本发明涉及一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。
背景技术：
甲壳素(chitin)又名几丁质，是由n-乙酰-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖以β-1，4糖苷键形式连接而成的多糖。其广泛存在于甲壳动物虾、蟹及昆虫等的外壳，自然界中的低等植物菌类、藻类的细胞，高等植物的细胞壁等。甲壳素每年生物合成的量多达1000亿吨，其存量在自然界中仅次于纤维素。
壳聚糖(chitosan，cts)是线性氨基多糖甲壳素通过脱乙酰反应生成的物质，其分子链上分布着许多氨基、羟基和脱乙酰基，其分子量从几十万到几百万不等，在水溶液中形成各种分子内和分子间氢键，且这些氢键使壳聚糖形成疏水微区，进而形成其双螺旋结构。壳聚糖在酸性溶液中，氨基吸附质子后形成带正电荷离子，可以与带负电荷的阴离子通过静电结合及疏水作用形成缔合物。壳聚糖的优良特性分别运用在医药学、保健食品、水处理、金属提取及回收等诸多行业中具有广泛的用途，尤其是保健食品方面的应用逐渐广泛，因此准确测定壳聚糖的含量对于研究和开发壳聚糖具有重要意义。目前，壳聚糖含量的测定方法有光谱法、电化学法、滴定法、色谱法等四类。
共振瑞利散射(resonancerayleighscattering，rrs)法是指当瑞利散射位于或者接近于其分子吸收带的时候，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次的散射，而这吸收-再散射过程称为共振瑞利散射，且其由于散射强度比单纯瑞利散射提高了几个数量级，因此不再遵循瑞利定律。共振瑞利散射法是近年来才发展起来的灵敏度高、操作简单的分子光谱分析方法。目前共振瑞利散射法已广泛应用于生物大分子的分析、无机物及药物分析、痕量无机离子的测定及纳米离子表征等方面的研究。本文将其法应用于糖类物质的分析，建立测定壳聚糖的共振瑞利散射新方法，并研究其反应适宜条件及其影响因素。
亮蓝(brilliantblue)是一种阴离子染料，在弱酸条件下，带负电荷的亮蓝与带正电荷的壳聚糖发生离子缔合反应，其离子缔合物在345nm、445nm处产生两个新的特征峰，且在一定浓度范围内，散射强度与壳聚糖含量呈线性关系。根据此特性，建立一种抗干扰能力强的共振瑞利散射法，此方法适合测定用于保健品中壳聚糖含量的定量分析。
技术实现要素：
为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本发明利用一定条件下，亮蓝染料与壳聚糖结合，形成一种能使体系中的共振瑞利散射信号明显增强的离子缔合物，并在345nm和445nm处出现了两个特征峰。在选定条件下，壳聚糖浓度在0.005-1.8μg/ml范围内与共振瑞利散射强度有良好的线性关系，据此建立了一种测定壳聚糖含量的双波长共振瑞利散射法。本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好，抗干扰能力强和操作简便等优点。
一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制δi和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线
向10ml比色管中加入1.0ml一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0ml缓冲溶液，1.0ml浓度为1.0×10-3mol/l的亮蓝溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于f-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝345nm处体系的共振散射强度值i1，其中试剂空白在λ＝345nm处体系的共振散射强度值i01，并计算δi1＝i1-i01；同时记录含壳聚糖的各检测体系在次大共振瑞利散射波长λ＝445nm处共振瑞利散射强度i2和空白试剂的共振瑞利散射强度i02，计算共振瑞利散射强度差值δi2＝i2-i02，其中δi＝δi1+δi2。建立δi与低分子壳聚糖浓度的标准曲线c1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立δi与中分子壳聚糖浓度的标准曲线c2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立δi与高分子壳聚糖浓度的标准曲线c3；
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响。
2)10μg/ml的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100ml容量瓶中，用0.5mol/l冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制δi和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的δi和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1ml，按步骤1)检测方法进行测定，在波长345nm和445nm处测定其共振瑞利散射强度差值δi1和δi2，并计算δi＝δi1+δi2，将δi代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
如上所述的一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，所述缓冲液为b-r缓冲溶液、hac-naac缓冲溶液、甘氨酸-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的一种；申请人通过实验发现，缓冲溶液的酸度对该反应体系有着显著的影响，在ph＝3.0时散射值较大；并且体系在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中灵敏度最高，散射值最大，故最佳缓冲溶液选择为ph＝3.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。
如上所述的一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1中试剂的加入顺序为首先加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，其次加入亮蓝溶液，再次加入十二烷基硫酸钠阴离子表面活性剂溶液，最后加入壳聚糖溶液。
如上所述的一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1)中壳聚糖的浓度范围是0.005-1.8μg/ml。
样品前处理：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100ml容量瓶中，用0.5mol/l冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液。
取样品工作液1ml，按步骤1)检测方法进行测定，在波长345nm和445nm处测定其共振瑞利散射强度差值δi1和δi2，并计算δi＝δi1+δi2，将δi代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
试验例：
1.亮蓝-壳聚糖体系的共振瑞利散射图谱
按照实验方法配制溶液后，于f-2500型荧光分光光度计上同步扫描共振瑞利散射图谱(如图1)。图1为亮蓝溶液-缓冲溶液的空白管以及不同壳聚糖的量与亮蓝缔合物的共振瑞利散射光谱，结果表明：亮蓝溶液与缓冲溶液在测定条件下共振瑞利散射信号较弱(曲线0ml)；当亮蓝-缓冲溶液体系中加入壳聚糖后(酸性条件下)，产生一个新的具有两个明显散射峰(345nm、445nm)的共振瑞利散射光谱，从光谱看，其共振瑞利散射强度随着壳聚糖浓度的增加而增强，且在一定质量浓度范围内呈线性关系；光谱上有两个峰，且每个峰值呈线性递增，但采用双波长能使r2更好，因此本文实验结果均为双波长测定。
2.不同缓冲溶液及缓冲溶液的ph对于体系共振瑞利散射强度的影响
先在ph2-6范围测定体系的δi，从图2可知，δi出现先升后降趋势，在2.5-3.5之间有峰值，因此确定ph值为3.0。
分别实验了b-r缓冲溶液、hac-naac缓冲溶液、甘氨酸-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液对亮蓝-壳聚糖体系的影响。结果如图3，结果表明在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中强度更高，故选用ph3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液控制体系的酸度，最佳用量为1.0ml。
3.亮蓝浓度及其加入量对于体系共振瑞利散射强度的影响
考察了亮蓝浓度及其加入量对体系影响，设定亮蓝浓度为2×10-4mol/ml；加入量(ml)为：0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，结果如图4，结果显示δi不断上升，因此考虑加大亮蓝的浓度为8×10-4mol/ml，加入量(ml)为：0.5、1、1.5、2、2.5、3，结果显示在1.5ml时δi有峰值，当亮蓝浓度为1×10-3mol/l，加入量为1ml时体系的δi达到最大，因此选择1ml1.0×10-3mol/l亮蓝溶液，以获得较高的灵敏度。
缓冲溶液对亮蓝-壳聚糖体系的影响。结果表明在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中强度更高，故选用ph3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液控制体系的酸度，最佳用量为1.0ml。
4.试剂加入顺序对于体系共振瑞利散射强度的影响
实验了3种不同的试剂加入顺序对反应体系的影响，实验结果如图5，最佳顺序为壳聚糖-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液-亮蓝溶液，但由于其线性差，而柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液-亮蓝溶液-壳聚糖的加入顺序与壳聚糖-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液-亮蓝溶液的加入顺序δi相差不大，且线性比前者更优，因此选定加入顺序为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液-亮蓝溶液-壳聚糖。
5.反应温度对于体系共振瑞利散射强度的影响
在不同温度下考察其对体系的影响，在实验过程中，加热后的体系并无颜色变化，共振瑞利散射强度如图6所示，在40℃的时候δi最高，然而40℃下，标准曲线的线性关系较差，其斜率与常温下相差不大，因此体系选定在常温下测定即可。
6.稳定时间对于体系共振瑞利散射强度的影响
在室温条件下，探讨了240min内该体系的稳定性，结果如图7，结果表明亮蓝溶液与壳聚糖反应在45min内δi相对稳定，45min开始后δi呈现急剧下降的趋势。因此，实验应在45min内测定完毕。
7.离子强度的影响
通过配制不同nacl溶液，加入体系当中，观察体系允许的离子强度，结果如图8，从图8可以看出，壳聚糖-亮蓝体系在离子强度少于0.01mol/l时，体系较为稳定；大于0.01mol/l时，浓度越高影响越大。
8.抗干扰实验
考察了20种物质对本方法的干扰情况，当壳聚糖浓度为1μg/ml，相对误差≤±5％时，共存物质的允许倍数见表1。
表1共存物质的影响
从表1看出，铁、铜、钙、铝对提醒影响大，需要用掩蔽剂掩蔽，10倍、铝可以用0.01mol/ledta掩蔽剂掩蔽，而10倍钙离子则用1ml100μg/ml和0.4％酒石酸掩蔽，在测定样品前加入两种掩蔽剂减少其测定过程中产生的误差。
9.不同的脱乙酰度对体系的影响
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同脱乙酰度的壳聚糖的测定结果差异。分别考察了脱乙酰度为85％和90％其分子量为60的壳聚糖。结果如图9，经过统计学分析，不同脱乙酰度的壳聚糖结果不存在显著差异性，即不同脱乙酰度的壳聚糖对体系没有影响。
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)线性好、检出限低：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的δi，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度0.005-1.8μg/mll范围内与δi存在良好的线性关系，线性范围宽，检出限为5.48×10-2μg/ml。
2)建立了一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，抗干扰能力强，重现性好和操作简便等优点。
附图说明
图1亮蓝-壳聚糖体系的共振瑞利散射图谱。
图2缓冲溶液ph值对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图3不同缓冲溶液对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图4亮蓝加入量对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图5试剂加入顺序对体系共振瑞利散射强度影响图。
图6反应温度对体系共振瑞利散射强度影响图。
图7稳定时间对体系共振瑞利散射强度影响图。
图8离子强度对体系共振瑞利散射强度影响图。
图9壳聚糖脱乙酰度对体系共振瑞利散射强度影响图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例
一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制δi和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线
向10ml比色管中加入1.0ml一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mlph＝3.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，1.0ml浓度为1.0×10-3mol/l的亮蓝溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于f-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝345nm处体系的共振散射强度值i1，其中试剂空白在λ＝345nm处体系的共振散射强度值i01，并计算δi1＝i1-i01；同时记录含壳聚糖的各检测体系在次大共振瑞利散射波长λ＝445nm处共振瑞利散射强度i2和空白试剂的共振瑞利散射强度i02，计算共振瑞利散射强度差值δi2＝i2-i02，其中δi＝δi1+δi2。建立δi与低分子壳聚糖浓度的标准曲线c1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立δi与中分子壳聚糖浓度的标准曲线c2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立δi与高分子壳聚糖浓度的标准曲线c3。
表2不同分子量的壳聚糖结果
2)10μg/ml的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100ml容量瓶中，用0.5mol/l冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5ml于100ml容量瓶，定容，得浓度为10μg/ml的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制δi和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的δi和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是δi＝2014.20c+30.05，相关系数0.9958，结果与中分子量的壳聚糖标准曲线接近，采用中分子量壳聚糖的标准曲线作为定量标准曲线。
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1ml，按步骤1)检测方法进行测定，在波长345nm和445nm处测定其共振瑞利散射强度差值δi1和δi2，并计算δi＝δi1+δi2，将δi代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
取样品工作液1ml，按实验方法进行测定，在波长345nm和445nm处测定其共振瑞利散射强度差值δi1和δi2，并计算δi＝δi1+δi2，将δi代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。结果为：海宝壳聚糖胶囊中壳聚糖的含量为251.4mg/g，rsd为1.1％。加标回收率见表3。
表3壳聚糖的加标回收率
在实验中，于10ml的比色管依次加入1.0mlph＝3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，1.0ml浓度为1.0×10-3mol/l的亮蓝溶液，1.0ml浓度为10μg/ml的壳聚糖溶液，用蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀后室温静置10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于f-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，于45min内测定完成。分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝345nm处体系的共振散射强度值i1，其中试剂空白在λ＝345nm处体系的共振散射强度值i01，并计算δi1＝i1-i01；同时记录含壳聚糖的各检测体系在次大共振瑞利散射波长λ＝445nm处共振瑞利散射强度i2和空白试剂的共振瑞利散射强度i02，计算共振瑞利散射强度差值δi2＝i2-i02，其中δi＝δi1+δi2。。壳聚糖在浓度0.005-1.8μg/ml范围内与δi存在良好的线性关系，线性范围宽，检出限为5.48×10-2μg/ml。本发明建立了一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，抗干扰能力强，重现性好和操作简便等优点。
线性范围和检出限
在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖相应的δi，以δi对壳聚糖浓度绘制工作曲线，壳聚糖质量浓度在0.005-1.8μg/ml范围内与δi呈良好的线性关系，线性回归方程为y＝2014.20x+30.05，相关系数r2为0.9958。按实验方法平行测定空白和最低管测定各13次，根据cl＝3s/k(s为标准偏差，k为回归方程的斜率)求得检出限为5.48×10-2μg/ml。