一种利用电泳筛选靶蛋白‑天然产物多组分复合体的方法与流程

本发明涉及一种利用电泳筛选靶蛋白-天然产物多组分复合体的方法，具体是指通过电泳技术筛选与靶蛋白结合的特定天然产物多组分的研究方法。

背景技术：

目前，结合于靶蛋白的天然产物多组分药物的筛选在精准药物研发领域中有着至关重要的作用。大部分药物以单靶点、单组分、高亲和力为特征，然而单靶点、单组分药物普遍会产生毒副作用和抗药性，因此单靶点、多组分、低选择性的药物在疾病治疗中起越来越重要的作用。目前的药物筛选技术主要有亲和色谱技术、磁珠筛选技术、超滤技术等。但是这些技术主要研究单个靶蛋白单组分的筛选，且需要将靶蛋白固定化，导致覆盖靶蛋白的活性位点，不能有效筛选活性成分。这些技术存在筛选步骤繁琐、费时、费力等缺点，不能有效地对结合于靶蛋白的多组分进行筛选。基于以上问题，需要开发操作简单、无需靶蛋白固定化、且能准确有效地分离出与靶蛋白结合的天然产物多组分的筛选研究方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有药物筛选技术中靶蛋白天然产物多组分的筛选效率低、靶蛋白-多组分复合体分离过程复杂而影响筛选结果等不足，而提出了一种能够简单准确地利用电泳筛选结合于靶蛋白的天然产物多组分的研究方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种利用电泳筛选靶蛋白-天然产物多组分复合体的方法，包括如下步骤：

(1)将靶蛋白与天然产物多组分在缓冲溶液中孵化，形成靶蛋白-天然产物多组分复合体混合溶液；

(2)将孵化后的靶蛋白-天然产物多组分复合体混合溶液加入到电泳装置的进样室，所述进样室由两个醋酸纤维素膜组成，所述醋酸纤维素膜的两端分别为正电极室和负电极室，在所述正电极室和所述负电极室中加入缓冲溶液；

(3)在电泳装置两端施加电压，使整个体系形成电场进行电泳分离；游离的天然产物多组分吸附在醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，靶蛋白-天然产物多组分复合体穿过醋酸纤维素膜，从进样室迁移到正电极室或负电极室；

(4)将正电极室或负电极室和醋酸纤维素膜中的组分做进一步分析，确认与靶蛋白结合的特定天然产物多组分。

优选的，所述醋酸纤维素膜的孔径≤0.2μm。

优选的，所述缓冲溶液为乙酸铵和二甲基亚砜的混合液，所述混合液中乙酸铵的浓度为10mm，二甲基亚砜的体积分数为5％。

优选的，所述步骤(4)中，进一步分析是指利用液相色谱—串联质谱和核磁共振波谱，确定与靶蛋白结合的特定天然产物多组分。

优选的，所述步骤(1)孵化的条件为35℃～37℃下孵化30～40min，或在3℃～5℃下孵化2～5小时。

优选的，所述步骤(3)电压为7～10v。

优选的，所述步骤(3)的电泳过程在3℃～5℃下进行。

本发明筛选与靶蛋白结合的天然产物多组分的机理为：靶蛋白与天然产物多组分在缓冲溶液中孵化，特定天然产物多组分与靶蛋白发生特异性结合,形成靶蛋白-天然产物多组分复合体。每种单一靶蛋白都具有不同的等电点，在不同于等电点的ph缓冲溶液中带不同电荷。靶蛋白-天然产物多组分复合体在电场作用下迁移，并穿过醋酸纤维素膜，向正电极室或负电极室移动。没有与靶蛋白结合的天然产物多组分，由于自身所带电荷量小，在电场作用下迁移率小，因此吸附在醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，从而达到筛选与靶蛋白结合的特定天然产物多组分的目的。

本发明提供的利用电泳筛选靶蛋白-天然产物多组分复合体的方法，能够从天然产物复杂基质中快速筛选与靶蛋白相互作用的多组分，且该筛选方法简单、有效、准确率高。

附图说明

图1为本发明不加电场时的电泳装置和样品状态示意图；

图2为本发明加电场后的电泳装置和靶蛋白-天然产物多组分复合体与游离多组分分离示意图；

其中，1、醋酸纤维素膜，2、天然产物多组分，3、靶蛋白-天然产物多组分复合体，4、电源，5、正电极室，6、负电极室。

具体实施方式

本发明提供了一种利用电泳筛选靶蛋白-天然产物多组分复合体的方法，包括如下步骤：

首先，将靶蛋白与天然产物多组分在缓冲溶液中进行孵化，形成靶蛋白-天然产物多组分复合体混合溶液。本发明对靶蛋白和天然产物的种类没有特殊限定，可以根据实验目的确定合适的靶蛋白和天然产物种类。在本发明具体实施例中，靶蛋白优选为人血清白蛋白hsa或α葡萄糖苷酶，天然产物多组分优选为五味子成分或人参皂苷成分，但并非是对本发明的限定。本发明对缓冲溶液的种类没有特殊限定。根据靶蛋白与天然产物多组分的种类不同，确定合适的缓冲溶液，使靶蛋白与天然产物多组分能够溶解于缓冲溶液中，且能够发生特异性结合。在本发明具体实施例中，优选缓冲溶液为乙酸铵和二甲基亚砜的混合液。其中，乙酸铵的浓度优选为10mm，二甲基亚砜体积分数优选为5％。根据靶蛋白与天然产物多组分的种类不同，选择合适的孵化条件，使天然产物多组分与靶蛋白发生特异性结合。在本发明中，孵化的条件优选为35℃～37℃下孵化30～40min，或在3℃～5℃下孵化2～5小时。具体孵化条件根据靶蛋白的稳定性决定。如果靶蛋白在37℃稳定，可选为37℃，孵化30～40min；如果不稳定，最好选为4℃，孵化2～3小时。经过孵化后，缓冲液中的靶蛋白与天然产物多组分进行特异性结合，形成靶蛋白-天然产物多组分复合体。

将孵化后的靶蛋白-天然产物多组分复合体混合溶液加入到电泳装置的进样室，所述进样室由两个醋酸纤维素膜组成；在醋酸纤维素膜两端的正电极室和负电极室中加入缓冲溶液。缓冲液在正电极室和负电极室的液面高度与进样室中样品的高度相同，保持无液面差。本发明中，醋酸纤维素膜的孔径≤0.2μm，进一步优选为≤0.1μm。在电场中，醋酸纤维素膜对靶蛋白-天然产物多组分复合体和天然产物多组分具有一定的吸附力，根据靶蛋白-天然产物多组分复合体和天然产物多组分在电泳装置的电场中所受的不同电泳力，将自身所受电泳力小于与醋酸纤维素膜吸附力的小分子吸附到醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，所受电泳力大于与醋酸纤维素膜吸附力的蛋白质，会穿过醋酸纤维素膜，从进样室迁移到正电极室或负电极室，从而将靶蛋白-天然产物多组分复合体和游离的天然产物多组分进行分离。

本发明中，为了防止施加电压产生的热对靶蛋白的稳定性有影响，优选电泳过程在3℃～5℃的温度下进行。在本发明具体实施例中，将整个电泳装置放入4℃冰箱内进行电泳。在电泳装置两端施加电压，使整个体系形成电场进行电泳分离。本发明对电泳装置的电压没有特殊限定。在本发明中，优选电泳装置的电压为7～10v，进一步优选为8～9v。电泳装置中，游离的天然产物多组分由于自身所带电荷量小，在电场作用下迁移率小，因此吸附在醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，即天然产物多组分与醋酸纤维素膜的吸附力>自身所受电泳力；靶蛋白-天然产物多组分复合体由于其电荷量大，在电场作用下进行迁移，穿过醋酸纤维素膜，从进样室迁移到正电极室或负电极室，即靶蛋白-天然产物多组分复合体所受电泳力>与醋酸纤维素膜的吸附力。

将孵化后的混合液进行电泳后，对电泳装置正电极室或负电极室和醋酸纤维素膜中的组分做进一步分析，确认与靶蛋白结合的特定天然产物多组分。优选的，进一步分析是指利用液相色谱—串联质谱和核磁共振波谱，确定与靶蛋白结合的特定天然产物多组分结构和类型。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以人血清白蛋白hsa为靶蛋白，五味子成分为天然产物多组分为例进行说明。具体实验过程如下：

①取干燥的五味子粗粉，用甲醇超声萃取，利用氮气将甲醇吹干，加入100％二甲基亚砜完全溶解五味子成分。靶蛋白溶解于10mm乙酸铵溶液中；

②hsa与五味子成分在37℃下孵化30min，使五味子中的多组分与hsa特异性结合，形成hsa-五味子多组分复合物，最终溶液为10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液；

③用注射针将hsa与多组分混合物加到电泳装置的进样室中。电泳装置的进样室由两个醋酸纤维素膜组成，其孔径≤0.2μm。醋酸纤维素膜的两端分别为正电极室和负电极室。在正电极室和负电极室加入缓冲溶液，使正电极室和负电极室的液面高度与进样室中样品的高度相同，无液面差；缓冲液为10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液。

④将电泳装置放置于4℃冰箱内，设置电泳装置的电压为8v，打开电泳装置的电源供应系统，进行电泳分离；

没有与hsa结合的游离的五味子多组分由于自身所带电荷量小，因此在电场作用下迁移率小，吸附在醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，即五味子多组分与醋酸纤维素膜的吸附力>自身所受电泳力；hsa在10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液中带负电荷，hsa-五味子多组分复合物由于其带负电荷，在电场作用下进行迁移，穿过醋酸纤维素膜，从电泳装置的进样室迁移到正电极室，即靶蛋白-天然产物多组分复合物所受电泳力>与醋酸纤维素膜的吸附力；

⑤将正电极室和醋酸纤维素膜中的组分用液相色谱—串联质谱和核磁共振波谱做进一步分析，确认与hsa结合的五味子多组分。

实施例2

以α葡萄糖苷酶为靶蛋白，人参皂苷为天然产物多组分为例进行说明。具体实验过程如下：

①取干燥的人参粗粉，加入80％乙醇，82℃索氏回流2小时，真空浓缩得到人参皂苷粉末，用100％二甲基亚砜溶液完全溶解人参皂苷多组分；靶蛋白α葡萄糖苷酶溶解于10mm乙酸铵溶液中；

②α葡萄糖苷酶与人参皂苷多组分在37℃下孵化30min，使人参皂苷多组分与α葡萄糖苷酶特异性结合，形成α葡萄糖苷酶-人参皂苷多组分复合物，最终溶液为10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液；

③用注射针将α葡萄糖苷酶与人参皂苷多组分混合物加到电泳装置的进样室中。电泳装置的进样室由两个醋酸纤维素膜组成，其孔径≤0.2μm。醋酸纤维素膜的两端分别为正电极室和负电极室。在正电极室和负电极室加入缓冲溶液，使正电极室和负电极室的液面高度与进样室中样品的高度相同，无液面差；缓冲液为10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液。

④将电泳装置放置于4℃冰箱内，设置电泳装置的电压为9v，打开电泳装置的电源供应系统，进行电泳分离；

没有与α葡萄糖苷酶结合的游离的人参皂苷多组分由于自身所带电荷量小，因此在电场作用下迁移率小，吸附在醋酸纤维素膜上或溶解在进样室的溶液中，即人参皂苷多组分与醋酸纤维素膜的吸附力>自身所受电泳力；α葡萄糖苷酶在10mm乙酸铵和5％(v/v)二甲基亚砜混合液中带负电荷，α葡萄糖苷酶-人参皂苷多组分复合物由于其带负电荷，在电场作用下进行迁移，穿过醋酸纤维素膜，从电泳装置的进样室迁移到正电极室，即靶蛋白-天然产物多组分复合物所受电泳力>与醋酸纤维素膜的吸附力；

⑤将正电极室和醋酸纤维素膜中的组分用液相色谱—串联质谱和核磁共振波谱做进一步分析，确认与α葡萄糖苷酶结合的人参皂苷多组分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。