一种小麦根尖染色体制片的方法与流程

本发明属于植物细胞遗传学领域，涉及一种小麦根尖染色体制片的方法。

背景技术：

国内外育种实践证明，遗传基础狭窄已成为小麦育种难以取得突破的“瓶颈”。为保障小麦安全生产，保障农业生态和环境安全，迫切需要开发和利用新的基因资源、培育综合抗性好、适应性强的小麦新品种。小麦野生近缘植物长期生活在自然环境中，经受了各种恶劣环境的考验，具有大量普通小麦不具备或在人工选择条件下已经丧失的优异基因，如抗病、抗逆、抗虫、大穗多粒、优质等。通过远缘杂交方式将小麦近缘物种中的优良基因导入普通小麦创制的新种质，既可以丰富小麦遗传变异，拓宽小麦的种质资源，而且不涉及转基因安全性问题，是推进小麦育种取得突破性进展的有效途径(friebe等，1996)。在小麦的起源进化研究、外源染色质的鉴定、基因的染色体定位、物理图谱构建、减数分裂机理等研究中，都涉及到染色体的相关研究。

小麦染色体制片的准备，是开展小麦细胞遗传学、小麦分子细胞遗传学以及基于染色体等相关研究的基础。在小麦染色体制片的准备过程中，预处理是一个非常重要的环节，合理的预处理能得到大量的分裂相和形态好的中期染色体。预处理的机理是抑制微管蛋白组装成纺锤丝，但并不抑制前期的细胞分裂，因此，凡进入中期的细胞均被阻断而不能进入后期，积累大量中期分裂相；可诱导染色体进一步缩短变直，便于染色体分散和使染色体形态更清晰。实际操作中常用的方法有物理方法和化学方法。物理方法是用低温对植物材料进行预处理，处理温度一般在0～8℃，或用冰水混合物直接对材料进行预处理。此法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀.简便易行，各种作物都适用，但是并不是任何时候都能获得较多的中期相。化学方法预处理常用的试剂有：秋水仙素、对二氯苯和8-羟基喹啉。秋水仙素常用浓度0.05-0.2％的水溶液，适用于大、中、小染色体，尤其是适合染色体计数，使染色体易于分散较好，但显示缢痕较差，而且秋水仙素毒性较强。对二氯苯预处理的效果与秋水仙素相当，也具有较强的毒性；8-羟基喹啉，适宜中、小染色体，离体处理好。优点在于显示缢痕清晰，缺点在于中期相不如其它多。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦根尖染色体制片的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种小麦根尖染色体制片的方法，包含以下步骤：

1)种子发根；

2)预处理：待根长为1.8-3cm时，向培养皿中加入20μmol/lapm溶液至浸没根，置于25℃培养箱生长预处理2小时；

3)笑气处理：将预处理的根尖,在装有蒸馏水的培养皿中清洗，用剪刀剪根，在室温条件下，用压强为1mpa的笑气处理1-2小时；

4)固定：向用笑气处理完之后的根加入4℃预冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解离片刻，先切掉根冠，然后切取根尖生长点置于载玻片上，滴一滴45％醋酸解离细胞，盖上盖玻片后轻轻敲击使细胞分散，在酒精灯外焰轻微烘一下后直接压片。

作为本发明小麦根尖染色体制片方法的优选，步骤1)种子发根的方法为：将种子放置于垫有湿润滤纸的培养皿中于25℃恒温箱中发芽，种子露白后，将培养皿中多余的水分倒掉，仅保持滤纸湿润，移至4℃冰箱中处理20-24h，然后再将培养皿移至25℃培养箱中避光生长至1.8-3.0cm。

作为本发明小麦根尖染色体制片方法的优选，步骤2)中20μmol/lapm溶液的配制方法为：向1000ml蒸馏水中加入100μl的0.2mol/lapm母液，配成20μmol/l的工作液；所述的0.2mol/lapm母液的配制方法为：60.86mgapm溶于10ml预冷的丙酮中,放入-20℃保存。

作为本发明小麦根尖染色体制片方法的优选，步骤3)所述的笑气处理的方法为：将预处理的根尖,在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次4-5分钟，用剪刀剪根，将根放入带孔的eppendorf离心管中，离心管中预先加入适量的去离子水以保持湿润，在室温条件下，用压强为1mpa的笑气处理1-2小时。

作为本发明小麦根尖染色体制片方法的优选，步骤4)所述的固定的方法为：把用笑气处理完之后的盛有根的eppendorf离心管置于碎冰上，向离心管中加入4℃预冷的90％的冰醋酸，固定5-10min。

本发明小麦根尖染色体制片的方法进一步优选包含如下步骤：

1)种子发根：将种子放置于垫有湿润滤纸的培养皿中于25℃恒温箱中发芽，种子露白后，将培养皿中多余的水分倒掉，仅保持滤纸湿润，移至4℃冰箱中处理24h，然后再将培养皿移至25℃培养箱中避光生长；

2)预处理：待根长1.8-3cm时，向培养皿中加入20μmol/lapm溶液至浸没根，置于25℃培养箱生长预处理2小时；

3)笑气处理：将预处理的根尖,在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，用剪刀剪根，将根放入带孔的eppendorf离心管中，离心管中预先加入适量的去离子水以保持湿润，在室温条件下，用压强为1mpa的笑气处理1-2小时；

4)固定：把用笑气处理完之后的盛有根的eppendorf离心管置于碎冰上，向离心管中加入4℃预冷的90％的冰醋酸，固定5-10min；

5)制片：先取出根尖，在45％醋酸中解离片刻，用刀片先切掉根冠，然后切取根尖生长点置于载玻片上，滴一滴45％醋酸解离细胞，盖上盖玻片后轻轻敲击使细胞分散，在酒精灯外焰轻微烘一下后直接压片。

将按照上述方法制得的载玻片置于相差显微镜下观察，选择染色体形态良好、不重叠或重叠少、清晰的细胞，可以直接照相进行核型分析，也可以用于染色体分带或荧光原位杂交实验。

本发明在预处理阶段使用甲基胺草膦(amiprophos-methyl,apm)apm代替秋水仙素、对二氯苯和8-羟基喹啉，apm是一种直接干扰植物微管合成的特异性药物，其作用类似于秋水仙素，起到收集中期染色体的作用，不同apm处理时间对有丝分裂中期指数有一定的影响。apm对微管蛋白有很高的亲和力，在较低浓度时，对微管蛋白的解聚能力更强，对植物的毒害作用也小。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在操作简单，不需要特殊设备；方便易学，没有经过细胞学训练的人员，根据本发明方法，都可以获得大量的有丝分裂中期相，也可以制备出良好的小麦染色体制片。

附图说明

图1：六倍体普通小麦中国春染色体制片dapi染色后放大100倍(显微镜：目镜10倍×物镜10倍),a、b为不同视野下看到的中期相的分布情况；

图2：六倍体普通小麦中国春染色体制片dapi染色后放大1000倍(显微镜：目镜10倍×物镜100倍)，为一个细胞在荧光显微镜下的镜检图片(2n＝42)

图3：四倍体硬粒小麦染色体制片dapi染色后放大100倍(显微镜：目镜10倍×物镜10倍),a、b为不同视野下看到的中期相的分布情况；

图4：四倍体硬粒小麦染色体制片dapi染色后放大1000倍(显微镜：目镜10倍×物镜100倍)，为一个细胞在荧光显微镜下的镜检图片(2n＝28)；

图5：二倍体簇毛麦染色体制片dapi染色后放大100倍(显微镜：目镜10倍×物镜10倍),a、b为不同视野下看到的中期相的分布情况；

图6：二倍体簇毛麦染色体制片dapi染色后放大1000倍(显微镜：目镜10倍×物镜100倍)，为一个细胞在荧光显微镜下的镜检图片(2n＝14)

具体实施方式

实施例1：普通小麦中国春(2n＝42，aabbdd)的染色体制片举例：

种子发根:将15粒普通小麦中国春种子放在垫有湿润滤纸的培养皿中,加入足量的蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，放入25℃恒温箱中发芽。放置24小时种子露白后，将培养皿中多余的水分倒掉，仅保持滤纸湿润，移至4℃冰箱中处理24h，然后再将培养皿移至25℃培养箱中避光生长。

预处理:待小麦种子的根长约2cm时，向培养皿中加入20μmol/lapm溶液至浸没根，置于25℃培养箱生长预处理2小时。

笑气处理：将预处理的根尖，在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，用剪刀剪取幼根(如果实验过程中需要获得正常的植株，需要保留一条完整的根)。将根放入带孔的eppendorf2.0ml离心管中，离心管中预先加入适量的去离子水以保持湿润。在室温条件下，用压强为1mpa的笑气处理1.5小时。

固定：把用笑气处理完之后的盛有根的eppendorf离心管置于碎冰上，向离心管中加入预冷的90％的冰醋酸(4℃)，固定5-10min。

制片：先取出根尖，用刀片切取根尖部分，在45％醋酸中解离片刻，用刀片先切掉根冠，然后切取根尖生长点2mm(实际操作中，可根据需要切取1.5-2.5mm根尖部分)置于载玻片上，滴一滴45％醋酸解离细胞，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫在刀片的边缘后，用解剖针轻轻敲击盖玻片使根尖细胞分散，使细胞分散，在酒精灯外焰轻微烘一下，将载玻片放在两层滤纸之间，用大拇指按在盖玻片的位置用力压片后直接压片。

镜检：将载玻片置于荧光显微镜20倍物镜下观察，从图1中可以看出通过apm预处理后的材料，有丝分裂中期相的数量明显的提高了。dapi染色后，在荧光显微镜100倍油镜下照相，染色结果如图2，图中比例尺为即所示，由图可见，该小麦根尖细胞染色体数目为42，中期分裂相多，染色体分散良好、重叠少。

实施例2：四倍体硬粒小麦(2n＝28，aabb)的染色体制片举例：

四倍体硬粒小麦在种子发根，预处理，笑气处理，制片方面同六倍体普通小麦，详见实施见例1。

镜检：将载玻片置于荧光显微镜20倍物镜下观察，从图3中可以看出通过apm预处理后的材料，有丝分裂中期相的数量明显的提高了。dapi染色后，在荧光显微镜100倍油镜下照相，染色结果如图4，图中比例尺为即所示，由图可见，该硬粒小麦根尖细胞染色体数目为28，中期分裂相多，染色体分散良好、重叠少。

实施例3：二倍体簇毛麦(2n＝14，vv)的染色体制片举例：

种子发根:将20粒簇毛麦种子放在垫有湿润滤纸的培养皿中,加入足量的蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，放入25℃恒温箱中发芽。放置24小时种子露白后，将培养皿中多余的水分倒掉，仅保持滤纸湿润，移至4℃冰箱中处理24h，然后再将培养皿移至25℃培养箱中避光生长。

预处理:待簇毛麦种子的根长约2cm-3cm时，向培养皿中加入20μmol/lapm溶液至浸没根，置于25℃培养箱生长预处理2小时。

笑气处理：将预处理的根尖，在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，用剪刀剪取幼根(如果实验过程中需要获得正常的植株，需要保留一条完整的根)。将根放入带孔的eppendorf2.0ml离心管中，离心管中预先加入适量的去离子水以保持湿润。在室温条件下，用压强为1mpa的笑气处理1小时。

固定：把用笑气处理完之后的盛有根的eppendorf离心管置于碎冰上，向离心管中加入预冷的90％的冰醋酸(4℃)，固定5-10min。

制片：同例1。

镜检：将载玻片置于荧光显微镜20倍物镜下观察，从图5中可以看出通过apm预处理后的材料，有丝分裂中期相的数量明显的提高了。dapi染色后，在荧光显微镜100倍油镜下照相，染色结果如图6，图中比例尺为即所示，由图可见，该簇毛麦根尖细胞染色体数目为14，中期分裂相多，染色体分散良好、重叠少。