本发明涉及电化学传感器检测技术领域，更具体地说是一种利用肽核酸作为中和剂的置换反应实现对atp的快速超灵敏检测的电化学方法。
背景技术：
三磷酸腺苷（triphosadenine,atp）又称腺苷三磷酸，是一种不稳定的高能磷酸化合物。atp是生物体最重要的能量组成成分，根据各种细胞内的atp含量有所不同可以通过检测细胞内atp的含量来分辨出细胞的种类、形貌、生命活性和观察细胞对外界环境所作出的细胞效应。环境检测分析方面，atp经常作为微生物污染的一个指标，通过检测样品中atp的浓度分析计算出微生物的数量的方法考评环境的污染程度。由于atp经常用于辅助治疗肌肉萎缩、脑溢血后遗症、心肌疾患及肝炎等临床疾病，对三磷酸腺苷含量进行检测可以有效地评估临床药物，生物制剂或生物活性物质对各种临床疾病的有效性和敏感性。因此，快速而又准确地检测细胞乃至生物机体内的atp含量对于保证生命体各项生理活动的正常进行有着非常重要的意义。
肽核酸（pna）是一类人工合成的具有多肽骨架的寡聚核苷酸类似物，由于碱基序列特异性配对原则，肽核酸能够与dna和rna结合形成稳定的复合物使其对核酸的结合具有高度特异性和亲和力。其次，肽核酸具有较高生物学稳定性和热稳定性并且其化学结构中没有核酸酶、多肽酶和蛋白酶的识别位点，所以很难被任何已知的核酸酶、多肽酶或蛋白酶降解。另外，肽核酸因为自身的独特性质可以有效地调节dna复制、基因转录、翻译等遗传机制，同时将它作为杂交探针时还能明显提高遗传学检测和医疗诊断的效率和灵敏度。所以，特异性更强、亲和力更大、稳定性更高、可修饰范围广、选择性好且无毒性得pna探针逐渐取代dna探针占据了主导地位。
目前atp检测方法，如层析法、电泳法、同位素示踪法、化学发光法和生物发光法，虽然能大范围检测、操作简单，但同时进行多物质检测时需要使用多种不同类型的仪器、成本较高、灵敏度检测有限等。因此建立一种能够高灵敏定量检测三磷酸腺苷又能降低成本的检测方法有着难以估量的应用价值。一方面，适配体探针与中和剂pna特异性结合的特点实现了高灵敏性定量检测，又解决了同时检测核酸、蛋白质和小分子的问题。另一方面，采用一种新型金纳米棒修饰工作电极作为电化学生物传感器平台，具有简单方便，成本低的优势。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是构建一种能实现高灵敏定量检测atp又能降低成本的检测方法
一种高灵敏定量检测atp的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）电极的预处理
在打磨好的玻碳电极工作区域通过电化学沉积法沉积金薄膜，制备修饰金电极；
（2）修饰捕获探针
将20μl浓度为0.5μm的巯基化三磷酸腺苷（triphosadenine,atp）结合适配体cp滴加在步骤（1）所得预处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4磷酸缓冲溶液清洗，该缓冲溶液的含有25mm氯化钠，50mm氯化镁；
（3）修饰中和剂肽核酸
将20μl浓度为10μm的肽核酸滴加步骤（2）处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4的含25mm氯化钠磷酸缓冲溶液液清洗电极；
（４）修饰目标检测物atp
将20μl浓度为0.2mm的atp溶液滴加步骤（3）处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4的含25mm氯化钠磷酸缓冲溶液清洗电极；
（5）实验方法与参数
循环伏安法参数设定为扫描电压范围为-0.4~0.8v，扫描速率为100mv/s，微分脉冲伏安法参数设定为扫描电压范围为-0.1~0.5v，脉冲振幅为50mv，电势阶跃为5mv，脉冲周期为100ms；
（6）atp检测线测定
向（4）中修饰电极的工作区域滴加一系列浓度梯度的atp溶液，然后在同样的参数设定下进行微分脉冲伏安信号检测，通过不同atp浓度梯度下的dpv信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。
本发明的有益效果
（1）构建传感器时在工作电极的表面生长了一层新型的金纳米粒薄层，使传感器导电性和生物相容性得到很大的提升；
（2）适配体探针与中和剂肽核酸特异性结合能高灵敏性定量检测atp，且能同时检测核酸、蛋白质和小分子
（3）本发明所述方法纸基操作，成本低、操作简单。
附图说明
图1为本文所述方法的实验原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种高灵敏定量检测atp的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）电极的预处理
在打磨好的玻碳电极工作区域通过电化学沉积法沉积金薄膜，制备修饰金电极；
（2）修饰捕获探针
将20μl浓度为0.5μm的巯基化三磷酸腺苷（triphosadenine,atp）结合适配体cp滴加在步骤（1）所得预处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4磷酸缓冲溶液清洗，该缓冲溶液的含有25mm氯化钠，50mm氯化镁；
（3）修饰中和剂肽核酸
将20μl浓度为20μm的肽核酸滴加步骤（2）处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4的含25mm氯化钠磷酸缓冲溶液液清洗电极；
（４）修饰目标检测物atp
将20μl浓度为0.2mm的atp溶液滴加步骤（3）处理过的工作电极上，在湿暗条件下放置3h，该步骤修饰完成后使用浓度为25mm、ph7.4的含25mm氯化钠磷酸缓冲溶液清洗电极；
（5）实验方法与参数
循环伏安法参数设定为扫描电压范围为-0.4~0.8v，扫描速率为100mv/s，微分脉冲伏安法参数设定为扫描电压范围为-0.1~0.5v，脉冲振幅为50mv，电势阶跃为5mv，脉冲周期为100ms；
（6）atp检测线测定
向（4）中修饰电极的工作区域滴加一系列浓度梯度的atp溶液，然后在同样的参数设定下进行微分脉冲伏安信号检测，通过不同atp浓度梯度下的dpv信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。
sequencelisting
<110>济南大学
<120>一种基于中和剂置换法构建电化学生物传感器灵敏检测atp的方法
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<213>人工合成
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