内嵌内标分子的纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种内嵌内标分子的纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法。

(二)

背景技术：

表面增强拉曼光谱(surfaceenhancedraman)是一种可以提供目标分子的指纹信息的超灵敏非标记检测方法，通过检测吸附在纳米粒子表面的分子的振动特征来鉴别分子物种，广泛应用于物理、化学、生物医学、考古学、纳米科学等领域。理论上光谱的强度正比于样品的浓度，由于仪器本身的因素，包括激发光激发功率的变化、信号采集以及周围环境变化等的影响，不能直接得到样品的绝对拉曼强度与其浓度的线性关系，所以sers技术一般用于定性分析。通过检测物与内标分子相对sers强度定量检测的方法已被广泛接受，此法不仅可以消除仪器本身的影响，还可以校正因基底形态或流速变化的影响。

目前，一种内标方法是将内标分子和检测物同时修饰在基底的外表面，这种方法使内标分子和被检测分子具有相同的sers环境，能够很好的消除不确定因素的影响，可是这种方法要求内标分子不与检测物分子发生反应，而且会争夺sers‘热点’。另一种是核-分子-壳纳米粒子模式，这种方法能够保护内标分子不受外界分子的影响且不占据纳米粒子的sers‘热点’，但是核-分子-壳纳米粒子需要添加凝聚剂使其达到sers增强的最优化，然而凝聚剂的添加又增加了一个不可控影响因素，且凝聚会使粒子表面环境、sers‘热点’等改变。因此新的sers定量方法有待于改进。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够快速、灵敏、准确可靠的定量检测分析分子的内嵌内标分子的纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析的方法。

本发明的技术方案是：

一种内嵌内标分子的纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析的方法，所述方法包括：

(1)以金纳米粒子为内核，在内核表面修饰上内标分子，所述内标分子为对巯基苯甲酸(pmba)；

(2)在内标分子外围包覆银外壳，得到au-pmba@ag纳米粒子溶胶；

(3)将au-pmba@ag纳米粒子溶胶与待测分子混合均匀，或者将au-pmba@ag纳米粒子溶胶先制备成基底、再滴加待测分子；

(4)进行表面增强拉曼检测，及mapping。

所述金纳米粒子为长方体或棒状金纳米粒子。

所述au-pmba@ag纳米粒子溶胶制备成单层基底。

所述au-pmba@ag纳米粒子中，pmba分子所占金纳米棒表面积的比值为100％。

所待测分子为下列之一：r6g分子、结晶紫、氨基酸等。

具体的所述待测分子为r6g分子时，所述方法如下：

(1)取金纳米棒，加入pmba和十六烷基三甲基氯化铵，超声振荡0.5～2小时，然后离心，去上清，再加超纯水离心洗涤，得到修饰内标分子的金纳米棒；

(2)步骤(1)修饰内标分子的金纳米棒加到ctac溶液中，50～60℃加热，磁力搅拌10～20min，然后加入硝酸银溶液，继续搅拌5～10min，再加入抗坏血酸，继续加热搅拌3～4小时，最终溶液颜色为绿色；离心、超纯水洗涤，再离心，沉淀转移到pvp乙醇溶液，超声2～h，离心、无水乙醇洗涤，离心、沉淀用无水乙醇重悬，得到au-pmba@ag纳米粒子溶胶；

(3)au-pmba@ag纳米粒子加入环己烷和二氯甲烷均匀混合，然后取混合溶液于离心管，并加入辛烷混合，滴加于直径2cm的水面上，待有机相完全挥发后，干净的硅片沉于液面下之后，通过提拉硅片将液面上的银纳米棒的膜转移到硅片表面，得到au-pmba@ag纳米粒子单层基底；

(4)将步骤(3)制备好的基底泡于浓度分别为10nm、30nm、50nm、70nm、90nm和100nm的r6g乙醇溶液中过夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光谱显微镜上进行sers成像；计算r6g610cm^-1sers强度与内标分子pmba1080cm^-1sers强度的比值并做出与r6g浓度的关系图；

(5)将上述制备好的基底泡于待测样品溶液中过夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光谱显微镜上进行sers成像，计算r6g610cm^-1sers强度与内标分子pmba1080cm^-1sers强度的比值，对照步骤(4)关系图，即可获得待测样品溶液中的r6g浓度值。

本发明在核-壳纳米粒子之间融入一种内标分子，在拉曼检测时，纳米粒子自带内参分子，使内参分子和待测分子除了分子的不同外，所处的检测环境几乎完全相同，所以可以通过待测分子与内参分子的比值得到待测分子拉曼强度与其浓度的标准曲线，从而定量检测待测分子。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1)本发明的内嵌内标分子的纳米粒子的制备方法简单，制备的原材料易得，而且核-壳金属纳米粒子的大小可控，粒度均一。

2)本发明与球形纳米粒子相比较形态、粒度均一，不依赖于聚集产生拉曼活性。

3)本发明核-壳纳米粒子的核壳间加有内标分子，对吸附在纳米粒子表面的分析物具有校正作用，从而定量检测分析物。

4)本发明的内嵌内标分子的纳米粒子既可以作为溶液基底也可以作为固体基底。

(四)附图说明

图1是内嵌内标分子的纳米粒子及其基底的制备的实验流程示意图。

图2是内嵌内标分子的纳米粒子的紫外可见光谱。

图3是内嵌内标分子的纳米粒子的tem照片。

图4是内嵌10％-100％pmbaau@ag长方体的sers强度与pmba所占百分比的关系图r²＝0.98366。

图5是r6g分子在au-pmba@ag长方体溶胶外中的校正前后拉曼强度与浓度的关系，其中1是r6g分子在au-pmba@ag长方体溶胶外中的校正前拉曼强度与浓度的关系图r²＝89.237，2是r6g分子在au-pmba@ag长方体溶胶外中的校正后拉曼强度与浓度的关系图，r²＝0.99633。

图6为au-100％pmba@ag长方体及基底的sem表征及mapping成像结果，其中(1)是内嵌au-100％pmba@ag长方体的tem表征图，图6(2)是au-100％pmba@ag长方体纳米粒子单层基底sem表征，图6(3)是sers基底的mapping成像，图6(4)是mapping各点的sers光谱。

图7为r6gsers强度与内标分子pmbasers强度的比值与r6g浓度的关系图；其中图7(1)是内标分子pmba在不同r6g浓度下的sers强度，图7(2)是r6g的sers强度未经内标分子校正时的关系图，r²＝0.97581，图7(3)是r6g的sers强度经内标分子校正后的关系图r²＝0.99161

(五)具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此：实施例1：内嵌内标分子的纳米粒子及其基底的制备：

图1是内嵌内标分子的纳米粒子及其基底的制备的实验流程示意图，具体制备方法是：

制备金纳米棒种子：

1)0.364gctab，9.75ml超纯水溶解，250ul10mm氯金酸，搅拌10min后加入0.6ml10mm硼氢化钠搅拌2min，28摄氏度水浴放置30min。

2)7.2gctab，0.987g油酸钠，400ml超纯水溶解，20ml10mm氯金酸搅拌15min，8ml10mmagno3搅拌5min，1.2ml浓盐酸搅拌5min，640ul0.1m抗坏血酸搅拌30s，30摄氏度水浴过夜得到金棒，金棒长82nm。

取290ul浓度为3.43nm的金纳米棒(长约82nm，直径约20nm)，加入一定量的浓度为0.1mm的pmba和浓度为80mm的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，100hz超声振荡1小时，然后6500rpm/min离心15min，去上清，再加1ml超纯水6500rpm/min离心洗涤15min，然后加到8ml浓度为80mm的ctac溶液，60℃加热，300r/min磁力搅拌20min，然后加入5ml浓度为2mm的硝酸银溶液，继续搅拌5min，再加入2ml浓度为50mm的抗坏血酸，继续加热搅拌3.5小时，最终溶液颜色为绿色。6500rpm/min离心15min，30ml超纯水洗涤，6500rpm/min离心15min，1ml超纯水重悬。

其中加入0.1mm的pmba的量为0，25ul，50ul，75ul，100ul，150ul，200ul，225ul，250ul，对应加入的浓度为80mm的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)体积为710ul，685ul，660ul，635ul，610ul，560ul，510ul，485ul，460ul，使加入的金纳米棒、pmba、ctac三者的体积和为1ml。

图2是不加和加入不同浓度的pmba后的紫外可见光谱，其中0-100表示的是pmba分子所占金纳米棒表面积的比值0％-100％，从该谱图可以看到，加入pmba后的紫外吸收略有蓝移，但是不明显，峰宽也无明显变化，说明pmba的加入并不会影响au@ag长方体的合成。为了达到可观的实验效果，后续实验采用pmba占比为100％的银纳米粒子，即au-100％pmba@ag。

图3是不加和加入不同浓度的pmba后的tem照片，从该图中可以明显的看到金棒内核和银壳，且粒度均一，杂颗粒少，而且加入不同比例的pmba后粒子形态均无明显变化，再一次证明pmba的加入不会影响au@ag长方体的合成。

图4是内嵌10％-100％pmbaau@ag长方体的sers强度与pmba所占百分比的关系图。由图可知，pmba的拉曼强度与其占金棒表面积的百分比线性相关，相关系数r²＝0.98366。即随着pmba浓度的升高其sers强度也逐渐增强。

实施例2：

1)以au-100％pmba@ag为例，利用au-100％pmba@ag内的pmba分子作为内标分子，r6g分子作为分析物分子，进行sers定量分析检测。

2)取290ul浓度为3.43nm的金纳米棒(长约82nm，直径约20nm)，加入250ul浓度为0.1mm的pmba和460ul浓度为80mm的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，100hz超声振荡1小时，然后6500rpm离心15min，去上清，再加1ml超纯水6500rpm离心洗涤15min，然后加到8ml浓度为80mm的ctac溶液，60℃加热，300r/min磁力搅拌20min，然后加入5ml浓度为2mm的硝酸银溶液，继续搅拌5min，再加入2ml浓度为50mm的抗坏血酸，继续加热搅拌3.5小时，最终溶液颜色为绿色。6500rpm/min离心15min，30ml超纯水洗涤，6500rpm/min离心15min，沉淀转移到3mlpvp乙醇溶液，超声3h，6500rpm/min离心15min，4ml无水乙醇洗涤，6500rpm/min离心15min，1ml无水乙醇重悬。重复制备12个。

3)在1)中制备好的12个au-100％pmba@ag溶胶中分别加入不同量的r6g,使终浓度分别为100nm，90nm，70nm，50nm，30nm，10nm，4.8nm，2.4nm，1.2nm，0.6nm，0.3nm，0.15nm。100hz超声2h，过夜，使r6g分子充分吸附到au-100％pmba@ag纳米粒子表面。6000rpm/min离心10min,1ml乙醇洗涤，6000rpm/min离心10min，洗去游离的r6g分子，500ul乙醇重悬。

4)将2)准备好的样品进行sers检测。

图5(1)是r6g分子在au-pmba@ag长方体溶胶外中的校正前拉曼强度与浓度的关系图r²＝89.237。由图可知，校正前r6g分子的拉曼强度与浓度的线性关系并不强，相关系数只有r²＝89.237，而校正后(图5(2))其线性相关性很强，相关系数r²＝0.99633，即使r6g分子的浓度跨度很大线性相关性也还很好。说明au-100％pmba@ag溶胶用于定量分析具有可行性和可靠性。

实施例3：

1)取290ul浓度为3.43nm的金纳米棒(长约82nm，直径约20nm)，加入250ul浓度为0.1mm的pmba和460ul浓度为80mm的十六烷基三甲基氯化铵(ctac),100hz超声振荡1小时，然后6500rpm离心15min，去上清，再加1ml超纯水6500rpm离心洗涤15min，然后加到8ml浓度为80mm的ctac溶液，60℃加热，300r/min磁力搅拌20min，然后加入5ml浓度为2mm的硝酸银溶液，继续搅拌5min，再加入2ml浓度为50mm的抗坏血酸，继续加热搅拌3.5小时，最终溶液颜色为绿色。6500rpm/min离心15min，30ml超纯水洗涤，6500rpm/min离心15min，沉淀转移到3mlpvp乙醇溶液，超声3h，6500rpm/min离心15min，4ml无水乙醇洗涤，6500rpm/min离心15min，250ul无水乙醇重悬。

2)au-100％pmba@ag长方体纳米粒子单层基底制备

上述制备好的au-100％pmba@ag长方体纳米粒子250ul，加入250ul环己烷和250ul二氯甲烷均匀混合，然后取200ul混合溶液于1ml离心管，并加入10ul辛烷混合，滴加于直径2cm的水面上，待有机相完全挥发后，干净的硅片沉于液面下之后，通过提拉硅片将液面上的银纳米棒的膜转移到硅片表面。组装基底的sem表征见图6(2)。

au-100％pmba@ag长方体纳米粒子单层基底sers表征：

将上述组装好基底置于共焦拉曼光谱显微镜上进行sers成像。成像面积20×20μm²，扫描步长2μm，激发光532nm，激发功率4.4mw，积分时间1s，激发和信号收集物镜10倍na值0.25。sers基底的mapping成像见图6(3)，mapping各点的sers光谱见图6(4)。sersmapping和所有谱图1080波数峰强度的相对误差分析证明组装的银长方体基底具有很好的增强均匀性。

实施例4：

1)单层基底制备如实施案例3所述。

2)au-100％pmba@ag长方体纳米粒子单层基底定量分析：

将上述制备好的基底泡于浓度分别为10nm、30nm、50nm、70nm、90nm和100nm的r6g乙醇溶液中过夜，取出自然晾干，置于共焦拉曼光谱显微镜上进行sers成像，成像面积20x20μm²，扫描步长2μm，激发光532nm，激发功率4.4mw，积分时间1s，激发和信号收集物镜10倍na值0.25。计算r6g610cm^-1sers强度与内标分子pmba1080cm^-1sers强度的比值并做出与r6g浓度的关系图，见图7，其中图7(1)是内标分子pmba在不同r6g浓度下的sers强度，由图可知pmba的sers强度变化不大，保持相对稳定。图7(2)是r6g的sers强度未经内标分子校正时的关系图，r²＝0.97581，图7(3)是r6g的sers强度经内标分子校正后的关系图r²＝0.99161，说明银的长方体单层基底也具有一定的定量分析作用。