钩吻中多种有效成分同时检测的液相色谱‑串联质谱定量方法与流程

本发明涉及一种相对定量分析方法，尤其涉及同时检测钩吻中多种化合物的相对定量分析方法；属于中草药分析技术领域。

背景技术：

钩吻为马钱科葫蔓藤植物的全草，钩吻中主要含有生物碱、环烯醚萜类、酚酸类、三萜类和油脂类等化学成分，迄今为止，国内外文献报道从钩吻植物中一共分离得到300余个化合物。钩吻具有抗肿瘤、抗炎和神经性疼痛和增强免疫等作用，主要用于治疗类风湿性关节炎疼痛、神经性疼痛、促进动物生长等。

目前，已报道从钩吻中分离得到120余个吲哚类生物碱，按其结构分为蛇根茎类(sarpagine)、钩吻素子类(koumine)、胡蔓藤乙素类(humantenine)、甲基钩吻素乙类(gelsedine)、钩吻素甲类(gelsemine)、育亨宾类(yohimbane)六大类。环烯醚萜类和酚酸类等非生物碱已分离得到100余种。

关于钩吻成分含量测定的文献报道主要有：李晶晶等采用酸性染料比色法测定钩吻及其制剂的总生物碱含量；粟建明等建立单一内标多控法同步测定钩吻中钩吻素甲和钩吻素子的含量(中药材，2013，36(10)：1626-1631)；利用hplc法测定钩吻茎中胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙的含量(药物分析杂志，2018，37(4)：595-501)；王毅等采用hplc法，以钩吻素甲和钩吻素子作为对照品，对9批钩吻样品中化学成分进行指纹图谱研究，进行主成分和聚类分析，不同产地来源的钩吻其内在化学成分均有差异，呈现出不同的分类(刑事技术，2016，41(1)：50-53)。但由于钩吻中化学成分多，在液相上也出现了几个代表性的峰，因此，仅采用2-3个有标准品的化合物进行钩吻的质量控制存在局限性，需要用更多指标成分才能监测其质量控制。在无标准品情况下，如何进行钩吻多成分分析是制约该方法的关键技术问题。

钩吻由于其毒性的限制，在市场上并未作为任何一款产品的销售，但由于其促进动物生长的效果，在2015版中兽药典中收录，因此，在兽医的临床存在一定的广泛应用。目前，钩吻提取的方法有多种，如醇提、水提、酸提碱沉等，提取工艺各不相同，质量参差不齐，为了防止钩吻中毒等不良事件的发生，确保以钩吻为原料的相关成分的质量稳定可控，需要对钩吻中的有效成分进行多成分分析相对定量分析。

中国专利(zl201510968431)公开了一种快速检测与鉴定钩吻中化学成分的分析方法，并对化合物的成分进行了质谱裂解规律和结构分析(fitoterapias，2017，121：94-105)。

技术实现要素：

针对现有技术中在钩吻化合物成分检测的方法难以实现同时对钩吻化合物中多种成分同时作定量分析等技术问题，本发明的目的是在于提供一种同时检测钩吻中多种化合物的相对定量分析方法，该方法完善了钩吻质量评价体系，定量分析方法稳定可靠、灵敏准确、检测周期短，且样品前处理简单、可解决对照品数量不足的情况下对于钩吻的质量监控。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种钩吻中多种有效成分同时检测的液相色谱-串联质谱定量方法，其包括如下步骤：以钩吻素甲甲醇溶液、钩吻素子甲醇溶液、钩吻素己甲醇溶液和钩吻碱戊甲醇溶液为对照样本溶液，以钩吻提取液为待测样本溶液，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪检测，根据检测结果计算待测样本溶液中多种有效成分的含量。

优选的方案，所述待测样本溶液的制备方法为：钩吻粉末采用质量百分比浓度为75～85％的乙醇在55～65℃温度下超声处理20～40min，过滤，收集滤液，重复上述操作一次，合并两次滤液，取1ml滤液采用氮吹后，加入同等体积初始流动相复溶，过0.22μm微孔滤膜，得到待测样本溶液。

优选的方案，所述对照样本溶液包括一系列不同浓度的钩吻素甲甲醇溶液、一系列不同浓度的钩吻素子甲醇溶液、一系列不同浓度的钩吻素己甲醇溶液和一系列不同浓度的钩吻碱戊甲醇溶液，它们由浓度均为100μg/ml的钩吻素甲溶液、钩吻素子溶液、钩吻素己溶液和钩吻碱戊溶液分别按倍数逐级稀释得到。

较优选的方案，所述钩吻粉末包括钩吻全草、根、茎、叶中至少一种粉末。

优选的方案，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为watersc18色谱柱；流动相a为4～6mm乙酸铵溶液，流动相b为乙腈，流速为0.2～0.4ml/min，柱温为25～35℃，进样量为5～15μl；

采用梯度洗脱程序：

0～2min内，流动相a和流动相b的体积比为90:10；

2～7min内，流动相a和流动相b的体积比由90:10匀速变至85:15；

7～20min内，流动相a和流动相b的体积比为85:15；

20～30min内，流动相a和流动相b的体积比由85:15匀速变至10:90；

30～33min内，流动相a和流动相b的体积比为10:90；

33～40min内，流动相a和b的体积比为90:10。

本发明优选的洗脱剂及洗脱程序能够实现钩吻化合物中多种成分的有效分离。

较优选的方案，色谱柱为c18色谱柱，口径4.6mm×柱长150mm，粒径5μm；流动相a为5mm乙酸铵溶液，流动相b为乙腈，流速为0.3ml/min，柱温为20℃，进样量为5μl。

进一步优选的方案，所述乙酸铵溶液的ph为5.2。

优选的方案，所述质谱条件为：离子源为esi离子源，检测方式为正离子检测，扫描方式为多重反应监测，脱溶剂温度为330～340℃，毛细管电压为2500v～3500v，喷雾器压力为35～45psi，去溶剂气体为n2，n2的流速为10～15l/min。

较优选的方案，所述质谱条件为：离子源为esi离子源，检测方式为正离子检测，扫描方式为多重反应监测，脱溶剂温度为335℃，毛细管电压为3000v，喷雾器压力为40psi，去溶剂气体为n2，n2流速为12l/min。

优选的方案，对不同浓度的钩吻素甲甲醇溶液、钩吻素子甲醇溶液、钩吻素己甲醇溶液和钩吻碱戊甲醇溶液为对照样本溶液进行检测，建立各对照样本溶液浓度与峰面积的关系，采用加权1/x²最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数；再对待测样本溶液进行检测，并根据检测结果计算待测样本溶液中多种有效成分的含量；x为对照样本溶液浓度，单位为μg/ml。

优选的方案，所述有效成分包括生物碱类、环烯醚萜类和酚酸类等。

优选的方案，通过对对照样本溶液和待测样本溶液进行检测后，采用外标法按回归方程计算待测样本中对照样本的含量，以待测样本作相对对照样本半定量钩吻中46种有效成分的含量做相对定量分析。

本发明的技术方案开发了一种钩吻全草中多种有效成分同时分析的相对定量分析的方法，该方法结合了前期q-tof对钩吻中化合物的鉴定结果，把其它在q-tof鉴定的化合物通过母离子与子离子进行特异性优化，确定多重反应检测(mrm)的离子对，最终建立化合物响应值与钩吻质量的标准曲线。前期qtof如(zl2015109684311)公开主要用qtof快速寻找到钩吻中的化学成分并对其结构进行分析，属于化学成分定性分析。但是鉴定结构得到的二级质谱，可提供每个化合物的碎片离子，这为本发明建立母离子与子离子的离子对扫描提供了数据支撑与依据。本发明得到无标准品的离子对主要来源于q-tof的碎片离子确定，这样选择每个化合物不同的离子对，最终确定响应值比较高的离子对进行定量检测与相对定量分析。以几个对照品建立标准曲线来确定钩吻中多种成分的含量。在此条件下，可同时检测钩吻中46中化合物，并对其含量进行了相对定量分析。

本发明的钩吻中多种有效成分同时检测的液相色谱-串联质谱定量方法包括以下具体步骤：

1)待测样本溶液的制备：取钩吻样品粉碎后，加入一定量的提取溶剂进行提取，过滤，收集滤液，重复上述操作一次，合并两次滤液，取一定体积的滤液挥发干，用初始流动相复溶，过0.22μm微孔滤膜为待测样本溶液，供液相色谱-串联质谱仪分析；

2)样品分析：采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪检测,所述高效液相色谱条件为：

采用梯度洗脱程序：

0～2min内，流动相a和流动相b的体积比为90:10；

2～7min内，流动相a和流动相b的体积比由90:10匀速变至85:15；

7～20min内，流动相a和流动相b的体积比为85:15；

20～30min内，流动相a和流动相b的体积比由85:15匀速变至10:90；

30～33min内，流动相a和流动相b的体积比为10:90；

33～40min内，流动相a和b的体积比为90:10；

所述质谱条件为：离子源为esi离子源，检测方式为正离子检测，扫描方式为多重反应监测，脱溶剂温度为330～340℃，毛细管电压为2500v～3500v，喷雾器压力为35～45psi，去溶剂气体为n2，n2的流速为10～15l/min。

3)样品定量分析：采用相对定量的方法进行样品含量检测，以不同浓度的钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊甲为对照品，以各对照品的浓度x(μg/ml)作为横坐标，以各对照品峰面积为纵坐标，用加权(1/x²)最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数，根据检测结果计算待测样本溶液中多种有效成分的含量。

本发明技术方案采用了特殊的洗脱剂实现了钩吻中有效成分的分离，采用常规的洗脱剂如水-甲醇、水-乙腈等难以实现钩吻化合物中的有效成分的有效分离，而采用5mm乙酸铵-乙腈作为流动相系统进行比较筛选，发现钩吻在5mm乙酸铵-乙腈流动相系统中的分离效果较好，洗脱能力适当，比水-甲醇、水-乙腈等分离效果好，待测组分响应值较高。优选控制乙酸铵的溶液ph至弱酸性(以5.2效果最佳)，可改善待测组分的色谱峰型，使得各色谱峰之间的分离效果良好，因此，选用5mm乙酸铵-乙腈作为流动相系统。

本发明的技术方案，通过配制定量用对照样本溶液和定量用待测样本溶液，通过外标法按回归方程计算待测样本中对照样本的含量，其中待测样本为钩吻，对照样本为钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊，多成分分析相对定量以待测样本作相对对照样本半定量钩吻中有效成分的含量。

本发明技术方案中定量用对照样本溶液的配制方法为：分别取钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊对照品粉末适量于7个10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成一定浓度的定量用对照品储备液；分别精密量取上述7个定量对照品储备液适量于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1ml含钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己钩吻碱戊均为100μg/ml，再按倍数逐级稀释。

定量用待测样本溶液的制备方法：精密称定钩吻粉末1g，至50ml烧杯中，加入25ml-80％乙醇60℃超声0.5h，重复上述操作一次，合并两次滤液，取1ml氮吹后，加入同等体积初始流动相复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得到定量用待测样本溶液。

本发明的技术方案对高效液相色谱串联三重四级杆质谱(hplc-qqq-ms/ms)联用技术的质谱条件进行了优选，分别考察了正离子和负离子的扫描方式。结果表明，大多数待测组分在正离子条件下相应较强，易于加上一个质子，生成[m+h]+的准分子离子峰。分别对多重反应检测(mrm)的离子对的去簇电压(dp)和碰撞诱导解离电压(ce)等质谱参数进行了优化，最终确定了本实验所用的质谱条件。

本发明的技术方案对4个对照样本钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻碱戊和钩吻中的化合物的正离子反应的多重离子反应监测(mrm)的离子对的去簇电压(dp)、碰撞诱导解离电压(ce)、出口电压(cxp)进行优化，对照品优化后的相关参数见表1，样品优化后的相关参数见表2。分段的化合物要说明：1:1min；2:1.2min；3:10min；4:15min；5:17.8min；6:20min；7:22min；8:25.2min；9:27.8min；10:30.2min；11:32min；12:34.2min。

表1对照品的多离子反应监测离子对和相关电压参数

表2钩吻样品中化合物的多离子反应监测离子对和相关电压参数

本发明技术方案对钩吻中有效成分的多成分分析相对定量分析方法进行了方法学验证，具体步骤如下：

专属性试验：将定量用对照样本溶液和定量用待测样本溶液进样，记录图谱，结果见图2，从图2可以看出，对照品钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊的保留时间分别是16.4、19.1、22.2、22.1，说明本发明定量分析方法的选择性良好。

线性试验，精密量取100μg/ml定量对照样本溶液，逐级稀释至1μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml、0.002μg/ml和0.001μg/ml的标准溶液，依次进样并记录图谱，以各对照品的浓度x(ng/ml)作为横坐标，以各对照品峰面积为纵坐标，用加权(1/x²)最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数，结果见表3。

平行三次精确称取钩吻样本0.5g、1g、2g、3g、4g和5g，至50ml烧杯中，加入25ml-80％乙醇60℃超声0.5h，重复上述操作一次，合并两次滤液，取1ml氮吹后，加入同等体积初始流动相复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，得到定量用待测样本溶液。依次进样并记录图谱，以各对照品的浓度x(μg/ml)作为横坐标，以各对照品峰面积为纵坐标，用加权(1/x²)最小二乘法进行回归计算，求得的线性回归方程与相关系数，结果见表4。

重复性试验：取同一钩吻样本，分别配制成6份定量用待测样本溶液，进样并记录图谱，按回归方程计算钩吻中钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊的含量，统计的得到样本中化合物的相对相对标准偏差rsd，见表6符合方法学验证要求，表明本发明的定量分析方法重复性良好。

稳定性试验：配制定量用待测样本溶液，于配制后的0、2、4、8、12和24h进样并记录图谱，计算统计的得到样本中化合物的相对相对标准偏差rsd，见表4，结果表明，待测样本溶液在24h内稳定。

表3各对照样本的线性回归方程和相关系数

表4钩吻样品的线性回归方程、相关系数、重复性、稳定性和化合物含量

由表3和表4可以看出，各个对照样本和样本中化合物在本发明定量分析方法条件下均呈现良好的线性关系。

精密度试验，精密量取100μg/ml定量用对照样本溶液稀释至0.1μg/ml和0.01μg/ml，重复六次进样，并连续三天，统计钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊甲峰面积的日内和日间相对相对标准偏差rsd，如表5所示。

表5各对照品的日内和日间相对相对标准偏差rsd

由表5可以看出，各个对照样本在本发明定量分析方法条件下均相对标准偏差rsd符合方法学验证要求，表明仪器的精密度良好。

表6各对照品化合物的的含量

钩吻中化合物的含量测定：表4中钩吻中化合物的含量为相对定量分析方法建立的线性方法测得的含量，mg/g为每1g钩吻样品中化合物的相对含量。表6中为4种对照品建立的线性方程测得的化合物含量。

m＝c*v；

v：为稀释倍数50，为三个样品峰面积平均值，x、b:为线性方程系数。

由表4和表6均可以看出，钩吻中4种生物碱的含量顺序为钩吻素子＞钩吻素甲＞钩吻素己＞钩吻素戊。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

本发明的技术方案实现了在无足够标准样本的情况下实现了钩吻中有效成分的多成分分析相对定量分析，本方法结合了前期q-tof对钩吻中化合物的鉴定结果，用对照品为钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊对高效液相色谱三重四级杆质谱仪的基本仪器参数进行了优化，在固定仪器参数的条件下，改变每个化合物的碰撞能量，把其它在q-tof鉴定的化合物通过母离子与丰度比高的子离子进行化合物特异性优化，确定46中化合物的多重反应检测(mrm)的离子对，并其方法学进行了考察与验证，建立了每个化合物响应值与钩吻质量的标准曲线。在此条件下，可同时检测钩吻中46中化合物，并对其含量进行了相对定量分析。

本发明申请技术方案采用hplc-qqq-ms/ms(高效液相色谱串联三重四级杆质谱)联用技术具有较高的灵敏度和专属性，且不需要达到色谱峰的完全分离，可对钩吻中多种化合物准确快速地定量。本发明可对钩吻中有效成分进行多成分分析相对定量分析，有利于对钩吻中药效物质的基础研究，同时，也为提高钩吻的质量标准、有效监控以此为原料的中成药产品质量提供了科学依据。本发明完善了钩吻质量评价体系，多成分分析相对定量分析方法稳定可靠、灵敏准确，检测周期短，且样品前处理简单，可用于实际生产中钩吻及其衍生物的质量监控。

附图说明

【图1】为对照品的结构式，其中a为钩吻素甲、b为钩吻素子、c为钩吻素己、d为钩吻碱戊。

【图2】为定量分析专属性试验的多重离子反应监测色谱图，其中相应化合物为1-46。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求保护的范围。

实施例1：

同时检测钩吻中46种化合物的相对定量分析方法，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为watersc18色谱柱，流动相a为5mm乙酸铵(ph＝5.2)，流动相b为乙腈，流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量5μl进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：0-2min内，流动相a和流动相b的体积比为90：10，2-7min，流动相a和流动相b的体积比为90:10匀速变至85:15；7-20min内，流动相a和流动相b的体积比为85:15，20-30min内，流动相a和流动相b的体积比由85:15匀速变至10:90，30-33min内，流动相a和流动相b的体积比为10:90，33.01-40min，流动相a和b的体积比为90:10；

所述质谱条件为：离子源为esi离子源，检测方式为正离子检测，扫描方式为

多重反应监测，脱溶剂温度为335℃，毛细管电压为3000v，喷雾器压力为40psi，去溶剂气体为n2，n2流速为12l/min；

溶液配制：

定量对照品溶液，分别取钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊对照品粉末适量于7个10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成一定浓度的定量用对照品储备液；分别精密量取上述7个定量对照品储备液适量于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1ml含钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊均为100μg/ml，再按倍数逐级稀释。

定量用待测样本溶液：精密称定钩吻粉末1g，至50ml烧杯中，加入25ml-80％乙醇60℃超声0.5h，重复上述操作一次，合并两次滤液，取1ml氮吹后，加入同等体积初始流动相复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液得到定量用待测样本溶液。

具体步骤为：

分别配制定量用对照品溶液和定量用待测样本溶液并进样，按回归方程计算待测样本中有效成分的含量，其中，待测样本为钩吻全草，对照品为钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊。检测结果见上述表5，钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和钩吻碱戊的含量分别为0.23、0.24、0.15、0.06mg/g。

实施例2

同时检测钩吻中46种化合物的相对定量分析方法，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为watersc18色谱柱，流动相a为5mm乙酸铵(ph＝5.2)，流动相b为乙腈，流速为0.4ml/min，柱温为25℃，进样量7μl，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序同案例1；

所述质谱条件同实施例1。

溶液配制同实施例1。

具体步骤同实施例1。

实施例3

同时检测钩吻中46种化合物的相对定量分析方法，采用高效液相色谱三重四级杆质谱仪检测，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为watersc18色谱柱，流动相a为5mm乙酸铵(ph＝5.2)，流动相b为乙腈，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样量10μl，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序同案例2；

所述质谱条件同实施例1。

溶液配制同实施例2。

具体步骤同实施例2。