，有必要对这些原料药材的质量进行监控。但是上述原料药材在六神曲中的比例较小，同时原料药材在发酵过程中药材成分会发生一定的变化，许多成分难以检测，找到一个合适的检测指标来监控原料药材的质量是困难的。

本发明六神曲发酵过程质量指标的在线检测系统，有利于实时了解发酵过程中间产品质量的动态变化，有利于通过工艺参数的控制优化中间产品质量的发展方向，从而提高终产品的质量合格率。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明六神曲液相图谱

图2蛋白酶酶活力的实测值与预测值之间的相关关系

图3淀粉酶酶活力的实测值与预测值之间的相关关系

图4蛋白酶活力变化曲线

图5淀粉酶活力变化曲线

具体实施方式

材料与试剂：青蒿素标准对照品、槲皮素标准对照品、芦丁标准对照品、苦杏仁苷标准对照品；甲醇、乙腈、福林酚、碘、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫代硫酸钠、硫酸、氢氧化钠、酪氨酸均为分析纯；水为超纯水。

实验仪器：

样品均来自四川辅正药业有限责任公司

实施例1本发明六神曲发酵过程高效液相色谱在线质量检测系统的建立方法

1材料与方法

1.1六神曲样品的制备及取样

将六神曲原料放入恒温恒湿箱中发酵，保持温度30℃～35℃，湿度70％～80％，并开始计时，从发酵开始每隔一定时间进行一次取样，一直到六神曲发酵至样品表面长满白霉，约130多个小时，取出的样品在-20℃保存，备用。

1.2高效液相色谱数据采集

1.2.1供试品溶液的制备

称取粉碎的样品5.00g于锥形瓶中，加入10ml甲醇，称重，超声提取30min，之后补足损失的甲醇重量，过滤膜，装入进样瓶中，备用。

1.2.2高效液相色谱数据(见图1)

高效液相色谱法条件为：色谱柱：c18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)，线性梯度洗脱，洗脱程序为0～15min，5％～10％(a)；15～50min，10％～30％(a)；50～80min，30％～60％(a)；80～100min，60％～95％(a)；100～110min，95％(a)；110～120min，95％～5％(a)；120～125min，5％(a)；检测波长210nm；流速1ml/min；柱温：30℃。

用外标法测定样品中各组分的含量。

青蒿素标准曲线为y＝0.00002330x+0.07005874，r²＝0.9999；

槲皮素标准曲线为y＝0.00000026x+0.00038846，r²＝0.9992；

芦丁标准曲线为y＝0.00000038x+0.00180675，r²＝0.9999；

苦杏仁苷标准曲线为y＝0.00000285x+0.01223938，r²＝0.9998。

1.3蛋白酶与淀粉酶活力测定

1.3.1酶液制备

准确称取4.00g六神曲样品于碘量瓶中，加入40.00ml蒸馏水，于40℃恒温水浴并间断搅拌1h，过滤，即得酶液，置于4℃保存，备用。

1.3.2蛋白酶活力测定

按福林酚比色法进行测定。标准曲线回归方程为y＝0.0797x+0.0264，r²＝0.9982。

1.3.3淀粉酶活力测定

按碘量法进行测定。

1.4模型的建立

使用matlabr2014b软件，将测得的实验数据带入方程进行非线性拟合，得到蛋白酶和淀粉酶酶活力与青蒿素、槲皮素、芦丁、苦杏仁苷和发酵时间关系的预测模型。

2结果

2.1六神曲中蛋白酶与淀粉酶的酶活测定结果

本发明采用福林酚法和碘量法分别测定了六神曲样品的蛋白酶活力与淀粉酶活力。测定结果见下表1与表2。蛋白酶与淀粉酶活力的分布范围广，基本符合建模要求。

表1六神曲中蛋白酶活力测定结果

表2六神曲淀粉酶活力测定结果

2.2六神曲的液相色谱图分析

通过外标法测得六神曲样品中青蒿素、槲皮素、芦丁和苦杏仁苷在不同发酵时间的含量。

3模型的建立

蛋白酶的酶活力预测模型为:

y＝0.0021x1+3.1067x2-1.4643x3+0.0116x4+0.2095x5+27.6106；

淀粉酶的酶活力预测模型为:

y＝0.3054x1+89.2468x2-16.0689x3-0.0748x4+0.2888x5+352.1262。

建立的蛋白酶和淀粉酶酶活力的实测值与预测值之间的相关关系见图2－3。

上述结果表明，所建酶活力预测模型具有较好的预测能力。

实施例2本发明六神曲发酵过程高效液相色谱在线质量检测系统验证

将六神曲原料放入恒温恒湿箱中发酵，保持温度30℃～35℃，湿度70％～80％，并开始计时，从发酵开始每隔一定时间进行一次取样，一直到六神曲发酵至样品表面长满白霉，约130多个小时，取出的样品在-20℃保存，备用。

高效液相色谱法条件为：色谱柱：c18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)，线性梯度洗脱，洗脱程序为0～15min，5％～10％(a)；15～50min，10％～30％(a)；50～80min，30％～60％(a)；80～100min，60％～95％(a)；100～110min，95％(a)；110～120min，95％～5％(a)；120～125min，5％(a)；检测波长210nm；流速1ml/min；柱温：30℃。

计算蛋白酶酶活力、淀粉酶酶活力，与实际检测的蛋白酶酶活力、淀粉酶酶活力对比(见图4、图5)，判断六神曲的发酵进展。

试验证明，本发明六神曲发酵过程质量指标的在线检测系统，测定的蛋白酶酶活力、淀粉酶酶活力准确、有利于实时了解发酵过程中间产品质量的动态变化，更有利于通过工艺参数的控制优化中间产品质量的发展方向，从而提高终产品的质量合格率。