一种户尘螨特异性IgE半定量检测试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及一种检测户尘螨特异性ige的试剂盒及其检测方法，具体涉及一种基于荧光量子点免疫层析试纸和图像分析技术的户尘螨特异性ige半定量检测试剂盒及其检测方法。本发明属于免疫分析技术领域。

背景技术：

尘螨是最重要吸入物过敏原之一，普遍存在于室内中，基中的户尘螨和粉尘螨是最主要的两种螨，其中，户尘螨(housedustmite，hdm)，体呈长圆形，体长约240～280μm，又称欧洲尘螨，是欧亚大陆上最优热的致敏性螨种。上海、北京、广州、哈儿滨等地调查表明，户尘螨也是我国居室优势螨种，存在于卧室的床、被、枕头以及地毯、沙发等处。我国长江以南地区的优势种，在北方密度较低。

户尘螨过敏是指当接触户尘螨过敏原后，机体能产生较多的尘螨特异性ige抗体，此种抗体能渗入粘膜组织，并与相应抗原在肥大细胞和嗜碱性细胞表面相结合，使之成为致敏组织。多数过敏性哮喘的发生、发展和症状的持续与尘螨过敏密切相关。研究表明，有80％的哮喘患者尘螨点刺试验阳性，而正常人群的阳性率为5％-30％。世界各地流行病学调查均表明尘螨是最主要的过敏原，多数过敏性哮喘的发生、发展、症状的急性发作和持续都与尘螨过敏密切相关。尘螨也是过敏性鼻炎最主要的过敏原，鼻腔受到尘螨刺激后出现急性反应和迟发反应，可通过长期诱导鼻黏膜炎症，进一步发展为鼻息肉。过敏性鼻炎是一个全球性健康问题，它在世界各地均常见，其全球全病率达10％-25％，并且患者数仍在增加，它可以影响患者的日常生活、学习及工作效率，并且造成经济上的严重负担。此外，尘螨被认为是特应性皮炎最重要的过敏原之一，而且患者对尘螨的过敏程度与特应性皮炎的病情严重程度密切相关。尘螨引起特异性皮炎的途径有两个：直接通过皮肤引起和通过吸入尘螨过敏引起。

传统用于户尘螨特异性ige检测的方法是免疫印迹法，但该方法耗时长、步骤复杂，且需要特殊的仪器才能够完成。

免疫检测技术是基于抗体与抗原间特异性反应的原理对待测物进行定性定量分析的检测方法，低浓度抗原的免疫检测依然是临床诊断和检验检疫领域面临的重要问题，低浓度抗原的准确、可靠检测可以为疾病的早期诊断和及时治疗提供重要的科学依据，提高免疫检测极限的方法之一是制备高灵敏的免疫探针。荧光免疫分析技术是利用荧光物质标记抗体或者抗原分子，通过与待分析物的特异性结合后检测荧光信号的强度变化，实现对目标分析物的定性和定量检测。量子点(quantumdot，简称qds)作为一种新型荧光纳米晶，具有一些独特的荧光性能，如荧光发射波长可控、发射峰狭窄对称、激发波长范围广、量子效率高、光稳定性好等，量子点的上述荧光特性为制备高灵敏度的免疫荧光探针提供了很好的选择(参见文献：j.lei,h.ju,signalamplificationusingfunctionalnanomaterialsforbiosensing,chem.soc.rev.2012,41,2122-2134)。

鉴于此，本发明提出了一种基于荧光量子点免疫层析试纸和图像分析技术的半定量检测户尘螨sige的方法及试剂盒，该方法具有方便、快捷、无需特殊检测仪器等特点，能够满足目前对户尘螨特异性ige检测的迫切需求，尤其适于大规模人群过敏原筛查和家庭检测等环境。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前的户尘螨sige检测方法耗时长、步骤复杂、需要特殊的仪器等问题，提供一种基于荧光量子点免疫层析试纸和图像分析技术的半定量检测户尘螨sige的方法及试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

表面带羧基的量子点纳米球分别与羊抗人sige、鼠抗兔igg共价偶联，制备得到检测荧光液；硝酸纤维素膜上分别固定尘螨抗原和兔igg为t线和c线，然后与样品垫、吸水垫和塑料背板组装得到试纸条。样本与荧光液混合反应后，加在样本垫上通过层析作用荧光液与t线和c线反应；当样本中有尘螨sige时，荧光量子点会被t线上的尘螨抗原特异性捕获，t线量子点的荧光强度与样本中尘螨sige浓度成正比。荧光试纸条在紫外灯照射下用数码相机拍照，图像用imagej软件进行rgb色彩通道分离后，进行灰度强度积分，从而实现对sige的半定量检测。开发的检测方法可以在0.2-10u/ml范围内半定量检测sige。

本发明的一种户尘螨特异性ige半定量检测试剂盒，包括检测荧光液以及用于户尘螨特异性ige半定量检测的免疫层析试纸条；

其中，所述的检测荧光液是通过将表面带羧基的量子点纳米球分别与羊抗人sige、鼠抗兔igg共价偶联，混合后制备得到检测荧光液；

其中，所述的免疫层析试纸条包括依次相连的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及用于提供组装平台的位于下方的塑料底衬，硝酸纤维素膜上具有由户尘螨过敏原蛋白包被的检测线以及兔igg包被的质控线，样品垫提供了待测样品加入的位置。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的检测荧光液按照以下方法制备得到：

(1)量子点与鼠抗兔igg抗体偶联，制备校准量子点荧光抗体标记物：

a、取100μl量子点纳米球，分散于200μl的磷酸缓冲液中，10000rpm离心10min，小心弃上清后，然后加入200μl的磷酸缓冲液，均匀分散，得到量子点纳米球溶液；

b、称量edc1.9mg，用1ml磷酸缓冲液溶解，混匀，即得到10mm的edc溶液；

c、取20μl的edc溶液，加入200μl的量子点纳米球溶液中，混匀，室温，翻转孵育0.5h，得到活化后的量子点纳米球；

d、活化后的量子点纳米球，10000rpm离心10min，弃上清，然后加入200μl的10mm，ph8.0的硼酸缓冲液，超声分散均匀；

e、取鼠抗兔igg抗体50μl，加入活化后的量子点纳米球溶液中，混匀，然后室温继续孵育1h；

f、取10w/w％的bsa溶液20μl，加入步骤e的纳米球溶液中，继续反应1h；

g、封闭后的量子点纳米球溶液，10000rpm离心10min，然后用pbst缓冲液离心洗涤三次，最后分散于100μl的含有1w/w％bsa的10mm，ph6.0的pbs缓冲液中，待用；

(2)量子点与羊抗人sige偶联，制备量子点-抗ige荧光抗体标记物；

a、取100μl量子点纳米球，分散于200μl的10mm，ph6.0的磷酸缓冲液中，10000rpm离心10min，小心弃上清后，然后加入200μl的磷酸缓冲液，均匀分散，得到量子点纳米球溶液；

b、称量edc1.9mg，用1ml磷酸缓冲液溶解，混匀，即得到10mm的edc溶液；

c、取20μl的edc溶液，加入200μl的量子点纳米球溶液中，混匀，室温，翻转孵育0.5h，得到活化后的量子点纳米球；

d、活化后的量子点纳米球，10000rpm离心10min，弃上清，然后加入200μl的10mm，ph8.0的硼酸缓冲液，超声分散均匀；

e、取羊抗人sige抗体50μl，加入活化后的量子点纳米球溶液中，混匀，然后室温继续孵育1h；

f、取10w/w％的bsa溶液5μl，加入步骤e的纳米球溶液中，继续反应1h；

g、封闭后的量子点纳米球溶液，10000rpm离心10min，然后用pbst缓冲液离心洗涤三次，最后分散于100μl的含有1w/w％bsa的10mm，ph6.0的pbs缓冲液中，待用；

(3)将步骤(2)以及步骤(3)得到的分别与鼠抗兔igg、羊抗人sige共价偶联的量子点纳米球溶液按照等体积混合均匀，即得。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的样品垫是采用样本垫处理液进行处理后得到，所述的处理液为含1.0w/w％bsa、0.25v/v％tween-20、1w/w％蔗糖和0.1w/w％nan3的0.01mph8.0的硼酸钠缓冲液。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述样品垫的处理方法是先将样品垫浸泡于样品垫处理液中20-60min，取出于30-45℃干燥箱中干燥9-15h，即得。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的试剂盒中还包括荧光稀释液、校准品以及校准品稀释液，所述的荧光稀释液为含有1w/w％bsa的10mm，ph6.0的pbs缓冲液，所述的校准品为人抗尘螨过敏蛋白特异性ige，所述的校准品稀释液为10mm，ph6.0的pbs缓冲液。

使用本发明所述的试剂盒用于人抗尘螨过敏蛋白特异性ige检测时，包括以下步骤：

a、取检测荧光液用荧光稀释液按照40-120倍体积稀释；

b、稀释后的荧光液用120μl每支进行分装后，密封2－8℃保存，校准品用校准品稀释液进行倍比稀释；

c、取稀释后的荧光液一支，然后加入10μl的校准品，轻轻振荡混匀；

d、取反应后的荧光液80μl，加到免疫层析试纸条的样品垫中，开始计时；

e、层析反应15min后，将免疫层析试纸置于暗室中，在紫外等照射下，拍照获取荧光图像；

f、采用倍比稀释的校准品，按照步骤b－e进行检测，建立校准曲线；

g、获取的荧光图像，采用软件imagej进行rgb彩色通道分离；

h、采用红色通道荧光图片，对层析试纸的检测区域，进行图像像素强度分析；

i、分别对层析试纸的检测区域和控制区域进行像素强度积分，计算t/c比，根据校准品的浓度和t/c值检测校准曲线和校准方程；

j、人血清样本采用b－i的步骤进行检测，获得t/c值，并用校准方程计算出血清中ige的浓度。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测人抗尘螨过敏蛋白特异性ige试剂中的用途。

与现有的技术相比较，本发明具有以下优点：

1、本发明采用荧光量子点免疫层析试纸和图像分析技术的检测户尘螨特异性ige，该方法具有操作简便，检测快速和无需特殊设备等优点。

2、本发明与传统的immunocap的sige检测方法比较，对56例阳性病人和40例健康对照组的血清的检测结果显示，其阳性符合率为92.9％(52/56)，阴性符合率为90.4％(38/42)。显示量子点免疫层析检测结果与临床症状具有很好的相关性，检测灵敏度高。

3、本发明建立户尘螨sige检测方法具有简便快速、使用方便等特点，尤其适于大规模人群过敏原筛查和家庭检测等环境。

附图说明

图1为量子点纳米球和抗体偶联物的表征。

(a)量子点纳米球的投射电镜照片；(b)高倍投射电镜照片下纳米球中的量子点；(c)量子点纳米球和抗体偶联物的粒径和粒径分布图；(d)和(e)分别量子点纳米球和抗体偶联物的紫外-可见吸收和荧光光谱图的比对；

图2为量子点纳米球免疫层析试纸的结构(a)和层析试纸检测尘螨特异性ige的阳性(b)和阴性(c)结果示意图；

图3为检测倍比稀释的尘螨特异性ige人血清(0，0.2，1.0，5.0，10，20u/ml)的rgb彩色荧光照片(a)和rgb通道分离后的蓝色(b)、绿色(c)和红色(d)通道照片。

图4为试纸条检测区域的像素强度分布图(a)和基线处理后的强度分布图(b)；对控制和检测区域的信号强度进行积分后计算的t/c比与ige浓度间的关系(c)；量子点免疫层析检测尘螨特异性ige的普通(d)和指数(e)校准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。

实施例中用到的试剂和仪器如下：量子点纳米球(qdns，610nm，粒径约100nm)，购自上海昆道生物公司，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(edc)，分子量191.7，购自sigma-aldrich公司，鼠抗兔igg购自武汉博士德公司，牛血清白蛋白(bsa)购自sigma-aldrich公司，羊抗人ige购自sigma-aldrich公司，硝酸纤维素膜(nc膜)购自millipore公司，玻璃纤维样品垫购自上海金标生物，吸水垫购自上海金标生物，粘性底衬(附有压力敏感胶的pvc板)购自上海金标生物，尘螨过敏原蛋白(1mg/ml)dermatophagoidespteronyssinusallergen1(nderp1)购自indoorbiotechnologies公司。样本垫处理液：

样本垫处理液a液：含1.0％bsa、0.25％tween-20和0.1％nan3的0.01mph8.0的硼酸钠缓冲液。

样本垫处理液b液：含1.0％bsa、0.25％tween-20、1％蔗糖和0.1％nan3的0.01mph8.0的硼酸钠缓冲液。

样本垫处理液c液：含1.0％bsa、0.25％tween-20、3％蔗糖和0.1％nan3的0.01mph8.0的硼酸钠缓冲液。

实施例1：校准量子点荧光抗体标记物的制备

a、取100μl量子点纳米球，分散于200μl的磷酸缓冲液(10mm，ph6.0)中，10000rpm离心10min，小心弃上清后，然后加入200μl的磷酸缓冲液(10mm，ph6.0)，均匀分散，得到量子点纳米球溶液；

b、称量edc1.9mg，用1ml磷酸缓冲液溶解，混匀，即得到10mm的edc溶液；

c、取20μl的edc溶液，加入200μl的量子点纳米球溶液中，混匀，室温，翻转孵育0.5h；

d、活化后的量子点纳米球，10000rpm离心10min，弃上清，然后加入200μl的硼酸缓冲液(10mm，ph8.0)，超声分散均匀；

e、取鼠抗兔igg50μl，加入活化后的量子点纳米球溶液中，混匀，然后室温继续孵育1h；

f、取10w/w％的bsa溶液20μl，加入上述纳米球溶液中，继续反应1h；

g、封闭后的量子点纳米球溶液，10000rpm离心10min，然后用pbst缓冲液离心洗涤三次，最后分散于100μl的1w/w％的bsa的pbs缓冲液(10mm，ph6.0)中，待用。

实施例2：量子点-抗ige荧光抗体标记物的制备

a、取100μl量子点纳米球，分散于200μl的磷酸缓冲液(10mm，ph6.0)中，10000rpm离心10min，小心弃上清后，然后加入200μl的磷酸缓冲液，均匀分散，得到量子点纳米球溶液；

b、称量edc1.9mg，用1ml磷酸缓冲液溶解，混匀，即得到10mm的edc溶液；

c、取20μl的edc溶液，加入200μl的量子点纳米球溶液中，混匀，室温，翻转孵育0.5h；

d、活化后的量子点纳米球，10000rpm离心10min，弃上清，然后加入200μl的硼酸缓冲液(10mm，ph8.0)，超声分散均匀；

e、取羊抗人ige50μl，加入活化后的量子点纳米球溶液中，混匀，然后室温继续孵育1h；

f、取10w/w％的bsa溶液5μl，分别加入上述纳米球溶液中，继续反应1h；

g、封闭后的量子点纳米球溶液，10000rpm离心10min，然后用pbst缓冲液离心洗涤三次，最后分散于100μl的含有1w/w％bsa的pbs缓冲液(10mm，ph6.0)中，待用。

图1a为量子点纳米球的投射电镜照片，图1b为高倍投射电镜照片下纳米球中的量子点；图1c为量子点纳米球和抗体偶联物的粒径和粒径分布图；图1d和图1e分别为量子点纳米球和抗体偶联物的紫外-可见吸收和荧光光谱图的比对。

实施例3：层析试纸条的组装

a、取100μl尘螨过敏原蛋白，用100μl的pbs缓冲液稀释；

b、采用bio-dotxyz3000全自动点膜仪将0.4-1.2mg/ml尘螨过敏原蛋白以及兔igg(1mg/ml)分别喷涂至nc膜上，作为试纸条检测线(t线)与质控线(c线)，37℃干燥过夜。

c、将样品垫、喷涂有检测线(t线)与质控线(c线)的nc膜、吸水垫，依次相连组装到用于提供组装平台的塑料底衬上方，组装示意图如图1所示。

d、分别用a、b、c三种样本垫处理液处理样本垫，处理方法是先将样品垫浸泡于样品垫处理液中40min，取出于37℃干燥箱中干燥12h，封存备用。

e、不同样本垫处理液处理的试纸条加样孔中加入等量体外孵育物，根据试纸条t、c线荧光强度变化以及量子点荧光微球的释放情况，每个条件下平行检测5次。

结果：从试纸条t、c线荧光强度变化以及量子点荧光微球的释放情况来看，样本垫处理液b液的处理效果要好于样本垫处理液a液以及样本垫处理液c液。

实施例4试剂盒的组装

一种户尘螨特异性ige半定量检测试剂盒包括以下试剂：

1、检测荧光液：由实施例2制备得到的量子点-抗ige荧光抗体标记物和实施例1制备得到的校准量子点荧光抗体标记物按照等体积混合得到；

2、户尘螨特异性ige半定量检测试纸条：实施例3制备；

3、荧光稀释液：含有1w/w％bsa的pbs缓冲液(10mm，ph6.0)；

4、校准品：人抗尘螨过敏蛋白特异性ige；

5、校准品稀释液：pbs缓冲液(10mm，ph6.0)。

实施例5：户尘螨特异性ige半定量检测试剂盒在检测血清中尘螨特异性ige中的应用

1、样本

过敏性哮喘患者血清20份。

2、试剂盒

实施例4制备，其中校准品为采用pbs缓冲液(10mm，ph6.0)倍比稀释的尘螨特异性ige人血清(0，0.2，1.0，5.0，10，20u/ml)。

3、方法

a、取200μl的检测荧光液，用荧光稀释液按照40倍体积稀释；

b、稀释后的荧光液用120μl每支进行分装后，密封2－8℃保存；

c、取稀释后的荧光液一支，然后加入10μl的样本或者校准品，轻轻振荡混匀；

d、取反应后的荧光液80μl，加到免疫层析试纸(实施例3制备)上样孔中，开始计时；

e、层析反应15min后，将免疫层析试纸置于暗室中，在紫外等照射下，拍照获取荧光图像；

f、采用倍比稀释的校准品，按照步骤b－e进行检测，建立校准曲线；

g、获取的荧光图像，采用软件imagej进行rgb彩色通道分离；

h、采用红色通道荧光图片，对层析试纸的检测区域，进行图像像素强度分析；

i、分别对层析试纸的检测区域和控制区域进行像素强度积分，计算t/c比，根据校准品的浓度和t/c值检测校准曲线和校准方程；

j、收集的人血清采用b－i的步骤进行检测，获得t/c值，并用校准方程计算出血清中ige的浓度。

结果：

层析试纸检测尘螨特异性ige的阳性(b)和阴性(c)结果示意图如图2所示。图3为检测倍比稀释的尘螨特异性ige人血清(0，0.2，1.0，5.0，10，20u/ml)的rgb彩色荧光照片(a)和rgb通道分离后的蓝色(b)、绿色(c)和红色(d)通道照片。图4a为试纸条检测区域的像素强度分布图，图4b为基线处理后的强度分布图；图4c对控制和检测区域的信号强度进行积分后计算的t/c比与ige浓度间的关系；图4d量子点免疫层析检测尘螨特异性ige的普通校准曲线；图4e为量子点免疫层析检测尘螨特异性ige指数校准曲线。

利用校准方程计算出过敏性哮喘患者血清中ige的浓度，结果发现20份血清中，介于0.35u/ml-3.0u/ml的血清有8份，介于3u/ml-5.0u/ml的血清有5份，介于5u/ml-10u/ml的血清有2份，0.2u/ml-0.35u/ml的血清有5份。开发的检测方法可以在0.2-10u/ml范围内半定量检测sige。

实施例6符合度试验

为了说明本发明试剂盒检测的准确性，本发明采用本发明的试剂盒以及传统的immunocap的sige检测方法进行了比较，对56例阳性病人和40例健康对照组的血清按照实施例5的方法进行了检测，检测结果显示，其阳性符合率为92.9％(52/56)，阴性符合率为90.4％(38/42)。显示本发明的检测试剂盒结果与临床症状具有很好的相关性，检测灵敏度高。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。