本发明涉及体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种脂蛋白(a)的检测试剂及方法。
背景技术：
脂蛋白(a)是一种特殊的血浆脂蛋白。在1975年dalhen等研究认为lpa是动脉粥样硬化的危险因子。1978年，mclean等研究脂蛋白(a)中的apo(a)与纤溶酶原(plg)具有高度同源性，从而认为脂蛋白(a)不仅是动脉粥样硬化的危险因素，而且可能与纤溶系统有关。脂蛋白(a)在预测动脉粥样硬化性心血管疾病的发生、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的再发、静脉血栓事件的发生以及肾脏移植预后等方面均有重要的临床价值。
早期检测脂蛋白(a)所用的电泳法灵敏度低，多用于定性检测。随后研发出了多种能直接测定脂蛋白(a)的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(rid)、电免疫扩散法(eid)、放射免疫测定法(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫浊度法[包括免疫散射比浊法(ina)和免疫透射比浊法(ita)]、解离增强配体荧光免疫测定法(delfia)等。rid法与eid法因操纵简便，不需特殊设备，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。ria法的缺点是操纵复杂，有放射性核素污染。delfia法因需特殊仪器，国内也较少应用。其中免疫比浊法，快速简便、精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测，便于推广，适合临床检测。但需要的抗体用量大，对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力)，颗粒大小不同的lp(a)会产生不一致的光散射与光吸收，而且受标本中的基质的影响较明显，容易受到类风湿因子的干扰，所以研发一种成本低、特异性好、偏差小的检测方法是目前的市场需求。
公开号为cn103604930a中公开了一种脂蛋白(a)的检测试剂盒，组成包括：tris-hcl缓冲液，脂蛋白(a)100mg/dl，氯化钠150mm，蔗糖5.0％，bsa1.0％，edta10mm，叠氮化钠0.1％。但该试剂盒在抗干扰能力和精密度方面还存在一定的欠缺。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种脂蛋白(a)的检测试剂及方法。该检测试剂及方法抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脂蛋白(a)的检测试剂，该检测试剂由试剂1和试剂2组成；
其中，试剂1包括mops缓冲液、tween80、防腐剂和水；
试剂2包括包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球、甘氨酸缓冲液、tween80、防腐剂、甘油和水。
作为优选，试剂1中各组分的用量为：
mops缓冲液：50～200mmol/l；
tween80：0.5～5vt％；
防腐剂：0.05～0.2wt％；
优选地，试剂1中各组分的用量为：
mops缓冲液：50～100mmol/l；
tween80：1～3vt％；
防腐剂：0.05wt％。
优选地，试剂1中tween80的浓度为1～2vt％。
在本发明提供的实施例中，试剂1中各组分的用量为：
mops缓冲液：100mmol/l；
tween80：1.5vt％；
防腐剂：0.05wt％。
作为优选，试剂1的ph值为6～8。
优选地，试剂1的ph值为6.5～7.5。
在本发明提供的实施例中，试剂1的ph值为7.0。
作为优选，试剂2中各组分的用量为：
包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球：0.001～0.02g/l；
甘氨酸缓冲液：10～100mmol/l；
tween80：0.5～5vt％；
防腐剂：0.05～0.2wt％；
甘油：2～10vt％；
优选地，试剂2中各组分的用量为：
包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球：0.001～0.01g/l；
甘氨酸缓冲液：10～50mmol/l；
tween80：1～5vt％；
防腐剂：0.1wt％；
甘油：2～10vt％。
优选地，试剂2中tween80的浓度为2～5vt％。
在本发明提供的实施例中，试剂2中各组分的用量为：
包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球：0.001g/l；
甘氨酸缓冲液：50mmol/l；
tween80：2vt％；
防腐剂：0.1wt％；
甘油：3vt％。
作为优选，试剂2的ph值为7～9。
优选地，试剂2的ph值为7～8。
在本发明提供的实施例中，试剂2的ph值为7.5。
在本发明中，适宜ph的选择提高了试剂的贮存稳定性。
作为优选，防腐剂为叠氮钠。
在本发明提供的实施例中，包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球是由脂蛋白(a)单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。
在本发明提供的实施例中，试剂2中包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球的制备方法为：将脂蛋白(a)单克隆抗体与经过mes活化的胶乳微球混合，30℃交联得到。
作为优选，脂蛋白(a)单克隆抗体为鼠抗人载脂蛋白(a)单克隆抗体。
作为优选，胶乳微球为疏水微球。胶乳微球的选择提高了化学交联的效率，减少了抗体的损失，降低了成本，提高了灵敏度和精密度。
作为优选，疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。
优选地，疏水微球为带磺酸基基团和/或羧基基团的胶乳微球。
作为优选，胶乳微球的平均粒径为100～300nm。
优选地，胶乳微球的平均粒径为200～300nm。
作为优选，脂蛋白(a)单克隆抗体与胶乳微球的质量比为(0.5～1)：100。
优选地，脂蛋白(a)单克隆抗体与胶乳微球的质量比为0.8：100。
本发明还提供了一种脂蛋白(a)含量的检测方法，包括：待测样本加入试剂1中，孵育5～10min后再加入试剂2形成凝集，在660nm波长下测定吸光度，通过脂蛋白(a)的标准曲线得到待测样本中脂蛋白(a)的含量；
其中，试剂1包括mops缓冲液、tween80、防腐剂和水；
试剂2包括包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球、甘氨酸缓冲液、tween80、防腐剂、甘油和水。
作为优选，孵育的温度为37℃。
作为优选，在检测过程中试剂1与试剂2的体积比为3:1。
本发明提供了一种脂蛋白(a)的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成；其中，试剂1包括mops缓冲液、tween80、防腐剂和水；试剂2包括包被有脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳微球、甘氨酸缓冲液、tween80、防腐剂、甘油和水。本发明至少具有如下优势之一：
(1)本发明检测脂蛋白(a)的试剂及方法检测结果准确性高、灵敏度好、精密度好、线性范围宽，且稳定性好，保存期长，便于推广使用，成本低，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清中脂蛋白(a)的含量。
(2)本发明检测试剂抗干扰能力强、特异性高。表面活性剂的选择，可以减少样本的浊度对实验结果的影响；抗体的选择特异性更好，可以减少非特异性干扰和类风湿因子的干扰。
(3)试剂制备过程中简化了处理胶乳微球和标记抗体的时间，简化了工艺流程，使操作更简便。
具体实施方式
本发明公开了一种脂蛋白(a)的检测试剂及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的脂蛋白(a)的检测试剂及方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
以下实施例中市售国产脂蛋白(a)试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的配方如下：
试剂1：40mmol/l含1.0％nan3的甘氨酸缓冲液；
试剂2：抗人脂蛋白(a)-igg的致敏乳胶颗粒悬液。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明检测脂蛋白(a)的试剂及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒的制备：
用等量的mes溶液活化0.01％羧基基团胶乳微球，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，与经过活化的胶乳微球混合，30℃交联得到。
本实施例试剂包括：
试剂1：100mmol/lmops缓冲液，tween801.2％，防腐剂叠氮钠0.05％，ph7.0；
试剂2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒0.001g/l，粒径为200～300nm，50mol/l甘氨酸缓冲液，0.1％叠氮钠，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
检测方法：待测样本血清加入试剂1中，孵育5min中再加入试剂2形成凝集，试剂1与试剂2的体积比为3:1，在660nm波长下测定吸光度，通过脂蛋白(a)的标准曲线计算样品中脂蛋白(a)的含量。
实施例2：本发明检测脂蛋白(a)的试剂及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒的制备：
用等量的mes溶液活化0.01％磺酸基基团胶乳微球，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，与经过活化的胶乳微球混合，30℃交联得到。
本实施例试剂包括：
试剂1：100mmol/lmops缓冲液，tween801.2％，防腐剂叠氮钠0.05％，参考ph7.0；
试剂2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒0.001g/l，粒径为200～300nm，50mol/l甘氨酸缓冲液，0.1％叠氮钠，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
检测方法：待测样本血清加入试剂1中，孵育5min中再加入试剂2形成凝集，试剂1与试剂2的体积比为3:1，在660nm波长下测定吸光度，通过脂蛋白(a)的标准曲线计算样品中脂蛋白(a)的含量。
实施例3：本发明检测脂蛋白(a)的试剂及方法
包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒的制备：
用等量的mes溶液活化0.01％羧基和磺酸基基团胶乳微球，，然后把5mg/ml鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，与经过活化的胶乳微球混合，30℃交联得到。
本实施例试剂包括：
试剂1：100mmol/lmops缓冲液，tween801.2％，防腐剂叠氮钠0.05％，参考ph7.0；
试剂2：包被有鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体的胶乳颗粒0.001g/l，粒径为200～300nm，50mol/l甘氨酸缓冲液，0.1％叠氮钠，2％tween80，3％甘油，ph值7.5。
检测方法：待测样本血清加入试剂1中，孵育5min中再加入试剂2形成凝集，试剂1与试剂2的体积比为3:1，在660nm波长下测定吸光度，通过脂蛋白(a)的标准曲线计算样品中脂蛋白(a)的含量。
实施例4：本发明检测方法的准确度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：20名体检者血清样本；
对比试剂1：市售国产脂蛋白(a)试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)。
用实施例1至实施例3的检测试剂和对比试剂分别测定20例样品，检测结果见表1-1～1-3。
表1-1实施例1试剂的准确度分析结果
表1-2实施例2试剂的准确度分析结果
表1-3实施例3试剂的准确度分析结果
结果显示，根据检测结果计算出的实施例1试剂检测方法的r2值为0.995，实施例2、3检测方法的r2值同样大于0.95，表明本发明方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
实施例5：本发明检测方法的精密度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：低值、中值、高值血清样品各一份；中值血清样本一份；
采用实施例1至实施例3的试剂及检测方法对同一待测样品重复检测10次，其检测结果见表2。
表2检测样品脂蛋白(a)浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，实例1、2、3低值，中值，高值样本标准差率分别为2.72％、2.07％、2.27％；1.45％、1.07％、1.12％；1.19％、0.99％、1.12％，均小于3％，且小于对比试剂的标准差率，表明本发明方法具有高精密度。
实施例6：本发明方法的抗干扰性能分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：任意一血清样品：
在同一份血清样本中加入不同浓度的类风湿因子(50，150，250，500、800iu/ml)，采用实施例1至实施例3的检测方法对同一待测样品重复检测3次，与未加入类风湿因子的血清做对比，计算偏差，其检测结果见表3。在本实施例中，选取市售国产脂蛋白(a)试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作为对比试剂，进行了比较。
表3检测样品脂蛋白(a)浓度的平均值和偏差绝对值
结果显示，本发明的试剂类风湿因子≤800iu/ml对测值没有影响，而对比试剂盒1仅在类风湿因子<300iu/ml对测值没有影响。
以上实例中市售国产脂蛋白(a)试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的配方如下：
试剂1：40mmol/l含1.0％nan3的甘氨酸缓冲液
试剂2：抗人脂蛋白(a)-igg的致敏乳胶颗粒悬液
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。