一种快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

过氧化氢俗称双氧水，其化学式为h2o2，因其极强的氧化性、漂白性和杀菌性能，被广泛应用于工业生产、医学和美容等行业。在工业上主要用来生产过氧酸和过氧酸盐等；在医药行业过氧化氢主要起到杀菌消毒的作用；而在美容行业，过氧化氢因其能去除污渍则经常被添加在化妆品当中，达到美白肌肤、清理代谢物的效果。但过氧化氢的滥用会引起人体基因突变，动物癌症，加速人体细胞老化，引发多种皮肤疾病，严重的甚至还会出现呼吸困难、视力障碍等。因此，发展快速、高灵敏度的过氧化氢检测方法对环境保护、食品安全和人类健康有着重要作用。

目前用于过氧化氢检测的方法主要有化学发光法、高效液相色谱法、比色法和荧光法等，但这些检测方法大多都在成本较高、操作复杂和检测时间长等问题，不能很好地满足现场快速检测的要求。为解决上述存在着的问题，本发明提供的一种电化学传感方法用于过氧化氢的定量检测，具有灵敏度高、操作简单、成本低和耗时短等优点。而目前用于过氧化氢检测的电化学传感器大多以过氧化氢酶或辣根过氧化酶修饰电极来构建，而酶易受到温度、湿度和化学环境等因素影响而失去活性，从而影响其使用的稳定性和重现性。因此，本发明提供的一种无酶过氧化氢电化学传感器有着较大的现实意义和使用价值。

在电化学传感器构建过程中，由于裸电极的电催化活性低，对分析物的电化学响应弱，因此开发无酶电化学传感器的关键在于制备电催化性能优异的纳米复合材料用于工作电极的修饰改性，以提高传感器的电化学响应性能。这是因为以多元纳米材料经过复合工艺制备的多相材料，在性能上互相取长补短，产生协同催化效应，使复合材料的综合性能优于原组成材料。在电极修饰材料领域中纳米复合材料通常表现出优于单组分材料的电催化活性，从而极大改善了电化学传感器的灵敏度和检出限。最近，报道用于增强过氧化氢电化学响应信号的电极修饰材料主要有：纳米多孔金膜(检出限为3700nmol/l，a.sukeri,a.s.lima,m.bertotti,microchemicaljournal133(2017)149–154)、纳米多孔nio膜(检出限为3220nmol/l，p.salazar,v.rico,a.r.gonzález-elipe,electrochimicaacta235(2017)534–542)、mnox/c纳米复合膜(检出限为500nmol/l，p.ahuja,s.k.ujjain,r.kanojia,appliedsurfacescience404(2017)197–205)、ag/c纳米复合膜(检出限为2200nmol/l，王奕琛,姜秀娥,分析化学42(2014)689–694)等。但是这些功能纳米粒子体系存在着易团聚和分散性不足等缺点，所制备的电极成膜性和稳定性欠佳，特别是构建的传感器还存在检出限较高的问题，不利于痕量过氧化氢的现场检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的首要技术问题是，提供一种检出限低的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极及其制备方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极的制备方法，包含如下步骤：

(1)n-rgo的制备：首先将氧化石墨烯用水进行分散得氧化石墨烯分散液；然后将氧化石墨烯分散液的ph值调至8.0～9.0；再在氧化石墨烯分散液中加入尿素，于100～150℃反应，反应结束后纯化产物，即得n-rgo；

(2)ag@cu2o/n-rgo的制备：首先将n-rgo用水进行分散，得n-rgo分散液；然后在n-rgo分散液中加入cuso4，得n-rgo和cuso4混合溶液；再在n-rgo和cuso4混合溶液中加入柠檬酸钠和碳酸钠以及聚乙烯吡咯烷酮；接着加入葡萄糖溶液，在80～100℃条件下反应至溶液呈砖红色，冷却至室温；随后加入agno3于室温下搅拌至溶液由砖红色转变为深灰色；最后分离、纯化即得ag@cu2o/n-rgo；

(3)将步骤(2)制备得到的ag@cu2o/n-rgo修饰在玻碳电极上即得所述的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极(即ag@cu2o/n-rgo复合膜修饰电极，简称ag-cu2o/n-rgo/gce)。

所述的室温为15～30℃。

n-rgo为氮掺杂还原氧化石墨烯的简称。

ag@cu2o/n-rgo为银-氧化亚铜核壳结构纳米粒子功能化氮掺杂还原氧化石墨烯的简称。

优选地，

步骤(1)中氧化石墨烯与水的用量比为100mg：30～100ml；氧化石墨烯与尿素的用量比为100mg：3～10g；

步骤(2)中n-rgo和水的用量比为50mg：70～120ml；n-rgo和cuso4的用量比为50mg：0.5～0.6g；n-rgo与柠檬酸钠、碳酸钠以及聚乙烯吡咯烷酮的用量比为50mg：0.9～1.0g：0.6～0.7g：7～8g；n-rgo分散液与葡萄糖溶液的用量比为90ml：5～7ml；葡萄糖溶液的浓度为1～1.5mol/l；n-rgo与agno3的用量比为50mg：0.005～0.006g。

进一步优选地，

步骤(1)中氧化石墨烯与水的用量比为100mg：30～80ml；氧化石墨烯与尿素的用量比为100mg：3～8g；

步骤(2)中n-rgo和水的用量比为50mg：80～100ml；n-rgo和cuso4的用量比为50mg：0.5～0.55g；n-rgo与柠檬酸钠、碳酸钠以及聚乙烯吡咯烷酮的用量比为50mg：0.9～0.95g：0.6～0.65g：7～7.5g；n-rgo与agno3的用量比为50mg：0.005～0.0055g。

更进一步优选地，步骤(1)中氧化石墨烯与水的用量比为100mg：40～60ml；氧化石墨烯与尿素的用量比为100mg：4～6g。

优选地，步骤(1)中将氧化石墨烯分散液的ph值调至8.3～8.7；于110～130℃反应，反应时间为10～14h。

优选地，步骤(3)中的具体方法为：将步骤(2)制备得到的ag@cu2o/n-rgo用n,n-二甲基甲酰胺分散，得ag@cu2o/n-rgo分散液；将ag@cu2o/n-rgo分散液覆盖在玻碳电极的表面，干燥后即得所述的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极；ag@cu2o/n-rgo和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为7.5mg：4～6ml。

对于使用纳米复合材料制备测定具体某种化学物质成分含量的电极，则需要发明人根据具体待测定的化学物质的性质制备不同的纳米复合材料。制备出的电极对所要测定物质的检测速度、检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的好坏主要由纳米复合材料的制备方法决定。纳米复合材料的制备方法主要包括原材料的选择、原材料的配比，以及各个步骤反应条件等。对于用作电极的纳米复合材料，其制备方法中原材料的选择、配比以及各个步骤反应条件的不同都会导致后续制备得到的电极电化学性能的巨大差异，从而导致检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的巨大差异。

根据过氧化氢的特性，为得到具有低检出限的过氧化氢检测电极，本发明发明人通过大量的实验，不断调整原料组成、配比以及制备过程中的工艺参数，制备得到了全新的ag@cu2o/n-rgo，进一步制备得到ag@cu2o/n-rgo复合膜修饰电极；ag@cu2o/n-rgo中的ag以“壳”的形式高分散在cu2o“核”表面上，极大提高了ag纳米颗粒的分散性、有效防止其团聚，可增加纳米材料的有效使用表面积，从而可以极大提高修饰电极的稳定性和催化活性。氧化石墨烯拥有大的比表面积和较多的含氧基团，可以作为功能纳米粒子的分散载体。而将氮掺杂进氧化石墨烯(n-rgo)后会进一步增强其电催化性能，这是因为氮原子的电负性大，易吸电子，使氮原子上的负电荷增多，相邻的碳原子上的正电荷增加导致其催化性能得到极大改善。基于这些优势，本发明可有效提高制备得到ag@cu2o/n-rgo复合膜修饰电极的催化性能和稳定性能，同时降低了其测定过氧化氢的检出限。

本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极。

本发明还提供一种快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器，其工作电极选用上快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极。

优选地，所述的快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器，以上述的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极为工作电极、铂丝电极为对电极、ag-agcl电极为参比电极构成三电极体系，将三电极体系组装后与电化学工作站相连构成电化学传感器。

本发明还提供一种应用快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器检测过氧化氢的含量的方法，其利用上述快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器，采用计时电流法，具体包含如下步骤：

测定不同浓度的过氧化氢标准溶液对应的电流响应值，得出过氧化氢浓度与其电流响应值的线性方程；所述的线性方程为i(μa)＝92.18c(μmol/l)+5.044(r²＝0.9981)，该方程中c为过氧化氢浓度，i为计时电流法得到电流响应值；

测定待测样品溶液的电流响应值，根据线性方程换算出过氧化氢浓度，进而得出样品中的过氧化氢的含量；

优选地，所述的计时电流法的具体参数为：初始电位为-0.2v、采样间隔0.1s、静止时间2s、尺度数为1。

有益效果：本发明提供了一种由全新纳米复合材料ag@cu2o/n-rgo快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极以及包含此电极的无酶电化学传感器；无酶化学修饰电极上复合的ag@cu2o/n-rgo以氧化石墨烯为初始原料采用水热法将氮掺杂进去，然后利用原位化学法将核壳结构的ag@cu2o成功负载在n-rgo层上得到一种新型的纳米复合材料，该材料克服了常规纳米粒子易团聚和石墨烯片层易堆叠等现象；与单组分功能化的n-rgo材料相比，本发明所述的ag@cu2o/n-rgo能有效提高修饰电极对过氧化氢的电催化活性；实验证明，本发明所述的快速检测过氧化氢的无酶电化学电极的检出限低至0.66nmol/l，灵敏度为92.18μa^-1·μmol^-1，响应时间小于5.0s；此外所述的电极抗干扰性和稳定性好，实验证明常见的葡萄糖、vb1、左旋多巴胺、草酸、叶酸、抗坏血酸、扑热息痛、氯化铁和氯化铜等物质不影响过氧化氢的检测，且所制备的无酶电化学电极在室温条件下保持30天其电流响应值仍为初始值的95％以上；因此，由本发明无酶化学修饰电极组成的无酶电化学传感器能实现过氧化氢的现场快速检测，具有携带便利、操作简单、成本低廉、灵敏度高和检出限低等优点，在环境保护、食品安全和临床医疗等方面有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为cu2o/n-rgo(a)和ag@cu2o/n-rgo(b)的扫描电镜图。

图2为ag@cu2o/n-rgo的能谱图。

图3为gce(a)、n-rgo/gce(b)、cu2o/n-rgo/gce(c)、ag/n-rgo/gce(d)和ag-cu2o/n-rgo/gce(e)在含4.0mmol/l过氧化氢的磷酸底液(ph＝7.0)中的循环伏安图。

图4为gce(a)、n-rgo/gce(b)、cu2o/n-rgo/gce(c)、ag/n-rgo/gce(d)和ag-cu2o/n-rgo/gce(e)在磷酸底液(ph＝7.0)中连续加入过氧化氢的计时电流曲线。

图5不同过氧化氢浓度与其电流响应值之间的线性关系图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1ag@cu2o/n-rgo的制备

(1)n-rgo的制备：将100mg氧化石墨烯加入50ml水，超声25min使之充分分散，之后用氨水将分散液的ph值调到8.5，再加入5.0g尿素混合均匀后置于不锈钢高压反应釜中，于120℃反应12h；反应结束后，将反应釜冷却至室温，然后将产品于纯水中渗析20h后于60℃下烘干得到n-rgo；

(2)ag@cu2o/n-rgo的制备：在烧杯里称取50mg的n-rgo，加入90ml水超声分散35min后加入0.52gcuso4，随后将磁石加入，磁力搅拌15min使之充分溶解；将6ml已备好的混合液(0.95g柠檬酸钠+0.63g碳酸钠)进一步加入上述混合液中，边加边搅拌，加入时间控制15min以内，之后加入7.2g聚乙烯吡咯烷酮搅拌，待溶解后慢慢滴加6ml1.4mol/l的葡萄糖，水浴加热到90℃，20min后得到砖红色的cu2o。随后将反应体系在室温下冷却后再加入0.0057gagno3于常温下搅拌20min，在葡萄糖的还原作用下溶液颜色由砖红色逐步转变为深灰色(表明生成了核壳结构的ag@cu2o纳米粒子)；最后，将所得产品分别用纯水、乙醇洗涤后离心分离，于60℃下烘干得到ag@cu2o/n-rgo。

为了进行性能对比，在上述步骤过程中不加入cuso4、柠檬酸钠、碳酸钠和聚乙烯吡咯烷酮时合成ag/n-rgo；在上述步骤中不加入agno3时合成cu2o/n-rgo。

图1为cu2o/n-rgo(a)和ag@cu2o/n-rgo(b)的扫描电镜图。从图1(a)可见具有典型的褶皱表面的氮掺杂还原氧化石墨烯上均匀的分布着立方体结构的cu2o颗粒，说明cu2o已被成功负载在n-rgo上。图2(b)是在cu2o的表面原位化学沉积上金属ag，在图中可以看到小颗粒状的ag纳米粒子附着在cu2o颗粒上，形成核壳结构的ag@cu2o复合纳米粒子。ag@cu2o成功负载在氮掺杂还原氧化石墨烯(n-rgo)上有利于增加复合膜修饰电极的电活性比表面积，能有效改善其电催化活性，增强复合膜修饰电极的传感性能和稳定性能。

图2为ag-cu2o/n-rgo的能谱图。从图中可见，复合材料中主要含有c、o、cu、ag等元素，证实了本发明ag@cu2o成功负载在成功负载在氮掺杂还原氧化石墨烯(n-rgo)上。另外，s、na等元素是样品合成过程中通过反应的原料引进的，它们的存在不影响材料的使用性能。

实施例2快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极的制备

利用0.3μm和0.05μm的al2o3粉将玻碳电极(gce，直径3mm)在砂纸上抛光打磨成光滑的镜面，然后依次用1:1的稀硝酸、丙酮和蒸馏水超声清洗gce5min待用。然后，取7.5mg实施例1制备好的ag@cu2o/n-rgo加入到5.0mln,n-二甲基甲酰胺中，超声分散15min后得ag@cu2o/n-rgo的分散液，在处理好的gce表面上滴加该悬浊液3μl，在红外灯照射下烤干即制备获得快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极(即ag@cu2o/n-rgo复合膜修饰电极，简称ag-cu2o/n-rgo/gce)。

为了便于对比，参照上述方法制备n-rgo/gce、cu2o/n-rgo/gce、ag/n-rgo/gce。

使用上述电极测定4.0mmol/l过氧化氢在ph＝7.0的磷酸底液中的循环伏安图。以及测试磷酸底液(ph＝7.0)中连续加入过氧化氢的计时电流曲线图。具体见图3和图4。

图3为4.0mmol/l过氧化氢在ph＝7.0的磷酸底液中于gce(a)、n-rgo/gce(b)、cu2o/n-rgo/gce(c)、ag/n-rgo/gce(d)和ag-cu2o/n-rgo/gce(e)上的循环伏安图。从图中可见，过氧化氢在裸gce上未出现明显的还原峰，而在修饰电极上不仅出现了修饰材料本身的氧化还原峰，更为重要的是出现了较为明显的过氧化氢还原峰。其中，在ag-cu2o/n-rgo/gce上的还原峰电流最大、超电势最小，还原峰电位最正为-0.38v，相比n-rgo/gce、cu2o/n-rgo/gce、ag/n-rgo/gce分别正移了0.12v，0.10v和0.07v。这说明ag-cu2o/n-rgo/gce对过氧化氢有着最好的电催化还原作用，有利于提高其所制备传感器的检测性能。

图4为gce(a)、n-rgo/gce(b)、cu2o/n-rgo/gce(c)、ag/n-rgo/gce(d)和ag-cu2o/n-rgo/gce(e)在磷酸底液(ph＝7.0)中连续加入过氧化氢的计时电流曲线。图中可见，过氧化氢在裸gce上电流响应非常微弱，而在修饰电极上出现明显的电流响应信号。特别是在ag-cu2o/n-rgo/gce上，电流响应信号最为明显，信号响应时间小于5.0s；且随着过氧化氢的逐渐加入，计时电流曲线出现阶梯式增加。在过氧化氢浓度增加一致的情况下，相比其它电极，ag-cu2o/n-rgo/gce的电流响应幅度增加最大，说明ag-cu2o/n-rgo/gce对过氧化氢有着最好的电催化还原作用和检测灵敏度，有利于降低传感器对过氧化氢的检出限。

以计时电流法考察本实施例制备得到的ag-cu2o/n-rgo/gce对过氧化氢的检测性能。先将所制备的ag-cu2o/n-rgo/gce与铂丝电极、ag-agcl电极构成三电极体系连接电化学工作站，在ph为7.0的磷酸底液中，以初始电位为-0.2v、采样间隔0.1s、静止时间2s、尺度数为1测得不同浓度过氧化氢的计时电流响应值。从图5可见，过氧化氢的计时电流值随着其浓度的增加而逐步增大，计时电流响应值与其浓度在54～700nmol/l的范围内呈良好的线性关系；线性方程为i(μa)＝92.18c(μmol/l)+5.044(r²＝0.9981)，该方程中c为过氧化氢浓度，i为计时电流法得到电流响应值。检出限根据下列方程得出：

dl＝ksb/r

上式中，dl代表检出限；k代表置信系数，通常k取3；sb代表标准偏差，实验中测得的标准偏差为2.0280×10^-8；r代表灵敏度即线性方程斜率值，经计算可得检出限为0.66nmol/l。

以计时电流法考察本实施例制备得到的ag-cu2o/n-rgo/gce在检测过氧化氢时的抗干扰能力。先将本实施例制备的ag-cu2o/n-rgo/gce与铂丝电极、ag-agcl电极构成的三电极体系连接电化学工作站，在ph为7.0的磷酸底液中，以初始电位为-0.2v、采样间隔0.1s、静止时间2s、尺度数为1时测得0.4mmol/l过氧化氢的计时电流响应值，然后分别加入10.0mmol/l的葡萄糖、10.0mmol/l的vb1、10.0mmol/l的左旋多巴胺、0.3mmol/l的草酸、0.4mmol/l的叶酸、1.0mmol/l的抗坏血酸、0.1mmol/l的扑热息痛、10.0mmol/l的氯化铁以及10.0mmol/l的氯化铜对0.4mmol/l的过氧化氢计时峰电流的影响。在误差允许±5％范围内，以上这些不同倍数的干扰物对过氧化氢的计时电流值无明显影响，表明本发明制备的电化学传感器具有较好的检测选择性和抗干扰能力。

以计时电流法考察本实施例制备得到的ag-cu2o/n-rgo/gce的稳定性。先将本实施例制备得到的ag-cu2o/n-rgo/gce与铂丝电极、ag-agcl电极构成的三电极体系连接电化学工作站，在ph为7.0的磷酸底液中，以初始电位为-0.2v、采样间隔0.1s、静止时间2s、尺度数为1测得0.4mmol/l过氧化氢的计时电流响应值，之后在室温条件下存放30天再次在同样条件下测其计时电流响应值。由于并没有采用常见的生物酶进行电极修饰，本发明提供的过氧化氢无酶化学修饰电极具有非常好的稳定性，室温环境下存放30天后，电流响应保持在初始值的95％以上。

实施例3快速检测过氧化氢的无酶电化学传感器的制备

以实施例2制备得到的快速检测过氧化氢的无酶化学修饰电极(ag-cu2o/n-rgo/gce)为工作电极、铂丝电极为对电极、ag-agcl电极为参比电极构成三电极体系，将三电极体系组装后与电化学工作站相连构成电化学传感器。

实施例4样品溶液中过氧化氢的检测方法

以ph为7.0的磷酸底液配置样品溶液，利用采用无酶电化学传感器，采用计时电流法，测定样品溶液的电流响应值，根据线性方程换算出过氧化氢浓度，进而得出样品中的氧化氢的含量。

所述的计时电流法的具体参数为：以初始电位为-0.2v、采样间隔0.1s、静止时间2s、尺度数为1测得不同浓度过氧化氢的计时电流响应值。

所述的线性方程为i(μa)＝92.18c(μmol/l)+5.044(r²＝0.9981)，该方程中c为过氧化氢浓度，i为计时电流法得到电流响应值。