本发明属于烟草工业技术领域，更具体地说，涉及一种烟草及烟草制品水提液中氨基态氮含量的测定方法。
背景技术：
烟草作为一种特殊的经济作物，其经济价值和使用价值在某种意义上取决于烟草的品质特征。烟草品质特征由烟草的化学成分决定，烟草中氨基化合物与羰基化合物之间的非酶参与的棕色化反应(又称美拉德反应)产物是影响烟气香味的一类重要物质。烟叶中的氨基酸与还原糖直接作用，首先形成amadori化合物或海因式化合物，进而发生一系列的降解、缩合反应，形成多种有香味的羰基化合物和呋喃、吡喃、吡咯、吡嗪等杂环化合物，这些物质可以改进烟草的香味。
在卷烟生产过程中会产生大量的废弃烟末，废弃烟末的特征风味和烟叶相似，还含有大量的美拉德反应所需的还原糖，通过美拉德反应技术实现废弃烟末的再利用，可减少非烟草来源的香味物质的应用，降低生产成本并提高卷烟品质。
烟梗是烤烟打叶复烤的副产物，通常在卷烟中作为膨胀梗丝、梗片、颗粒梗等填充料的原料，在再造烟叶中主要提供纤维以及部分涂布用的片基料。由于烟梗提取物直接使用会带来点刺、辛辣、发苦、热辣等抽吸方面的不足，同时木质杂气突出，烟草本香略显单薄，对烟叶薄片的品质有较大的影响，影响了其使用效果。为解决上述问题，也可以通过美拉德反应来改善烟梗提取物的使用性能。
糖源与氮源物质是实现美拉德反应的物质基础。在美拉德反应过程中，通过检测烟末提取液或烟梗提取液中氮源(主要是氨基酸)的含量，可以实现对美拉德反应程度的监控。目前烟草行业内已有的检测氨基酸的方法为：《yc/t282-2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法》，该方法可以准确测定烟叶中21种游离氨基酸的准确浓度。不过，由于该方法需要特殊的氨基酸分析仪设备，并配置21种氨基酸的标准溶液，所以用此方法来测定烟草及烟草制品水提液中的氨基酸总量过于麻烦和复杂。此外，国家标准《gb5009.235-2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中规定了酱油、酱、黄豆酱中氨基酸态氮的测定方法，包括酸度计法和比色法。该方法未提及可用于烟草及烟草制品中氨基态氮的测定。此外，该国标中的酸度计法需要对每一个样品进行两次的准确滴定，较难实现批量操作。该国标中的比色法在待测样品稀释后与显色液进行反应后进行比色检测，但是由于烟梗或烟末提取液本身颜色很深且其中氨基态氮的含量本来就不高，如果进行如国标方法的大量稀释，很有可能因为浓度太低检测不到。
技术实现要素：
为了弥补现有技术中所存在的不足，针对烟草及烟草制品水提液本身色素含量高且氨基态氮含量偏低的特点，本发明公开一种利用固相萃取-比色法测定烟草及烟草制品水提液中氨基态氮含量的方法。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种烟草及烟草制品水提液中氨基态氮含量的测定方法，包括以下步骤：
步骤1，水提液预处理，将烟草及烟草制品水提液过滤，适当稀释，得到预处理后的水提液；
步骤2，固相萃取，将步骤1得到的预处理后的水提液通过固相萃取柱萃取后，得到试样溶液；
步骤3，显色反应，吸取一定量的步骤2所得的试样溶液置于比色管中，进行显色反应，得到待测样品；
步骤4，比色法检测，将待测样品移入比色杯内，以空白样品为参比，于一定波长处测量吸光度值，将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，得到待测样品中氨基态氮的含量。
优选地，上述的烟草及烟草制品水提液中氨基态氮含量的测定方法，包括以下步骤：
步骤1，取3ml～5ml烟草及烟草制品水提液过滤，稀释2～10倍，得到预处理后的水提液；
步骤2，将固相萃取柱预先依次用甲醇和水活化，将2ml～4ml预处理后的水提液在活化后的固相萃取柱上过柱，收集穿透液，再用2ml～4ml水洗脱，收集洗脱液，与穿透液合并后，得到试样溶液；
步骤3，吸取0.5ml～2ml试样溶液置于10ml比色管中，加入4ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后加热，取出冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到待测样品；
步骤4，将待测样品移入1cm比色杯内，以空白样品为参比，于一定波长处测量吸光度值；
步骤5，将不同体积、相同浓度的氨氮标准溶液按照步骤3和步骤4依次进行处理，得到相应的吸光度值，绘制标准曲线并得到线性回归方程，将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，计算得到待测样品中氨基态氮的含量。
更进一步地，所述步骤2中的固相萃取柱为石墨化炭黑柱。
更进一步地，所述步骤3中的乙酸钠-乙酸缓冲溶液的浓度为1mol/l，ph为4.8。
更进一步地，所述步骤3中的显色剂为甲醛和乙酰丙酮的混合水溶液。
更进一步地，所述步骤4中的测量吸光度值的波长处为400nm。
更进一步地，所述步骤3的加热条件为100℃水浴加热，加热时间为15min。
更进一步地，所述步骤5中的氨氮标准溶液的浓度为100ppm，体积为0～1ml。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：本测定方法在国标方法的基础上，针对烟草及烟草制品水提液的特点，增加了水提液的固相萃取脱色处理步骤，实现了烟草及烟草制品水提液中氨基态氮的测定。该测定方法可以实现批量检测，操作简单，结果准确。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
烟梗提取液离心取上清，再用定性滤纸过滤，取3ml过滤液，稀释5倍。将石墨炭黑固相萃取柱预先分别用1～2个柱体积的甲醇、水依次活化，取2ml预处理后的烟梗水提液在活化后的固相萃取柱上过柱，收集穿透液，再用2ml水洗脱，收集洗脱液，与穿透液合并后定容到5ml(定容的目的是便于计算)，得到试样溶液。
吸取1ml试样溶液置于10ml比色管中，加入4ml浓度为1mol/l，ph为4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到待测样品。
分别吸取0ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml浓度为100ppm的氨氮标准溶液(相当于0μg、25μg、50μg、75μg和100μg氮)置于10ml比色管中，加入4ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到一系列标准样品。其中，显色剂为甲醛和乙酰丙酮的混合水溶液，它在ph4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与氨基态氮反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶氨基酸衍生物，在400nm波长下有吸收。
将待测样品和标准样品分别移入1cm比色杯内，以空白样品为参比，于波长400nm处测量吸光度值。根据一系列标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，计算线性回归方程。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，计算待测样品中氨基态氮的含量，再根据待测样品相较于烟梗提取液的稀释倍数以及烟梗提取液的质量进行换算，计算出烟梗提取液中氨基态氮的含量。
扣除空白样品的吸光度值，根据上述标准溶液的吸光度值作标准工作曲线，得到线性回归方程为y＝17.532x-126，r2＝1。其中，x为氮质量，单位为μg；y为吸光度值。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，待测样品中的氨基态氮的质量为49.9μg，换算成烟梗提取液中氨基态氮的含量为0.051％。
实施例2
烟末提取液离心取上清，再用定性滤纸过滤，取4ml过滤液，稀释10倍。将石墨炭黑固相萃取柱预先依次用1～2个柱体积的甲醇、水活化，取4ml预处理后的烟末水提液在活化后的固相萃取柱上过柱，收集穿透液，再用4ml水洗脱，收集洗脱液，与穿透液合并后定容到10ml，得到试样溶液。
吸取2ml试样溶液置于10ml比色管中，加入4ml1mol/lph4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到待测样品。
分别吸取0ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml浓度为100ppm的氨氮标准溶液(相当于0μg、25μg、50μg、75μg和100μg氮)置于10ml比色管中，加入4ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到一系列标准样品。
将待测样品和标准样品分别移入1cm比色杯内，以空白样品为参比，于波长400nm处测量吸光度值。根据一系列标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，计算线性回归方程。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，计算待测样品中氨基态氮的含量，再根据待测样品相较于烟末提取液的稀释倍数以及烟末提取液的质量进行换算，计算出烟末提取液中氨基态氮的含量。
扣除空白样品的吸光度值，根据上述标准溶液的吸光度值作标准工作曲线，得到线性回归方程为y＝17.532x-126，r2＝1。其中，x为氮质量，单位为μg；y为吸光度值。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，待测样品中的氨基态氮的质量为49.0μg，换算成烟末提取液中氨基态氮的含量为0.050％。
实施例3
烟末提取液离心取上清，再用定性滤纸过滤，取5ml过滤液，稀释2倍。将石墨炭黑固相萃取柱预先依次用1～2个柱体积的甲醇、水活化，取2.5ml预处理后的烟末水提液在活化后的固相萃取柱上过柱，收集穿透液，再用2.5ml水洗脱，收集洗脱液，与穿透液合并后定容到5ml，得到试样溶液。
吸取0.5ml试样溶液置于10ml比色管中，加入4ml1mol/lph4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到待测样品。
分别吸取0ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml浓度为100ppm的氨氮标准溶液(相当于0μg、25μg、50μg、75μg和100μg氮)置于10ml比色管中，加入4ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液和4ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀后置于100℃水浴中加热15min，取出用水冷却至室温，0.45μm水性滤膜过滤，得到一系列标准样品。
将待测样品和标准样品分别移入1cm比色杯内，以空白样品为参比，于波长400nm处测量吸光度值。根据一系列标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，计算线性回归方程。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，计算待测样品中氨基态氮的含量，再根据待测样品相较于烟末提取液的稀释倍数以及烟末提取液的质量进行换算，计算出烟末提取液中氨基态氮的含量。
扣除空白样品的吸光度值，根据上述标准溶液的吸光度值作标准工作曲线，得到线性回归方程为y＝17.532x-126，r2＝1。其中，x为氮质量，单位为μg；y为吸光度值。将待测样品的吸光度值代入标准曲线的线性回归方程，待测样品中的氨基态氮的质量为76.5μg，换算成烟末提取液中氨基态氮的含量为0.050％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。