专利名称：一种检测遗传性胸主动脉瘤和夹层相关基因突变的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测遗传性胸主动脉瘤和夹层相关基因突变的方法，具体的是一种检测遗传性胸主动脉瘤和夹层相关基因TGFBRl、TGFBR2和ACTA2突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的检测方法。
背景技术：
胸主动脉瘤(Thoracic Aortic Aneurysms),为胸主动脉某段管腔的病理性扩张。 按病理解剖可分为真性和假性动脉瘤。发病率随年龄增长而增加，50 70岁达到高峰，男性多于女性。胸主动脉瘤不是真正的肿瘤，而是由于各种原因造成的主动脉一处或多处向外拔出，出现的像“瘤子一样”的改变则称为主动脉瘤。胸主动脉瘤，指的是发生在主动脉窦、升主动脉、主动脉弓或降主动脉的动脉瘤。胸主动脉瘤是退行性变，胸部主动脉部分异常扩张，变形，呈瘤样突出。主动脉夹层(aortic dissection)也称主动脉夹层动脉瘤,是较常见也是最复杂、 最危险的心血管疾病之一，随着人们生活及饮食习惯的改变，其发病率呈上升趋势。主动脉夹层指主动脉腔内的血液通过内膜的破口进入主动脉壁囊样变性的中层而形成夹层血肿，随血流压力的驱动，逐渐在主动脉中层内扩展，是主动脉中层的解离过程，并非主动脉壁的扩张，有别于主动脉瘤。过去此种情况被称为主动脉夹层动脉瘤(aortic dissecting aneurysm),现多改称为主动脉夹层血肿(aortic dissectin ghematoma),或主动脉夹层分离，简称主动脉夹层本病多急剧发病，突发剧烈疼痛、休克和血肿压迫相应的主动脉分支血管时出现的脏器缺血症状。65% 75%病人在急性期(2周内)死于心脏压塞、心律失常等心脏合并症。年龄高峰为50 70岁，男性发病率较女性为高，男女之比为2 3 I。胸主动脉瘤和夹层(Thoracic Aortic Aneurysms and Aortic Dissections TAAD)具有起病急、进展快、死亡率高的特点，是心血管疾病中的危重症之一。TAAD的病因与环境、遗传等诸多因素均有关系，高血压是其中主要的危险因子。此外，一些结缔组织综合征如马凡氏综合征(MFS)等也可导致TAAD。临床上TAAD以主动脉夹层、扩张及动脉瘤形成为主要表现，典型症状胸痛往往是其唯一的临床表现，而一旦出现症状，不同部位的主动脉(升主动脉、主动脉弓、胸主动脉、 腹主动脉)病变已不可逆转，主动脉的破裂和心脏压塞则是该病灾难性转归。在目前条件下，手术或介入治疗是唯一有效的方法。该病发病率国外报道为1/10万，在美国的年死亡人数达15，000人以上。我国没有统计数字，但在临床工作中，也并非是少见疾病。TAAD发病凶险，65% -75%的患者在急性期死于心脏压塞和主动脉破裂。能否在临床症状或血管病变出现之前对高危人群进行预测，是挽救病人生命的关键。目前TAAD诊断的主要依据影像学检查，但在症状和体征并不典型时作用有限；生化检查虽可助一臂之力，但目前尚缺少可信的生化指标；基因诊断是近年来兴起的基于分子遗传学的技术，它可从DNA水平对患者进行诊断，并使医生能在患者出现症状前即可进行早期诊断和危险分层。令人鼓舞的是，近年来ACTA2等TAAD致病基因的陆续发现，为在临床上展开基因诊断打下基础，预计不仅有助于TAAD的诊断以及治疗，而且使提前预防和干预TAAD成为可能。临床上发现有15% -20%的TAAD患者有家族史，遗传方式呈现常染色体显性遗传特征，我们称之为遗传性TAAD。与临床表型异质性相对应，TAAD具有很强的遗传异质性， 目前已经鉴定出 6 个 TAAD 遗传位点TAAD1 (5ql3_14)，FAAl (llq23_24)，TAAD2 (3p24_25)， TAAD3 (15q24-26)，TAAD4 (10q23_24)以及16pl2_13位点，但仍还有相当多的TAAD家系未被定位。当前被克隆出来的致病基因主要有3个TGFBRl、TGFBR2和ACTA2。TGFBRl和TGFBR2 基因分别编码转化生长因子β受体(Transforming Growth Factor Beta Receptor) I型和2型，两者分别定位于染色体3p22和9q33_q34。已知TGFBRl和TGFBR2突变位点均发生在蛋白胞浆区域，影响受体的激酶活性。有研究报道，在外源转化生长因子β (TGF-β) 刺激下，体外培养的携带TGFBR2突变患者的主动脉平滑肌细胞(Smooth Muscle Cells, SMCs)组织不能正常分化，影响SMCs相关收缩蛋白的表达，推测最终导致其功能受损而引发 TAAD[1, 2]。ACTA2 编码平滑肌-α 肌动蛋白(smooth muscle-specific alpha-actin), 定位于染色体10q22_q24。ACTA2基因是TAAD遗传领域近年来的重要进展之一。Guo等发现在TAAD家系中ACTA2突变率高达14%，而且在部分散发的发病较早TAAD患者中也发现有ACTA2突变(突变率约为4% ) [3]。平滑肌-α肌动蛋白是平滑肌细胞中最丰富的一种蛋白质，它参与了大动脉和其他血管的收缩，对维持大动脉结构的完整性至关重要。根据上述发现，本发明选择与遗传性TAAD综合征密切相关的基因TGFBR1、TGFBR2和ACTA2进行检测，为诊断遗传性TAAD提供依据。本发明检测TGFBR1、TGFBR2和ACTA2基因的突变位点如下
权利要求
1.一种检测TGFBR1、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a.设计并制备用于TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针；b.将待测DNA样品和步骤a所得探针加入反应管中，加入连接反应与PCR扩增反应所需试剂，DNA样本变性与探针杂交，通过调节反应温度激活连接酶，对探针进行连接反应；c.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对通用引物对步骤b所得完成连接的探针序列进行PCR扩增反应；d.将步骤c所得PCR扩增反应产物与液相芯片中的xTAG微球进行杂交，杂交反应后加入链霉素亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过路明克斯液相芯片设备检测荧光信号。
2.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于TGFBRl基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针包含了 TGFBRl基因4个突变位点的野生型序列，所述4个突变位点为934G>A、944A > GU457T > CU459C > T。
3.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于TGFBRl基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针序列为SEQ ID No. I-SEQ ID No. 8。
4.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于TGFBR2基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针包含了 TGFBR2基因2个核苷酸突变位点的野生型序列，所述的2个突变位点为 1378C > TU379G > A。
5.按照权利要求I所述，一种检测TGFBR1、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于TGFBR2基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针序列为SEQ ID No. 9-SEQ ID No. 12。
6.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于ACTA2基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针包含了 ACTA2基因7个核苷酸突变位点的野生型序列，所述的7个突变位点为 397A > C、353G > A、450T > C、445C > T、664T > C、772C > T、773G > A。
7.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，用于ACTA2基因突变检测的多重寡核苷酸连接检测探针序列为SEQ ID No. 13-SEQ ID No. 26。
8.按照权利要求I所述，一种检测TGFBRl、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，其特征在于，多重寡核苷酸连接检测探针包含一条长探针和一条短探针，其中长探针包含5’端与靶基因特异性序列互补的杂交序列，3’端共同序列和位于杂交序列和共同序列之间的特异性标签序列，短序列包含3’端与靶基因特异性序列互补的杂交序列和5’端共同序列。
全文摘要
本发明涉及一种检测遗传性主动脉瘤和夹层相关基因突变的方法，具体的涉及一种检测TGFBR1、TGFBR2和ACTA2基因突变的多重寡核苷酸连接检测探针结合液相芯片的方法，该方法包括a)针对TGFBR1、TGFBR2和ACTA2基因13个突变位点设计并制备一组多重寡核苷酸连接检测探针，探针的核苷酸序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.26，b)DNA样本变性与探针杂交，进行连接反应；c)用通用引物对探针序列进行PCR扩增；d)液相芯片检测扩增产物。该技术可以实现单管反应检测多达几十个突变位点，通量高，操作简便、成本低。
文档编号C12Q1/68GK102605043SQ20111002322
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者姬云 申请人:姬云