本发明涉及一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置及方法。
背景技术：
拉曼成像技术是一种分子水平的化学表征成像技术，显微拉曼宽场成像更是一种高时间、空间分辨率的拉曼成像手段。通过单色激光对样品进行宽场激发，再通过可调滤光片对拉曼信号进行窄带滤波，获得样品的单波长宽场拉曼图像。目前，由于具有高的时间、空间分辨能力，显微宽场拉曼成像技术被广泛应用于生物化学、电化学过程的原位表征等前沿科学领域。
由于拉曼图像中的背景背景造成拉曼图像的对比度降低，要得到更为准确的拉曼图像需要对背景进行扣除。不同于扫描成像，现有的显微宽场拉曼成像系统，在进行时间序列的单波长宽场成像时，没有可供参考的全光谱拉曼信号，难以对其拉曼图像进行背景估计。为解决目前的显微宽场拉曼成像系统这一技术缺陷，本发明提出了在采集单波长宽场拉曼图像的同时，利用光谱仪采集样品宽场激发区域的全光谱拉曼信号用于估计宽场成像装置所获得拉曼图像中的背景。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供了一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置及方法，在获得样品的宽场拉曼图像同时，对背景拉曼图像进行背景估计，具有广泛的应用价值。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置，用于估计时间序列宽场拉曼图像的背景；所述显微宽场拉曼图像背景估计装置包括两部分：1)、宽场拉曼成像系统；2)、基于光谱仪的背景估计装置。
所述宽场拉曼成像系统包括宽场激发光源、透镜组、可调滤光片和成像装置；所述宽场激发光源对样品进行宽场激发，产生拉曼信号；该拉曼信号通过所述透镜组，经过可调滤光片窄带滤波后作用于所述成像装置，得到宽场拉曼图像；
所述背景估计装置包括光谱仪、透镜组、扫描振镜和分光镜；所述分光镜将拉曼信号收集光路分为二路，该二路拉曼信号分别作用至所述宽场成像系统中的成像装置和所述光谱仪；
样品经过宽场激发后产生拉曼信号，该信号依次通过所述分光镜、透镜组、所述扫描振镜传输至所述光谱仪狭缝；所述扫描振镜为可转动结构，并通过在一定角度内偏转使所述光谱仪狭缝对应的像在所述宽场激发区域内移动。
该装置还包括控制系统，所述控制系统分别与所述光谱仪和成像装置连接，并控制所述光谱仪和宽场成像系统的曝光时间以及所述扫描振镜的偏转角度。
作为一种优选，所述分光镜可以采用半透半反射镜。
一种显微宽场拉曼图像的背景估计方法，使用上述的一种背景估计装置，包括以下步骤：
步骤1，使用均匀白光对光谱仪和成像装置二者所获得的数据强度对应关系进行标定，并通过多项式拟合得出如下对应关系：
iw＝anisn+an-1isn-1+…+a1is+a0+σ(1)
其中，iw为成像装置所记录的单波长宽场拉曼图像经过数据转换后得到的光谱，通过光谱仪对该宽场激发区域扫描获得光谱is，a0,a1,…,an为拟合获得的多项式系数，σ为拟合误差项；
步骤2，通过对样品进行宽场激发，并将所述可调式滤光片设置为通过波长λ1，并在所述成像装置得到波长为λ1的宽场拉曼图像，在光谱仪上可以得到正对狭缝中心的宽场激发区域中一条线上所有点的拉曼光谱信号；
控制扫描振镜偏转并扫过整个宽场激发区域，使光谱仪得到整个宽场激发区域上的高光谱数据集data(i,j)，其中(i,j)为样品上对应点的笛卡尔坐标位置；对于λ1所在特征峰区间的高光谱数据集data(i,j)作基线拟合，得到该特征峰区间上的基线背景，并在遍历整个数据集后，获得光谱仪所测量的背景图像b(i,j)；
将b(i,j)代入式(1)，如式(2)所示，得到对应于宽场拉曼图像中的背景图像b(i,j)：
b(i,j)＝anb(i,j)n+an-1b(i,j)n-1+…+a1b(i,j)+a0(2)
作为一种优选，所述光谱仪对于宽场激发区域的扫描方式为逐行扫描、隔行扫描或等间距扫描。具体扫描方式的选择上，根据不同拉曼体系进行调整。所述逐行扫描的方式适用于背景变化缓慢的拉曼体系，所述隔行扫描或等间距扫描的方式适用于背景变化较快的拉曼体系。
作为一种优选，所述扫描方式采用隔行扫描或逐行扫描时，通过高斯核插值或双线性插值等插值算法对未扫描部分的背景图像数据进行恢复。
作为一种优选，所述成像装置的曝光时间和光谱仪的曝光时间一致。
本发明的有益效果如下：
该背景估计装置在宽场成像系统中引入了光谱仪，并在宽场成像系统采集样品的单波长宽场拉曼图像的同时，获得样品的全光谱拉曼信号。先在均匀光场下，标定光谱仪和成像装置二者所获得的数据强度对应关系。在获得样品的单波长宽场拉曼图像的同时，通过光谱仪扫描获得样品的全光谱拉曼信号，对所得到的全光谱拉曼信号进行数据处理得到特定峰位置处的背景图像。最后，根据标定所确定的对应关系，将光谱仪所获得的背景图像转换为与成像装置所记录的拉曼图像对应的背景图像。
所述背景估计装置及方法在获得样品的宽场拉曼图像同时，对拉曼图像的背景进行评估，使得所获得的宽场拉曼图像能更准确的反应样品的信息，具有广泛的应用价值。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明；但本发明的一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置不局限于实施例。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
实施例：
参见图1所示，本发明的一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置，用于评估时间序列宽场拉曼图像中的背景；所述显微宽场拉曼图像背景估计装置包括两部分：1)、宽场拉曼成像系统；2)、基于光谱仪的背景估计装置。
所述宽场拉曼成像系统包括，样品平台1、宽场激发光源2、物镜3、组合滤波片4、分光镜5、镜筒透镜6、4f透镜组7、可调滤光片8、成像装置9；所述背景估计装置包括，4f透镜组10、扫描振镜11、收集透镜12、光谱仪13。所述扫描振镜11为可转动结构，控制扫描振镜11的偏转使得光谱仪狭缝14所对应的像在宽场激发区域内移动，其方向如图样品平台1上双向箭头所示。所述宽场激发光源2对样品进行激发产生拉曼信号；该宽场拉曼信号经过图示光路，经过所述分光镜5分光，分别传输至成像装置9和光谱仪13；
本发明装置还包括控制系统，所述控制系统分别与所述成像装置9以及光谱仪13，并控制所述成像装置9和光谱仪13的曝光时间以及所述扫描振镜11的偏转角度。
一种显微宽场拉曼图像的背景估计方法，使用上述的一种背景评价装置，包括以下步骤：
步骤1，使用均匀白光，对光谱仪13和成像装置9二者所获得的数据强度对应关系进行标定；并通过多项式拟合得出如下对应关系：
iw＝anisn+an-1isn-1+…+a1is+a0+σ(1)
其中，iw为成像装置所记录的单波长宽场拉曼图像经过数据转换后得到的光谱，通过光谱仪对该宽场激发区域扫描获得光谱is，a0,a1,…,an为拟合获得的多项式系数，σ为拟合误差项；
步骤2，对样品进行宽场激发，并将所述可调式滤光片8设置为通过波长λ1，并在所述成像装置9得到波长为λ1的宽场拉曼图像，在光谱仪13上可以得到正对光谱仪狭缝14中心的宽场激发区域中一条线上所有点的拉曼光谱信号；
控制扫描振镜11偏转并扫过整个宽场激发区域，使光谱仪13得到整个宽场激发区域上的高光谱数据集data(i,j)，其中(i,j)为样品上对应点的笛卡尔坐标位置；对于λ1所在特征峰区间的高光谱数据集data(i,j)作基线拟合，得到该特征峰区间上的基线背景，并在遍历整个数据集后，获得背景图像b(i,j)；
将b(i,j)代入式(1)，如式(2)所示，得到对应于宽场拉曼图像中的背景图像b(i,j)：
b(i,j)＝anb(i,j)n+an-1b(i,j)n-1+…+a1b(i,j)+a0(2)
所述光谱仪狭缝14在宽场激发区域上的扫描方式为逐行扫描、隔行扫描或等间距扫描。所述扫描方式采用隔行扫描或等间距时，通过高斯核插值或双线性插值等插值算法对未扫描部分的背景图像数据进行补充。所述成像装置9的曝光时间和光谱仪13的曝光时间一致。
附图1中，宽场激发光2沿图中箭头方向入射，通过45度安装的边缘滤光片4(edgefilter)反射后通过物镜达到样品表面。组合滤波片4(edgefilter和longpassfilter)用来滤除杂散光和瑞利光。所述拉曼信号通过可调式滤光片(tunablefilter)进行窄带滤波即可在成像装置上获得单波长宽场拉曼图像。
4f透镜组7用于对将显微镜套筒透镜(tubelens)进行像面转移，方便安装可调滤光片8和成像装置9。4f透镜组10，主要用于增大扫描振镜11的可调节角度，即增大光谱仪狭缝的像在样品表面上的扫描范围。当扫描振镜11处于初始位置时，即与光谱仪13收集光路主光轴呈45度角位置时，光谱狭缝所成像的位置如图中样品平台1上的实线所示；当扫描振镜11偏转一定角度后，如图中虚线位置所示，此时光谱仪狭缝14所成像的位置如图中样品平台1上的虚线所示。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种显微宽场拉曼图像的背景估计装置及方法，但本发明并不局限于实施例，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例光路、光学元件所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明技术方案的保护范围内。