一种蓝色乳胶微球标记抗体的制备方法及其试纸条与流程

本发明属于兽药残留快速检测领域，尤其是涉及一种蓝色乳胶微球标记抗体的制备方法及其制备的试纸条。

背景技术：

免疫层析分析方法具有灵敏度高、操作简便、省时省力、成本低廉，适用于大量样本的快速现场筛选等优势，近年来在兽药残留检测领域得到了快速的发展。胶体金具有生物兼容性好，不同粒径可呈现不同的颜色，易于通过改性提高信号强度等优势，成为免疫层析分析方法中最常用的标记材料。但是胶体金价格昂贵，批间差异大，不利于实现试纸条的批量生产。胶体金免疫层析技术对抗体、包被原等材料的要求比较高，而且胶体金的信号较弱，限制了其应用。

乳胶微球又名聚苯乙烯微球，外观为蓝色液体状，其基本粒子尺寸在100-1000nm之间，表面功能化聚合物微球由于表面羧基、氨基或者羟基等活性基团的存在而易于与酶、蛋白质、核酸等结合反应，使之在生物、化学、材料、医学等方面应用广泛。当前，应用粒径可控、单分散性功能化聚合物微球已成为高分子材料领域的一个研究热点。单分散纳米级聚苯乙烯微球具有形貌规则、粒径均一、良好的表面反应能力和易于功能化等优点，在免疫技术和疾病早期诊断等领域具有很高的研究和应用价值。

彩色乳胶微球具有分散性好、粒径分布窄、色彩鲜艳等特性，在免疫层析试纸技术中得到了有效的应用，蒋韬等建立口蹄疫o、asia1分型彩色胶乳试纸条诊断方法，此免疫层析试纸条有很好的灵敏度，可检测到病毒含量为3.9×104ld50，特异性好，无交叉反应。荧光乳胶微球需要紫外激发，崔浩等基于免疫竞争层析法原理，建立了莱克多巴胺的荧光胶乳颗粒免疫层析快速检测技术，用于猪肉组织中莱克多巴胺残留的检测，最低检测限为0.5μg/ml，与其他结构类似物无交叉操作简便、稳定可靠、灵敏度高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种蓝色乳胶微球标记抗体的制备方法及免疫层析分析方法，可以可视化快速检测诺氟沙星残留，以解决胶体金标记免疫层析分析方法成本较高，批间差异大，信号强度较弱，颜色单一等问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

1)用mes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液)洗涤50mg﹒ml^-1的蓝色乳胶微球，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min；将沉淀用mes缓冲液稀释至1～5mg﹒ml^-1，4℃保存备用；优选的，稀释至1mg﹒ml^-1；

2)取200μl的1mg﹒ml^-1的蓝色乳胶微球，加入0.5～1mg﹒ml^-1的edc与nhs，在摇床反应15min；优选的，0.5mg﹒ml^-1edc与nhs；

3)用磷酸盐缓冲液洗涤已活化乳胶微球，重复2～5次，于10000～14000r/min，4℃，离心15～20min，将沉淀用磷酸盐缓冲液稀释至1mg﹒ml^-1，0～25℃保存备用；优选的，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min，将沉淀用磷酸盐缓冲液稀释至1mg﹒ml^-1，4℃保存备用；

4)在搅拌速度50～150rpm条件下将诺氟沙星抗体加入到上述蓝色乳胶微球溶液中，在0～25℃下，于摇床反应1～2h，得蓝色乳胶微球标记抗体；优选的，在25℃下，于摇床反应1h；

5)加入1～5μl的20％bsa封闭15min；优选的，4μl的20％bsa；

6)于14000r/min，4℃，离心15min；将最终沉淀用工作液重悬至最初体积，4℃保存备用。

优选的步骤1)中，所述缓冲液均为mes缓冲液，且其ph为5。

优选的步骤3)中，所述缓冲液均为磷酸盐缓冲液，且其ph为7.4；

优选的步骤4)中，诺氟沙星抗体的浓度为50～100μg﹒ml^-1；乳胶微球的浓度为1～3mg﹒ml^-1。

优选的步骤4)中，诺氟沙星抗体的浓度为75μg﹒ml^-1；蓝色乳胶微球的浓度为1mg﹒ml^-1。

优选的步骤6)中，工作液为100ml的水中加入1.21gtris，5g蔗糖，0.5gbsa，0.5gpvp，0.5gf68，0.5mlpeg200，0.5mltritonx-100，1ml的吐温20。

本发明还提供了一种使用如上所述的制备方法制备的蓝色乳胶微球标记抗体的试纸条，包括如下组装步骤，

1)取一定量的稀释的蓝色乳胶微球标记抗体溶液，加入微孔板的微孔中；

2)向微孔中加入100-200μl标准品，快速混合均匀，置于室温孵育1-5min，将半组装的试纸条插入到微孔中，5-15min即可观察试纸条检测结果；优选的，向微孔中加入100μl标准品，快速混合均匀，置于室温孵育3min，将组半组装的试纸条插入到微孔中，10min后读取结果；优选的，标准品是由ph值为7.4，离子强度为0.1moll^-1的0.05％tween-20/pbs溶液稀释。

优选的，步骤1)中，取2μl蓝色乳胶微球标记抗体溶液

优选的，步骤2)中，whatman公司的hf90型号；且半组装的试纸条上固定有包被抗原、二抗，所述二抗包被在硝酸纤维素膜质控线上；所述包被抗原在检测线上。

优选的所述硝酸纤维素膜上包被抗原的稀释倍数为40倍，其使用的稀释液为磷酸盐缓冲液，且其ph值为7.4。

优选的硝酸纤维素膜上二抗的稀释倍数为60倍，其使用的稀释液为磷酸盐缓冲液，且其ph值为7.4。

本发明同时提供了如上所述的制备方法制备的蓝色乳胶微球标记抗体在诺氟沙星检测中的应用以及如上所述的试纸条在诺氟沙星检测中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的蓝色乳胶微球标记抗体的制备方法及其试纸条，具有以下优势：

(1)本发明所述的蓝色乳胶微球标记抗体的制备中，使用的标记材料蓝色乳胶微球，成本远低于氯金酸，降低了现有的农药检测的成本。

(2)本发明所述的试纸条，抗体用量少，同样节约了成本。

(3)本发明使用的乳胶微球具有分散性好、粒径分布窄、色彩鲜艳等特点。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明中蓝色乳胶微球标记抗体最适抗体量(50μg﹒ml^-1)优化结果；其中三组试纸条对应的诺氟沙星的浓度从左到右依次为0μg﹒l^-1、1μg﹒l^-1、2μg﹒l^-1；

图2是本发明中蓝色乳胶微球标记抗体最适抗体量(75μg﹒ml^-1)优化结果；其中三组试纸条对应的诺氟沙星的浓度从左到右依次为0μg﹒l^-1、1μg﹒l^-1、2μg﹒l^-1；

图3是本发明中蓝色乳胶微球标记抗体最适抗体量(100μg﹒ml^-1)优化结果；其中三组试纸条对应的诺氟沙星的浓度从左到右依次为0μg﹒l^-1、1μg﹒l^-1、2μg﹒l^-1；

图4是本发明中实施例一中试纸条的跑条结果；其中对应的诺氟沙星的浓度从左到右依次为0μg﹒l^-1、0.5μg﹒l^-1、1μg﹒l^-1、2μg﹒l^-1。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

一种乳胶微球标记抗体的制备方法

1)用mes缓冲液洗涤50mg﹒ml^-1的蓝色乳胶微球，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min；将沉淀用mes缓冲液稀释至1mg﹒ml^-1，4℃保存备用；

2)取200μl的1mg﹒ml^-1的蓝色乳胶微球，加入0.5mg﹒ml^-1的edc与nhs，在摇床反应15min；

3)用磷酸盐缓冲液洗涤已活化乳胶微球，重复2次，于14000r/min，4℃，离心15min，将沉淀用磷酸盐缓冲液稀释至1mg﹒ml^-1，4℃保存备用；

4)在搅拌速度50～150rpm条件下将15μl的1mg﹒ml^-1诺氟沙星抗体加入到上述蓝色乳胶微球溶液中，在25℃下，于摇床反应1h，得蓝色乳胶微球标记抗体；

5)加入4μl的20％bsa封闭15min；

6)于14000r/min，4℃，离心15min；将最终沉淀用工作液重悬至40μl，4℃保存备用。

其中步骤1)中，所述缓冲液均为mes缓冲液，且其ph为5；步骤3)中，所述缓冲液均为磷酸盐缓冲液，且其ph为7.4；步骤4)中，诺氟沙星抗体的浓度为75μg﹒ml^-1；乳胶微球的浓度为1mg﹒ml^-1。

一种使用如上所述的制备方法制备的乳胶微球标记抗体的制备的试纸条，包括如下组装步骤，

1)取一定量的稀释的蓝色乳胶微球标记抗体溶液，加入微孔板的微孔中；

2)向微孔中加入100μl标准品，快速混合均匀，置于室温孵育3min，将半组装的试纸条插入到微孔中，15min即可观察试纸条检测结果；

标准品是由ph值为7.4，离子强度为0.1mol﹒l^-1的磷酸盐缓冲液配制而成，且其中含有质量浓度为0.05％吐温-20。

其中，步骤2)中，所述半组装的试纸条的材质为硝酸纤维素膜，优选的，whatman公司的hf90型号；且半组装的试纸条上固定有包被抗原、二抗，所述二抗包被在硝酸纤维素膜质控线上；所述包被抗原在检测线上。

所述硝酸纤维素膜上包被抗原的稀释倍数为40倍，其使用的稀释液为磷酸盐缓冲液，且其ph值为7.4。

所述硝酸纤维素膜上二抗的稀释倍数为60倍，其使用的稀释液为磷酸盐缓冲液。

实验效果验证结果：

1、牛奶样品：取1ml牛奶样品，用pbst稀释5倍。经过反复的验证，本实施例制备的乳胶微球标记免疫层析试纸条在实际样品中的检出限为10μg﹒kg^-1；试纸条的直接目视检出限为2μg﹒l^-1。

2、蓝色乳胶微球标记免疫层析试纸条稳定性实验，组装试纸条，分别在四周、八周、十二周和十六周取出，取不同浓度的诺氟沙星标准品溶液进行跑条，观察试纸条显色情况和灵敏度。结果验证，试纸条在室温下至少可以稳定保存十六周。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。