区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的血清标志物及其应用的制作方法

本发明属于医药生物
技术领域：
，具体而言，涉及区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的血清标志物及其应用。
背景技术：
：急性主动脉夹层(tad)和急性肺栓塞(ape)是临床上常见的致死性心血管疾病。二者临床表现多不典型，往往会因为患者症状的非特异性，如呼吸困难、胸闷、胸痛、晕厥等导致误诊和漏诊。对于这种急性胸痛病因难以确定的高危患者多依赖于影像学检查，但其检查时间较长，易延误治疗，且在反复转运和检查过程中可能出现病情加重等。所以，利用有效的实验室检查项目诊断疾病类型已经成为一个非常活跃的研究领域，可以快速高效准确地诊断疾病并及时有效治疗。目前最常用的鉴别诊断生物标志物是d-二聚体(d-dimer)，d-dimer是纤维蛋白水解后特异性的终末产物，其水平升高多提示纤溶系统激活，即体内处于高凝状态或有急性血栓的形成时可显著升高。肺栓塞是静脉系统，尤其是下肢深静脉血栓形成后脱落，引起肺动脉主干或分支的堵塞。主动脉夹层是由于主动脉内膜破裂，血液通过内膜破口形成血肿，内膜进一步撕裂、剥脱。因此，两者病理改变均涉及纤溶系统的改变。有相关文献提出主动脉夹层、肺栓塞等疾病过程中都会出现d-dimer水平升高。因此使用d-dimer诊断疾病时有较高的敏感性但是特异性较差，无法特异地区分两种疾病。因此，从临床快速诊断的角度出发，急需有较高灵敏度和特异度的标志物来区分两种疾病，使病人得到及时有效的治疗。技术实现要素：本发明首先涉及区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的血清标志物，所述的血清标志物为蛋白因子，所述的蛋白因子为：lox-1：血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1。本发明还涉及由所述的血清学诊断标志物制备而成的用于区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的诊断试剂盒。本发明还涉及所述的血清学诊断标志物在制备区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的检测试剂盒中的应用。本发明还涉及由所述的血清学诊断标志物制备而成的用于区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的诊断试剂盒。所述的区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的方法为：(1)收集待测患者的血清样本；(2)将所述血清样本稀释10倍；(3)使用elisa方法检测样本中的血清学诊断标志物的含量，和标准数据进行对比，区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞；所述的区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的方法为，检测所述血清学标志物在血清中的浓度，当：lox-1的值<424.01pg/ml时，判断待测人员患有肺栓塞；lox-1的值>424.01pg/ml时，判断待测人员患有主动脉瘤/主动脉夹层。优选的，所述的诊断试剂盒为利用elisa原理进行诊断的诊断试剂盒。优选的，所述的试剂盒包括，样品稀释液，针对所述的诊断标志物的抗体，显色剂。本发明还涉及使用所述血清学诊断标志物区分主动脉瘤/主动脉夹层和急性肺栓塞的方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集待测患者的血清样本；(2)将所述血清样本稀释10倍；(3)使用elisa方法检测样本中的血清学诊断标志物的含量，和标准数据进行统计对比，得出患者患病信息。本发明所述的诊断试剂盒为利用elisa原理进行诊断的诊断试剂盒。本发明所述的试剂盒还包括，样品稀释液，针对所述的诊断标志物的抗体，显色剂。附图说明图1、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组、肺栓塞组、健康人组中表达水平的柱状图。图2、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组和健康人组中进行对比分析roc联合曲线。图3、9个因子在肺栓塞组和健康人组中进行对比分析roc联合曲线。图4、9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层组和肺栓塞组中进行对比分析roc联合曲线。图5、区分主动脉瘤/主动脉夹层组和急性肺栓塞组的最佳因子lox-1的roc曲线。图6、区分主动脉瘤/主动脉夹层组和急性肺栓塞组的最佳因子lox-1的血清学检测结果。具体实施方式实施例1、主动脉瘤/主动脉夹层血清学标记物的差异验证根据性别和年龄随机分组，挑选32例健康人做对照，主动脉瘤/主动脉夹层患者31例，使用qah-cust芯片，检测抽取的血清样本中的蛋白因子的表达水平。实验步骤：1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。2、标准品的配置：(1)添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为std1。(2)分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。(3)抽取100μl的std1加入到std2中轻轻混合，然后从std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀释至std7。(4)抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。3、芯片操作流程(1)每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片；(2)抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育；(注：样品按照合适稀释倍数上样)(3)清洗：使用thermoscientificwellwashversa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先，用1×洗液i进行清洗，每孔250μl的1×洗液i，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液i；其次，换用1×洗液ii通道进行清洗，每孔250μl的1×洗液ii，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液ii；(4)检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，添加80μl的检测抗体到每个孔中，37℃摇床上孵育2小时；(5)清洗，同步骤(3)(6)cy3-链霉亲和素的孵育：离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，37℃摇床上孵育1个小时。(7)清洗，同步骤(3)(8)荧光检测：1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面；2)采用激光扫描仪innoscan300扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)：仪器型号：innoscan300microarrayscanner(厂家：innopsys)扫描参数：wavelengh：532nm；resolution：10μm(9)采用qah-cust的数据分析软件来进行数据分析。统计结果：qah-cust芯片筛选后，待测血清中的蛋白因子表达水平差异较大的蛋白因子见下表1。表1、qah-cust芯片筛选血清样本的结果lcn2：lipocalin-2、脂质运载蛋白2lox-1：血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1trail：肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、tnf-relatedapoptosisinducingligandfn1：fibronectin、纤维连接蛋白pf4：platletfactor4、cxcl4、血小板因子4saa：serumamyloida、血清淀粉样蛋白aopg：osteoprotegerin、骨保护素、肿瘤坏死因子受体超家族，成员11b(tnfrsf11b)plg：plasminogen、血纤维蛋白溶酶原ang：angiopoietin、血管形成因子。实施例2、主动脉瘤/主动脉夹层血清学标记物的大样本验证根据性别和年龄随机分组，挑选101例健康人做对照，主动脉瘤/主动脉夹层患者234例，肺栓塞患者203例。进行血清蛋白标记物的elisa实验，使用相应的raybiotechhumanelisakit，检测实施例1获得的9种蛋白因子的表达水平，验证该组蛋白因子能否有效区分主动脉瘤/主动脉夹层患者。实验步骤如下：1、试剂准备(1)将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃)；(2)样品根据预实验结果，按照下表2所示的倍数对样品进行稀释。表2、检测不同诊断标识物时的稀释倍数检测目标稀释倍数trail1.5fn120000lcn2200plg50000opg5ang30lox-110saa50pf44000(3)assaydiluent(iteme)使用去离子水稀释5倍备用；(4)标准品准备:离心itemc小管，然后加入400μlassaydiluent(iteme)到标准品小管中，混合均匀后即为50ng/ml的标准品贮存液；准备8个1.5ml小离心管，往第一个管加入475μlassaydiluent缓冲液，然后抽取50ng/ml的标准品贮存液25μl加入到第一个管中，混合均匀后为2500pg/ml，标记为std1；往余下7个管分别加入300μlassaydiluent缓冲液，之后依次标记为std2、std3、std4、std5、std6、std7；然后用50ng/ml的std1梯度稀释标准品，抽取200μl50ng/ml标准溶液(即std1)加入std2小管中，混匀后抽取该管中200μl溶液加入到std3小管中后混匀，依次方法直到配制好std7，std8只是300μlassaydiluent即标准品0pg/ml；(5)洗液稀释：用去离子水将浓缩洗液稀释20倍备用；(6)离心检测抗体小管(temf)，加入100μl稀释液1xassaydiluent(iteme)充分溶解，用移液器上下轻轻吹打，然后用稀释液1xassaydiluent稀释80倍后使用；7)离心hrp-链霉亲和素(itemg)，然后用稀释液1xassaydiluent稀释200倍后使用；2、操作步骤(1)将试剂盒以及样品平衡至室温(18-25℃)；标准品以及部分样品使用复孔检测，部分样品单孔检测；(2)已经包被抗体的elisa板平衡至室温后，在对应的孔加入100μl配制好的标准品及样品，用封板膜封住整块板条，4℃孵育过夜；(3)将配制好的1x洗液添加到洗板机上，用洗板机清洗板条4次，每孔加入300μl洗液；(4)洗板干净后，每孔加入100μl配制好的检测抗体(生物素标记抗体)，室温孵育1h；(5)清洗，步骤同(3)；(6)每孔加入100μl配制好的hrp-链霉亲和素室温孵育45min；(7)清洗，步骤同(3)；(8)加入100μltmb显色液至每孔中，室温避光孵育30min；(9)加入50μl终止液至每孔中，立即在酶标仪450nm读数。(10)采用sigmaplot12.0软件计算浓度值。实验结果如下：(1)9个因子在主动脉瘤/主动脉夹层(a组)、肺栓塞(pe组)、健康人(h组)中表达水平浓度数值见图1所示；结果可见：所述的9个因子能够很好的区分动脉瘤患者、肺栓塞患者和健康人群。(2)9个因子在区分主动脉瘤/主动脉夹层(a组)vs健康人(h组)、肺栓塞(pe组)vs健康人(h组)、主动脉瘤/主动脉夹层(a组)vs肺栓塞(pe组)时的roc结果；对上述9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(a组)和健康人(h组)时的roc统计结果见表3联合roc曲线见图2，对上述9个因子用于区分肺栓塞(pe组)和健康人(h组)时的roc统计结果见表4联合roc曲线见图3，对上述9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(a组)和肺栓塞(pe组)时的roc统计结果见表5联合roc曲线见图4。表3、9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(a组)和健康人(h组)时的roc统计结果表4、9个因子用于区分肺栓塞(pe组)和健康人(h组)时的roc统计结果表5、9个因子用于区分主动脉瘤/主动脉夹层(a组)和肺栓塞(pe组)时的roc统计结果实施例3、最佳诊断蛋白因子分析通过各个因子的联合作用的roc统计分析，确定区分主动脉瘤/主动脉夹层(a)和健康人(h)、肺栓塞(pe)和健康人(h)、主动脉瘤/主动脉夹层(a)和肺栓塞(pe)的最佳的诊断组合。经过进一步分析，确定最佳的区分主动脉瘤/主动脉夹层(a)和肺栓塞(pe)的诊断因子为lox-1，再次选取418例主动脉瘤/主动脉夹层患者的血清和298例肺栓塞患者的血清，按照实施例1-2的方法进行血清学标记物检测，结果如下表6或图6所示。表6、主动脉瘤/夹层患者(a)和肺栓塞患者(pe)的血清标志物lox-1的浓度对动脉瘤组和肺栓塞组进行分析，9个因子的各种组合都进行了分析，找到最佳的因子是lox-1，roc联合曲线下面积0.932(见图5)，cut-off值424.01pg/ml。因子曲线下面积pvalue95％cisensitivityspecificitylox-10.9320.0000.913-0.95086.60％88.59％最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。当前第1页12