使用至少两种抗原检测样品中分枝杆菌物质存在的方法与流程

绪论

结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)是分枝杆菌科中一种致病细菌物种并且是大多数结核病(tb)的致病因子。

在许多中低收入国家，tb仍然是主要的致死原因之一。此外，报道了越来越多的多药抗性tb病例。

因此，一种可靠而快速的结核病诊断方法至关重要。

虽然已经开发了几种诊断结核病的方法，但是所有方法都有其缺点。

仅仅基于迹象和症状来诊断结核病是困难的，正如在免疫抑制的人中诊断疾病一样。tb皮肤测试(也称为mantoux结核菌素皮肤测试)，tb血液检测(也称为干扰素-γ释放试验或igra)，和胸部放射线检查(x射线)，以及对唾液涂片上抗酸杆菌(afb)存在的检测在几天内指示一些感染个体。

唾液涂片显微镜检测(也称为涂片测试)是在大多数tb病例发生的中低收入国家诊断肺结核的常用方法。虽然它是用于很高结核病患病率地区的一种简单、快速和廉价的技术，但是其性能存在很大的局限性。例如，当细菌载量小于10,000个结核分枝杆菌生物体/ml唾液样品时，灵敏度受到严重影响。因此，在涂片测试中检测呈阳性的人(涂片阳性的人)具有非常高的细菌载量，并且将因此处于tb的非常晚期阶段。在涂片阳性的人中，该人患有疾病通常是一目了然的。在如此晚期的阶段，通常不再可能成功治疗。另一方面，如果一个人在涂片测试中呈阴性(涂片阴性的人)，则不能得出结论，因为该人可能患有在较早期阶段的tb，而其与较低的细菌载量相关。在涂片阴性的人中，该人患有疾病通常并非一目了然的。此外，涂片测试在肺外结核、小儿结核病和共同感染hiv和结核病的患者中得到不佳的结果。

感染结核分枝杆菌的人或动物通常产生针对分枝杆菌的抗体。在取自感染个体的样品中存在这些抗体表明感染。最常见的分枝杆菌特异性抗原是分枝菌酸或其衍生物。例如，wo2005/116654和wo2013/186679描述了通过检测抗体与固定的分枝菌酸抗原的结合，样品中针对分枝菌酸的抗体的方法，用于诊断活性结核病。

发明人已经在源自健康对象的样品中观察到，当用作抗原的唯一类型时，这些样品中包含的物质与固定的分枝菌酸抗原高度结合，这表明源自健康对象的样品包含与分枝菌酸抗原结合的物质，但其不是结核病的指示。这可能会导致假阳性结果。因此，在对象确实患有结核病的情况下，出现的问题是，如果在检测测试中不是结核病指示的物质与固定的分枝菌酸抗原结合，将会产生高背景结合信号。这种高背景信号可能会掩盖来自结核病的实际标志物的信号。所以，还存在假阴性结果的风险。因此，发明人认为在结核病检测的灵敏度方面存在改进的空间。

因此，本发明旨在克服来自并非结核病指示的物质与固定的分枝菌酸抗原结合的问题并提高结核病检测的灵敏度和可靠性。

技术实现要素：

本发明的目标已经通过提供检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的存在实现，所述方法包括以下步骤：提供来自人或动物的样品；和检测所述样品中抗体与至少两种类型的固定的抗原的结合，所述抗原能够结合指示人或动物中分枝杆菌物质存在的抗体，所述至少两种类型的固定的抗原选自下述：

a)分枝菌酸源性抗原，任选地用一个或多个能够固定于所述固体基质的官能团修饰，

b)二酰基糖脂抗原；以下述式(i)表示

其中：

r²和r³，相同或不同，独立地选自h、so³h、so^3-或so^3-/m⁺，其中m⁺是阳离子；和

r^2’和r^3’，相同或不同，是酰基，

其中，式(i)表示的所述抗原是任选地用一个或多个能够固定于所述固体基质的官能团修饰的，和其对映异构体、非对映异构体及混合物；和

c)一种结核基(tuberculosinyl)腺苷抗原；以下述式(ii)表示：

其中，在式(i)中，r¹是h或式(iii)的基团，

r²不存在或是式(iii)的基团，前提是r¹和r²中的一个是式(iii)的基团，

r³和r⁴独立地选自氢，oh，羧酸基或酰基，其任意组合，其中所述结核基腺苷抗原是任选地用一个或多个能够固定于固体基质的官能团修饰的，和所述抗原的对映异构体，非对映异构体及其混合物。

本发明的第二方面涉及固体基质，其包含固定于所述基质如上相对于本发明第一方面所限定的结核基腺苷抗原、二酰基糖脂抗原和分枝菌酸源性抗原类型中的2个或更多个的组合。

本发明的第三方面涉及生物传感器，如上相对于本发明第一方面所限定的结核基腺苷抗原、二酰基糖脂抗原和分枝菌酸源性抗原中的2个或多个的组合。

附图说明

图1显示了使用固定于elisa板的分枝菌酸的elisa结果图表(igm作为二抗)。

图2显示了使用固定于elisa板的结核基腺苷抗原的elisa结果的图表(igm作为二抗)。

图3显示了使用固定于elisa板的二酰基糖脂抗原的elisa结果的图表(igm作为二抗)。

图4显示了使用固定于elisa板的根据式(xiii)的二酰基糖脂抗原的elisa结果的图表。

发明详述

本发明是基于将来自人或动物的样品暴露于至少两种类型的固定的抗原的观测，所述抗原能够结合指示人或动物中分枝杆菌抗体存在的抗体并且选自下述：

a)分枝菌酸源性抗原，

b)二酰基糖脂抗原；和

c)结核基腺苷抗原；如上所定义，并且检测所述样品中抗体与所述抗原的结合，导致结核病检测的可靠性和灵敏度改善。

本申请中提及的分枝菌酸源性抗原可以源自分枝杆菌，所述分枝杆菌选自毒性和致病性分枝杆菌。术语分枝菌酸源性抗原将理解为这样的化合物，其包含能够结合抗-分枝菌酸抗体的分枝菌酸残基。优选地，分枝菌酸抗原源自结核分枝杆菌。所述分枝菌酸源性抗原可以选自下述的至少一种：分枝菌酸，索状因子，化学修饰的分枝菌酸，化学修饰的索状因子，合成的分枝菌酸衍生物，合成的索状因子衍生物。

分枝菌酸源性抗原可适当选自下述的一种或多种：获自天然来源的分枝菌酸，合成制备的分枝菌酸，含硫的分枝菌酸，分枝菌酸的结构类似物和分枝菌酸蜡酯。分枝菌酸源性抗原还包括这些衍生物的盐和/或酯。

分枝菌酸衍生物的天然来源包括分枝杆菌如结合分枝杆菌的细胞壁，包括不同类别的化合物和不同的分枝菌酸同系物的混合物，通常作为它们与细胞壁结合的衍生物。

可以优选使用合成制备的分枝菌酸，因为其可以精确地确定所使用的特定衍生物是什么和其使用量。这有利于获得高基质选择性。

因此，为了能够提供具有高可靠性和可重复性结果的检测，优选使用半合成的或甚至更优选合成的分枝菌酸衍生物，其与天然混合物中发现的单一化合物相同或密切相似。

也可以使用分枝菌酸衍生物的酯，例如醇的酯(例如，一元醇和多元醇)和糖酯。糖酯是特别优选的。糖酯包括与单糖、二糖或寡糖的酯。所述糖类可以方便地包括基于己糖和/或戊糖的糖单元。葡萄糖酯是这些酯的合适示例。其他合适的糖酯是海藻糖酯，包括海藻糖单分枝菌酸酯(monomycolate)和海藻糖二分枝菌酸酯(dimycolate)。例如，作为海藻糖单分枝菌酸酯和海藻糖二分枝菌酸酯的索状因子是众所周知的合适的糖酯的示例。这些化合物在自然界中以这样的复杂混合物出现，所述复杂混合物为不同类型的分枝菌酸和各类型内不同的同系物的混合物。

因为难以确定天然产物中存在的索状因子的身份并分离各个分子种类，出于本发明的目的，优选使用半合成或更优选合成的分枝菌酸衍生物。此外，已知的是，分枝菌酸单元的结构影响索状因子的生物活性。合适的半合成的衍生物包括半合成的索状因子，其可以通过将分枝菌酸连接到糖基上来制备。然而，这些半合成的因子仍含有不同同系物的混合物。因此，用于本发明上下文的特别合适的分枝菌酸衍生物是合成的索状因子，例如wo2010/08667中所述合成的索状因子，即式(m)x(s)y(m')z的化合物，其中x为1至6，y为1至12，z为0至10，各m和各m'独立地为分枝菌酸残基，其包括β-羟基酸部分，并且各s为单糖单元。

也可以使用分枝菌酸衍生物的盐，例如铵盐，或碱金属和碱土金属盐。

也可以使用含硫的分枝菌酸和/或其酯或盐。这些化合物是含硫的天然分枝菌酸化合物的类似物。

分枝菌酸蜡酯包括环丙基或烯烃和内酯基，并且可以分离自天然来源或合成制备。

用于本发明检测方法的合适化合物述于wo2016/024116中。

分枝菌酸抗原可以是选自同源和异源化合物混合物的形式。例如，分枝菌酸源性抗原可与磷脂如磷脂酰胆碱联用。

虽然分枝菌酸的使用涉及假阳性/阴性信号的风险，但是检测样品中抗体与上述所限定的一个或两个其他类型的抗原组合的分枝菌酸源性抗原的结合提供了人是否感染结核病的其他指示。这进一步增强了本发明方法的可靠性。

本申请中,术语“二酰基糖脂抗原”指如下述结构(i)和(iv)-(xiii)中所限定的二酰化海藻糖结构。

发明人已经惊奇地发现，如果这些固定的二酰基糖脂抗原作为根据本发明的至少两种类型的抗原之一使用，检测到抗体与这些抗原非常高的结核病特异性结合。相比使用固定的分枝菌抗原时，源自结核病实际标志物的信号显著较少地被背景信号所掩盖，因此源自结核病实际标志物的信号变得更加明显。这样，发明在结核病标志物检测的灵敏度方面提供了显著的改进。

此外，在该方面中，注意的是，当根据本发明所述固定的二酰基糖脂抗原用于检测结核病的标志物的方法中时，检测到抗体对这些抗原非常高的结核病特异性结合，特别是在源自经测试涂片阴性的患者的样品中。这使得在早期阶段诊断结核病成为可能，其中存在比晚期阶段更高可能性的成功治疗。在本发明的固体基质上使用二酰基糖脂抗原使其有可能检测样品中低量的针对分枝杆菌物质的抗体。

当施用于源自共感染hiv和结核病的患者的样品时，本发明的固定的二酰基糖脂抗原表现非常好。

这些二酰基糖脂，实际上是二酰化海藻糖抗原，并且因此也可以称为二酰化海藻糖抗原或其衍生物，可以限定为由下式(i)表示的化合物，

其中：r²和r³，相同或不同，独立地选自h、so³h、so^3-或so^3-/m⁺，其中m⁺是阳离子，优选金属阳离子，如na⁺或k⁺；r^2’和r^3’，相同或不同，是酰基，其中所述抗原任选地用一个或多个能够固定于固体基质的官能团修饰。本文所述的二酰基糖脂还包括式(i)化合物的对映异构体、非对映异构体及其混合物。

在式(i)，r^2’和r^3’，相同或不同，可以是

其中，x独立地选自不饱和或饱和的直链或支链烃链，合适地是烷基，任选被一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰。

在式(i)优选的实施方式中，r²是so^3-、so³h或so^3-/m⁺，其中m⁺是阳离子，而r³是h。优选地是，在r²是so^3-/m⁺的情况下，阳离子是na⁺或k⁺。

在式(i)的另一优选实施方式中，r²和r³是h。

优选地是，式(i)的r^2’和r^3’之一中，x是饱和的直链烃链，任选地被一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰，并且其中在r^2’和r^3’中的另一个中，x是饱和的支链烃链，任选被一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰。在该方面，进一步优选地是，在式(i)中，r^2’和r³中的一个是下式(iv)表示的基团：

(iv)，

其中r⁴是具有式cnhn+1的直链饱和烃链，其中n是1至20之间的整数，任选地用一个或多个官能团修饰，并且其中y是1至10之间的整数，并且其中r⁵是h或oh，并且r^2’和r^3’中的另一个是具有式cnhn+1的直链饱和烃链，其中n是1至20之间的整数，任选地用一个或多个官能团修饰。优选地是，由r^2’和r^3’表示的酰基链相对较短。这使抗原更易溶于水溶液，因此更易于使用。由相对短的酰基链而导致的亲水性增加使得固定抗原的检测表面或传感器表面更亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，并将提高检测速度。并且，在使用合成抗原的情况下，更容易合成抗原。在该方面中，在根据式(i)具有短r^2’和r^3’酰基链的抗原中，r⁴可以具有式cnhn+1的直链饱和烃链，其中n是1至10之间的整数，诸如1至9之间，诸如1至8之间，诸如1至7之间，诸如1至6之间，诸如1至5之间，诸如1至4之间，诸如1至3之间，如1、2、3、4、5、6、7、8或9，任选地用一个或多个官能团修饰，并且其中y是1至10之间的整数，诸如1至5之间，诸如1至4之间，诸如1至3之间，如1、2、3、4或5，任选地用一个或多个官能团修饰。在该方面中，r^2’和r^3’中的另一个可以是具有式cnhn+1的直链饱和的烃链，其中n是1至15之间的整数，诸如1至14之间，诸如1至13之间，诸如1至12之间，诸如1至11之间，诸如1至10之间，诸如1至9之间，诸如1至8之间，诸如1至7之间，诸如1至6之间，诸如1至5之间，诸如1至4之间，诸如1至3之间，如介于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，任选地用一个或多个官能团修饰。在该方面中，例如，合适的抗原将是化合物(v)：

其中acs表示硫代乙酸酯基团(并且m⁺是阳离子或不存在)。该示例性分子用硫代乙酸酯基团修饰，以能够固定于固体基质，例如二氧化硅基质或金基质。具有硫醇基团的抗原可以直接固定在金上。对于二氧化硅基质，可适当地用硅烷活性基团涂覆基质，经修饰的抗原的硫醇可与该硅烷活性基团结合。在二酰基糖脂抗原存在于结核分枝杆菌的情况中，其可分离自结核分枝杆菌。或者，其可以被合成，例如，通过改进自ep1950218a1中所述的方法。如果抗原不存在于结核分枝杆菌，其可以由分离自结核分枝杆菌的抗原修饰或合成。

非常优选的是，其他抗原是存在于结核分枝杆菌中的二酰化磺基糖脂(ac2sgl)，任选地用一个或多个官能团修饰。在优选的实施方式中，所述ac2sgl是2-棕榈酰基-3-羟基结核烯酰(hydroxyphthioceranoyl)-2'-硫酸盐-α-α'-d-海藻糖或2-硬脂酰基-3-羟基结核烯酰-2'-硫酸盐-α-α'-d-海藻糖，任选地用一个或多个官能团修饰。ac2sgl分子的特征在于海藻糖2'-硫酸盐核心，并且在2-位置处经棕榈酸或硬脂酸残基以及在3-位置处经羟基结核烯酰二酰化，其具有不同长度和甲基取代基，例如化合物(vi)：

其中，r²是so^3-、so³h或so^3-/m⁺，其中，m⁺阳离子，优选金属阳离子，优选na⁺或k⁺。

其他示例由下述式vii、viii和ix表示。

其中，在式vii、viii和ix中，so^3-/na⁺部分还可以是so^3-、so³h，而na+还可以是另一个阳离子，如k⁺。

在进一步优选的实施方式中，如上所限定的二酰基糖脂抗原由式(x)表示：

r2’和r3’在式(x)中如上述式(i)所限定。优选地是，本文所述的酰基链中的一个或两个经修饰以能够固定于固体基质。特别优选使用式(xi)表示的化合物：

其中，酰基链中的一个或两个经修饰以能够固定于固体基质。式(xi)化合物的酰基链可取代为式(iv)中限定的任何链，并且链可以任选地经修饰以能够固定于固体基质。

合适的修饰包括在酰基链之一上纳入硫代基团或在酰基链之一的末端纳入不饱和键，例如，双键。

这类经修饰的分子的合适示例包括根据式(xii)的化合物，其在酰基链之一的末端具有烯基或在酰基链之一的末端具有硫醇基团的(xiii)。

式(xii)和(xiii)化合物的烷基链可取代为用上述烯烃或硫醇基团修饰的式cnhn+1或式(iv)的任何链。

二酰基糖脂抗原提供一种用于获得结核病标志物的高灵敏度检测的手段。在源自经测试涂片阴性的患者的样品的情况中，检测到抗体与这些抗原非常高的结核病特异性结合。这使得在早期阶段诊断结核病成为可能，其中相较于处于晚期阶段的tb，没有并发症的成功治疗的可能性更高。此外，当施用于源自共感染hiv和结核病的患者的样品时，这些特定抗原表现非常好。

在本申请中称之为结核基腺苷抗原是由下述式(ii)表示的化合物，

其中，在式(ii)中，r¹是h或式(iii)的基团，

r²不存在或是式(iii)的基团，前提是r¹和r²中的一个是式(iii)的基团，r³和r⁴独立地选自氢，oh，酰基链，包含酰基链的羧酸基，其任意组合，其中所述抗原是任选地用一个或多个能够固定于固体基质的官能团修饰的，和所述抗原的对映异构体，非对映异构体及其混合物。在该式中，优选地是，r⁴是oh，并且更加优选地是，r⁴和r³是oh。

在式(ii)中，r¹可以是式(iii)的基团，而r²可以不存在。在另一实施方式中，r¹可以是h，而r²可以是式(iii)的基团。在r²是式(iii)的基团的情况中，其所连接的氮带有正电荷。能够固定于固体基材的官能团优选包括在式(iii)的基团中。

在r³或r⁴是或包含酰基基团的情况中，优选地是，r³和r⁴中唯一的一个是或包括酰基基团，或特别是脂肪酸基团。酰基基团优选具有合适的长度和疏水性，以能够固定于固体基质。酰基链可以用官能团修饰，以能够固定于固体基质。酰基链可以是如wo2014/210327中所述的分枝菌酸链。

优选地是，如果式(ii)的抗原具有酰基链，那么酰基链相当短。这使抗原更易溶于水溶液，因此更易于使用。由相对短的烃链而导致的亲水性增加使得固定抗原的检测表面或传感器表面更亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，并将提高检测速度。并且，在使用合成抗原的情况下，更容易合成抗原。在这方面，在具有短酰基链的抗原中，酰基链可以是直链或支链c1-c20链，例如c5-c20链。

在一个优选的实施方式中，式(ii)的抗原由式(xiv)或(xv)的化合物表示，任选地用一个或多个能够固定于固体基质的官能团修饰。

优选地是，根据式(ii)的抗原选自：1-结核基腺苷(如在式(xiv)中)，1-结核基-2'-脱氧腺苷，1-结核基-o-乙酰基腺苷或其组合。这些化合物天然存在于结核分枝杆菌细菌中，并且可以从中分离出来。在这样的情况中，可以使用天然抗原，并且取决于其待固定的基质，如果需要，为了固定目的进行修饰。分枝杆菌中这些化合物的水平相对较低，例如远低于例如分枝菌酸的水平。因此，更有利的是化学合成这些分子，或在生产宿主微生物中合成它们，然后进行分离和任选的进一步纯化步骤。这节省了可观的成本。因此，优选这些化合物是合成的。

例如，根据式(ii)的合成抗原可以根据buter等,2016中所述方法合成。

发明人已经惊奇地发现，如果在用于检测结核病标志物的方法中使用如上所限定的结核基腺苷抗原，将检测到抗体对这些抗原非常高的结核病特异性结合。相比使用固定的分枝菌抗原时，源自结核病实际标志物的信号显著较少地被背景信号所掩盖，因此源自结核病实际标志物的信号变得更加明显。这样，发明在结核病标志物检测的灵敏度方面提供了显著的改进。发明人进一步发现，如果在用于检测结核病标志物的方法中将如上所限定的结核基腺苷抗原与能够结合这样抗体的其他类型的抗原联用，所述抗体指示人或动物中分枝杆菌物质的存在，那么将会提供样品来源的对象将具有活性结核病的更可靠指示。在这方面中，发明人已经观察到，一些其它类型的抗原如本文所述的其他抗原，尽管它们可以作为针对分枝杆菌物质的抗体存在的可靠标志物，但是可能无法区分活性结核感染(如涂片阴性，涂片阳性，hiv阳性/结核共感染，儿科和肺外患者)和非活动性结核感染(如在接种了卡介苗(bcg)的对象或从结核病感染中治愈的对象)。本发明人现已发现，如上所限定的针对结核基腺苷抗原的抗体在源自接种了bcg疫苗的对象或源自结核病感染治愈的对象的样品中补正被适当检测到。换言之，如果样品含有可测量的如上所限定的针对结核基腺苷抗原的抗体，这是活性结核病的指示。这使得可以在具有活性结核病的对象和其中感染无活性的对象之间区分结核病测试。

用于本发明的抗原可由结核分枝杆菌分离或可以合成，即通过完全化学合成或通过在不是分枝杆菌的生产宿主中合成获得，例如，通过转基因表达，例如，在大肠杆菌中，然后分离和任选的进一步纯化步骤。

在本发明方法的方法中，来自人或动物的一个或多个样品可以与来自经证实是健康的人或动物的样品和与来自经证实患有结核病的人或动物的样品进行比较。为了可靠性，非常优选的是，一次分析中所有样品都按照本发明方法的步骤进行相同的处理。至少结核基腺苷抗原和二酰基糖脂抗原对结核病特异性抗体的高特异性以及假阳性相关风险较低使其甚至可能在不需要从健康对象获得参照样品的情况下，可靠地诊断一个人是否有患有结核病。至少结核基腺苷抗原和二酰基糖脂抗原对结核病特异性抗体的高特异性以及假阳性相关风险较低使其可能在不需要将来自人或动物的样品分成两个样品分量的情况下，可靠地诊断一个人是否有患有结核病，所述两个样品分量中的一个在两个部分暴露于具有抗原的检测基质前暴露于抗原，诸如wo2005/116654或wo2013/186679中所述，其中分枝菌酸用作固定的抗原。因此，执行本发明的方法较不困难，并且产生快速且可靠的诊断。

在本发明的方法中，提供了来自人或动物的样品。通常，样品来自怀疑患有活动性结核病的人或动物，例如与患有结核病的人接触或居住于结核病高发区域或前往结核病高发区域的人或动物。

为了用于本发明的方法，可以使用在较早阶段收集的样品，储存直至在合适的条件下使用并在合适的时刻提供。或者，样品可以在现场用于本发明的检测方法，即作为护理点测试。

样品优选血液源性样品。样品可以是全血样品，血浆样品或血清样品。血清是没有凝血因子的血浆，优选作为血浆。因此，本申请中的血浆一词也可以指(血液)血清。血清是优选的，因为它含有比血浆更少的不同物质，这可能导致非特异性相互作用或不需要的生物活性。此外，血清可具有比血浆更低的粘度。因此，使用血清可以避免稀释样品的需要，这节省了时间和材料。

在样品是全血样品的情况下，优选将样品预过滤或分离成血浆或血清。对于这样的预过滤步骤合适的滤器是0,2微米的滤器。

大约55％的全血由血浆/血清组成。如果没有充分过滤全血样品或者如果患者的身体状况对其有需求，则可能需要稀释全血样品或血浆或血清。因此，本申请中的血浆或血清可以还指稀释的血浆或血清。因此，血液或血浆的稀释可以在本发明的方法中实施，例如5至10x稀释，10至20x稀释，20至50x稀释，50至100x稀释，250至5000x稀释，750至1250x稀释，诸如5x、10x、20x、50x、100x、200x、500x、4000x、2000x或1000x稀释。取决于样品的粘度，这种稀释可以在将血浆与血液步骤分离的步骤(过滤步骤或分离步骤)之前进行。或者，可以在过滤步骤之后进行稀释。

稀释可以用任何合适的稀释剂进行，例如，基于pbs的缓冲液，如封闭缓冲液。例如，这类缓冲液可以是含有生理ph值的水中的nacl、kcl、kh2po4、na2hpo4和edta的pbs/ae缓冲液。这类缓冲液可以是基于pbs的缓冲液，由每升包含1mmedta和0.025％(m/v)叠氮化钠的双蒸去离子水(调节至ph7.4)中8.0gnacl、0.2gkcl、0.2gkh2po4和1.05gna2hpo4组成。

全血样品或血浆或血清可以用防止血液凝固的试剂进一步稀释，例如edta，肝素或柠檬酸盐。

任选地，可以将低浓度的清洁剂添加到血液/血浆/血清中，以避免粘附所用测试系统的组件。

为了检测，将样品的至少部分暴露于携带固定的抗原的固体基质，即暴露于检测基质，并检测抗体与抗原的结合。

在本发明中使用的可能的抗原组合是包含或由2或3个如下的类型的抗原(如上所限定的分枝菌酸源性抗原、结核基腺苷抗原和二酰基糖脂抗原)组成的组合：

1)2种类型的抗原：

a)结核基腺苷抗原+分枝菌酸源性抗原。

b)二酰基糖脂抗原+分枝菌酸源性抗原。

c)结核基腺苷抗原+二酰基糖脂抗原。

在两个抗原组合的组合中，c是优选的，因为结核基腺苷抗原在提供样品来源的对象具有活性结核病的可靠指示方面表现特别好，而二酰基糖脂抗原在源自经测试的涂片阴性者的样品情况下表现特别好。这能够非常灵敏地检测结核病，无论患者中的细菌载量。此外，使用在暴露于来自怀疑患有结核病对象的样品时各自产生特定的输出的这些抗原能够提供关于对象性质和/或疾病状态的信息。

2)3种类型的抗原

d)二酰基糖脂抗原+分枝菌酸源性抗原+结核基腺苷抗原。

在该实施方式中，作为抗体存在的其他标志物，分枝菌酸源性抗原与二酰基糖脂抗原和结核基腺苷抗原组合使用。虽然分枝菌酸的使用涉及假阳性/阴性信号的风险的，但是检测样品中抗体与分枝菌酸源性抗原的结合提供了人是否感染结核病的其他指示。这进一步增强了本发明方法的可靠性。三种抗原的这种组合提供了检测结核病和确定结核病是否有活性的极好方法。

在优选的实施方式中，除了本申请所限定的抗原分枝菌酸源性类型抗原、结核基腺苷类型抗原和二酰基糖脂类型抗原，没有其他类型的抗原在该方法、固体基质和生物传感器中用作固定的抗原。

通过使用上述的组合，因为涂片阴性患者的高特异性，可以在早期阶段检测结核病，并且可以区分患有活性结核病的患者与患失活结核病感染的人，如接种bcg的人或治愈结核病感染的人。此外，使用在暴露于来自怀疑患有结核病对象的样品时各自产生特定的输出的多种抗原能够提供关于对象性质和/或疾病状态的信息。

在示例性实施方式中，在上述a-d的组合中，结核基腺苷抗原可以是1-结核基腺苷，分枝菌酸源性抗原可以是分枝菌酸，而二酰基糖脂抗原可以是根据式(xiii)的分子，其中这些分子的疏水性尾部可以经修饰，用于固定。

在样品暴露于多种抗原的情况下，可以同时检测抗体与不同类型抗原的结合，这是优选的。可以在暴露之前将样品分成子样品，各子样品专用于暴露特定类型的抗原。可以用携带多种类型抗原的一个或多个基质或各自携带特定类型抗原的多个基质进行同时检测，例如在包括不同隔室的生物反应器中，所述各隔室包含具有一类抗原的固体基质。第一类抗原和一种或多种其他类型的抗原可以固定于固体基质。这该方面中，本发明还涉及固体基质，其包含根据上述组合a-d中任一种的固定的抗原的组合。在本发明的方法中，也可以使用不同的固体基质进行一个检测试验，各自具有固定于其上的特定类型的抗原。

在该方面，优选地是样品的至少部分暴露于这样的固体基质，所述固体基质具有如上所述固定的抗原或多种类型的固定的抗原；然后检测抗体与固定于所述基质的抗原的结合。

抗体与固定的抗原的结合可以通过任何试验的方式检测，所述试验涉及测量基质上物质和/或质量(massonthesubstrate)的变化，折射率的变化，熵的变化，焓的变化，粘度变化，温度变化、颜色变化等。

检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以用任何合适的检测方法进行，包括简单的视觉检测或包括伏安、电流或任何电化学检测的方法。

检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以实时进行或通过终点试验进行。

在实时方法中，因为检测是实时进行的，所以在结合过程中直接检测抗体与固定在检测基质上的抗原的结合。为了检测，原则上，可以使用所有实时无标记分析技术。

合适的实时检测试验包括表面等离子体共振或电化学阻抗光谱，等温滴定量热法，生物层干涉亮度法，光学光栅，光子晶体，声共振概况，石英晶体微量天平。

在实时检测方法中，携带抗原的固体基质可以是基于二氧化硅的，例如基于二氧化硅的基质。在这样的实施方式中，抗原优选在一个或两个酰基链上用能够固定的官能团修饰。当使用环共振技术检测抗体与固定的抗原的结合时，基于二氧化硅的基质特别有用。优选地，使用基于si的环形谐振器的生物传感器芯片进行检测。这使得本发明的方法能够以非常紧凑的装置实现。

也有可能的是，固体基质是基于金的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗谱来检测抗体与固定的抗原的结合时，基于金的基质特别有用。

检测抗体和/或其他物质与检测基质上的抗原的结合可以在自动化装置中进行。本领域技术人员已知各种自动化装置，并且技术人员能够选择合适的软件装置来确定与检测基质结合的程度或范围。

检测抗体与检测基质上的抗原的结合可以通过终点试验进行。术语“终点试验”应理解为这样的试验，其中感兴趣的结果是固定的试验孵育期后的结果，与前述实时试验相反。例如，终点检测试验可以检测测试结束时颜色、荧光、吸光度或发光水平的变化。

合适的终点试验包括酶联免疫吸附试验(elisa)，western印迹，放射性标记测定法，光谱试验，免疫荧光，免疫沉淀，免疫细胞化学，免疫组织化学，安培或伏安检测试验或电化学阻抗光谱。

在终点试验的优选实施方案中，通过免疫金过滤试验进行检测。在这种试验中，检测基质是微孔膜，优选硝酸纤维素膜或pvdf膜，抗原固定于其上。

在终点试验中，抗体与抗原的相互作用可以使用与一抗重链结合的二抗进行，所述一抗与固定的抗原结合。许多合适的二抗市售可得。二抗可以与纳米颗粒或珠偶联，例如金珠，或与脂质体关联。二抗的示例可以是蛋白a或g，可能与能够检测的酶共轭。

特别合适的技术或检测抗体与检测基质上固定的抗原的结合是所谓的免疫金过滤试验(igfa)，特别是斑点免疫金过滤试验(digfa)。

免疫金过滤试验是将elisa和免疫金技术结合的方法，并且是允许其中待测定的样品过滤通过微孔膜的方法，优选硝酸纤维素膜过滤，并通过涂覆在膜上的捕获探针捕获。运行胶体金标记的探针以相同的方式过滤通过微孔膜。通过使用微孔膜作为捕获探针的运载体并且利用膜的毛细作用和渗透性，抗原和抗体可以容易地反应并且可以方便地进行任选的洗涤和/或阻断步骤。当胶体金标记的探针与捕获探针结合时，胶体金颗粒聚集并出现肉眼可见的红点。

在本发明的终点试验是免疫金过滤试验的情况中，抗原被固定于微孔膜，优选硝酸纤维素膜。在将抗原固定在微孔膜上之后，任选地，可以将预处理的样品施用于膜。在添加样品分量以及固定的抗原与膜上样品中包含的抗体反应后，可以将胶体金标记的二抗添加到膜上以在抗原-抗体反应位置具有金颗粒聚集。在聚集的情况中，形成可见的红色或褐色斑点。斑点的强度与抗原和抗体之间的反应量成比例，即与样品中抗体的量成比例。换言之，来自患有结核病的人的样品将产生比来自健康人的样品更强烈的斑点。

免疫金过滤试验是简单快速的检测方法，因为除了膜和试剂外不需要任何仪器，并且可以在几分钟内用肉眼观察结果。

在免疫金过滤试验中，微孔膜可以是例如具有合适孔径的pvdf膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜。优选使用硝化纤维素。合适的孔直径为0,2至5μm。

免疫金过滤试验的各个步骤之间，可以用合适的缓冲液(例如基于pbs的缓冲液)洗涤膜。例如，这类缓冲液可以是含有生理ph值的水中的nacl、kcl、kh2po4、na2hpo4和edta的pbs/ae缓冲液。这类缓冲液可以是基于pbs的缓冲液，由每升包含1mmedta和0.025％(m/v)叠氮化钠的双蒸去离子水(调节至ph7.4)中8.0gnacl、0.2gkcl、0.2gkh2po4和1.05gna2hpo4组成。

在使用digfa的情况中，抗原可以以点状方式固定于微孔膜。在digfa试验中，也以点的形式将样品施加于膜。胶体金标记的二抗也以点的形式加入。digfa试验是特别优选的，因为在几个膜上的不同点处，可以固定来自各种分枝杆菌菌株的各种抗原。以这种方式有可能提供关于患者感染何种分枝杆菌菌株的信息。使用digfa的另一个优点是，可以在一个测试中比较来自不同人的样品，因为digfa能够在无限量的斑点中快速且可靠地检测抗体-抗原相互作用，取决于膜的大小。

检测抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合，例如在digfa试验的情况中，将红色染色用作检测方法，可以在自动化装置中进行。本领域技术人员已知各种自动化装置，并且技术人员能够选择合适的软件装置来对检测基质上结合的程度或范围进行定量。

检测抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合可以通过视觉检测技术或任何其他合适的检测技术进行。在特别优选的实施方式中，借助于终点试验的检测在视觉上进行，优选用肉眼进行。这具有易于检测的优点，而不需要昂贵和复杂的检测技术。在使用digfa的情况下，可以借助肉眼来评估一个或多个抗体和/或其他物质与固定的抗原的结合。

视觉信号，例如在digfa试验情况中用作终点试验的红色染色，也可以借助移动应用程序检测，即设计为在诸如平板电脑或智能电话的移动设备上运行的计算机程序。例如，可以使用这样的应用(app)，所述应用旨在比较不同的一个或多个样品分量之间的结合信号，并且指示该样品来源的人或动物是否具有结核病。

本发明的方法可以包括有利于该方法灵敏度的其他步骤。例如，该方法可以包含将样品暴露于对样品中分子具有亲和力的分子的其他步骤，其产生对结核病没有特异性的结合信号，从而清除这些非特异性分子。

该方法还可包括将样品分开的其他步骤。如上所述，本发明的(特别是)二酰基糖脂抗原与结核基腺苷对结核病特异性抗体的高特异性以及假阳性相关风险较低使其可能在不需要将来自人或动物的样品分成两个样品分量的情况下，可靠地诊断一个人是否有患有结核病，所述两个样品分量中的一个在两个分量暴露于具有抗原的检测基质前暴露于抗原。然而，本文所提及的抗原将适用于这种方法。

在一个实施方式中，因此，本发明方法可以是包括下述步骤的实时方法：

i)提供来自人或动物的样品；

ii)获得所述样品的至少2个分量；

iii)将第一个所述分量暴露于携带所述固定的抗原的固体基质，

iv)将第二个所述分量暴露于未携带所述固定的抗原的固体基质；

v)将在步骤iii)中暴露的所述样品分量暴露于固体测试基质，所述固体测试基质是针对本发明第一方面如上所述的固体基质，并且将在步骤iv)中暴露的样品分量暴露于固体对照基质，所述固体对照基质具有与固体测试基质相同的组合；

vi)实时检测步骤v)抗体与所述固定的抗原的结合；和

vii)比较所述测试基质和对照基质之间结合的程度或范围，任何观察到的与测试基质结合较低是所述样品中存在针对固定的抗原的抗体的指征，其指示样品来源的人或动物中的结核病，其中，固定于步骤iii)所述的固体基质的所述抗原包括至少一种类型，优选固定于所述固体测试和对照基质的抗原的所有类型。

在比较性实施方案中，本发明的方法可以是检测样品中针对分枝杆菌物质的抗体的终点方法，

其包括以下步骤：

i)提供来自人或动物的样品；

ii)获得所述样品的至少2个分量；

iii)将第一个所述分量暴露于携带所述固定的抗原的固体基质；

iv)将第二个所述分量暴露于不携带所述固定的抗原的固体基质；或将第二个所述分量中的至少部分储存直到步骤v)，跳过将第二个所述分量暴露于不携带所述固定的抗原的固体基质的步骤；

v)将在步骤iii)中暴露的所述样品分量的至少部分暴露于固体测试基质，所述固体测试基质是针对本发明第一方面如上所述的固体基质，并且将步骤iv)中暴露或储存的样品分量暴露于固体对照基质，所述固体对照基质具有与固体测试基质相同的组合；

vi)在终点试验中检测抗体与步骤v)的所述固定的抗原的结合；和

vii)比较所述测试基质和对照基质之间结合的程度或范围，任何观察到的与测试基质结合较低是所述样品中针对固定的抗原的抗体存在的指征，其指示样品来源的人或动物中的结核病，其中，固定于步骤iii)所述的固体基质的所述抗原包括至少一种类型，优选固定于所述固体测试和对照基质的抗原的所有类型。

在这些实施方式的上下文中，应当理解的是，较低可以被定性和定量地解释，即，结合较低可以被解释为具有较少的结合事件以及具有较弱的结合。这两个实施方式的优点在于，即使仍然有背景信号，也不需要健康人的样品作为参照或对照样品。只需要一个对象的一个样品。

此外，在这些实施方式的步骤iii)中固定有抗体的基质通常不是由与测试/对照基质相同的材料制成。步骤iii)中的基质可由对样品分子非特异性结合呈惰性的任何材料制成。这类材料包括聚四氟乙烯(例如特氟龙)、聚丙烯、聚醚酮(peek)和聚乙烯。这些实施方式中的测试和对照基材是如上所述的检测试验中检测表面或基质或检测装置的传感表面或基质。

对于本发明的固体基质，以及抗原，可以固定化合物以控制固体基质的疏水性/亲水性。特别是当固定具有长酰基链的抗原时，基质的表面可能变得太疏水而不能有效结合抗体。在那种情况下，可以优选以较低密度的包装将抗原固定于固体基质。这可以这样获得：通过将分布在抗原之间的亲水性分子共固定或通过将抗原固定于这样的亲水性分子上，所述亲水性分子固定于固体基质。这类亲水性分子可以是例如peg或mpeg。

固体基质可以包含有能够与指示结核病的抗体结合的抗原的任何组合，但是如上具体所述的组合a-d中的至少一种。

他抗原可以共固定于相同的固体基质或在分开的固体基质上提供。后者能够检测抗体与或生物传感器的分开的隔室中或单独区段上不同类型抗原的结合。

因此，固体基质可以包含：

-能够结合指示人或动物中分枝杆菌物质存在的两种类型的抗原，诸如具有固定于其上的1-结核基腺苷抗原和ac2sgl抗原的固体基质；具有固定于其上的1-结核基腺苷抗原和分枝菌酸抗原的固体基质；或有固定于其上的ac2sgl抗原和分枝菌酸抗原的固体基质；

-具有三种类型的抗原的固体基质，所述抗原能够结合指示人或动物中分枝杆菌物质的存在，诸如具有固定于其上的1-结核基腺苷抗原、ac2sgl抗原和分枝菌酸抗原的固体基质。在本发明的方法中，也可以使用不同的固体基质进行一个检测试验，各自具有以上述任何组合固定于其上的特定类型的抗原。

抗原被固定于基质的方式取决于固定抗原的基质的特性。

一些基质允许在没有修饰的情况下固定抗原，例如通过抗原疏水性碳链(例如酰基链)中的一个或两个与基质的疏水相互作用的方式。例如，如果将抗原固定在elisa板、硝酸纤维素膜或pvdf膜的表面上，则这是可能的。对于这些基质，最方便的固定方法是将抗原直接物理吸收到试验膜上。

其他基质可能需要用官能团修饰抗原。因此，本申请中术语”官能团“应理解为能够将抗原固定于固体基质的基团。这些官能团优选添加到抗原的疏水碳链之一或两者。

对于结核基腺苷抗原，可以将官能团添加到抗原的一个或多个疏水碳链，例如烷基链。或者，官能团可以添加到腺苷部分的氮或胺。或者，官能团可以添加到抗原式(iii)的结核基尾。对于二酰基糖脂抗原，官能团优选添加到抗原疏水碳链中的一个或两个，例如二酰基糖脂抗原的酰基链。例如，这种官能团可以是硫代基团，胺基团，醛基团或任何其它合适的基团。

例如，这种官能团可以是硫代基团，胺基团，醛基团，双键(即烯烃基团)或任何其它合适的基团。

一些偶联方法要求对抗原以及与抗原偶联的固体基质进行修饰。经修饰的基质的示例包括：

·nhs酯活化的支持材料，其中nhs酯是通过edc活化羧酸酯分子与抗原上的伯胺反应形成的反应性基团；

·醛活化的支持材料，其中抗原的偶联通过称为还原胺化的反应进行；

·吖内酯(azlactone)活化的支持材料，包括丙烯酰胺与吖内酯的共聚合；

·cdi活化的支持材料，其中羰基二咪唑(cdi)活化羟基以形成反应性咪唑氨基甲酸酯，其与含伯胺/修饰的抗原形成氨基甲酸酯键；

·巯基反应性支持材料，其中硫醇基团可用于直接偶联反应；

·马来酰亚胺活化的支持材料，其中马来酰亚胺活化的试剂形成稳定的硫醚键；

·碘乙酰基活化的支持材料，其与巯基反应，产生稳定的硫醚键；

·吡啶基二硫化物支持材料，其中吡啶基二硫化物与巯基反应；和

·酰肼活化的支持材料。

通过在(修饰的)抗原(例如伯胺、巯基、羧酸、醛)上特定的官能团和支持材料上的反应性基团之间形成共价化学键，可以将抗原直接固定或“偶联”到固体支持材料上。也有可能将抗原非共价结合地固定，如疏水性相互作用或通过链霉亲和素-生物素偶联。各种偶联方法都是可能的。例如，硫代偶联，胺偶联和羰基反应性固定方法，这涉及通过羰基(糖)基团偶联，其中顺式二醇可以用高碘酸钠氧化以产生醛作为共价固定的位点。自组装固定方法也是可能的。例如，基于二氧化硅的基质可以用含有游离胺基的硅烷衍生物修饰，例如，氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基甲氧基硅烷。该游离胺基团与硫醇修饰的抗原自发反应形成共价键。这不要求复杂的方案。在金固体基质的情况中，可以将硫醇半胱胺单层用于金基质，然后硫醇半胱胺的游离胺可以用于与硫醇修饰的抗原的自发偶联反应中。这将不要求复杂的方案。关于与硝酸纤维素膜偶联，偶联可以基于各种机制。如上所述，未修饰的抗原可以使用其疏水尾固定于膜，但是也可能是其他机制。这些机制包括硫醇化抗原与环氧化物官能化硝酸纤维素膜的共价连接，通过硝酸纤维素结合链霉抗生物素蛋白锚定蛋白的生物素化抗原的连接，以及通过环氧化物硫醇键使用官能化硝酸纤维素膜固定的抗原与新型硝酸纤维素结合锚蛋白的融合，用于直接偶联和共价连接。

为了检测样品中抗体的存在，将抗原固定于固体基质，该基质可以暴露于源自人或动物的样品，从而可以定性或定量或以两种方式确定抗体与固定的抗原的结合。应注意，在本申请中，术语“固体基质”与“固体表面”或“固体支持物”含义相同。

固体基质可以是检测装置的传感表面或基质或检测试验中的检测表面或基质。在该方面中，固定抗原的基质可以是表面等离子共振装置、电化学阻抗光谱装置、等温滴定量热装置、生物层干涉亮度装置、光栅装置、光子晶体装置、声共振仿形装置或石英晶体微天平装置的传感表面或酶联免疫吸附试验(elisa)、western印迹试验、放射性标记试验，光谱试验、免疫荧光、免疫沉淀试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验、安培检测试验、伏安检测试验或电化学阻抗光谱试验中的检测表面。

本发明固定的固体基质可用于生物传感器。该生物传感器包括如上所限定的固定于一个或多个固体基质的所述结核基腺苷抗原、二酰基糖脂抗原和分枝菌酸源性抗原中的2个或更多个的组合。抗原可以固定于混合的同一基质上或生物传感器中不同位置或不同基质。使用分开的位置或分开的基质能够分析可能的结核感染的性质，例如用于获得对象是否患有活性结核病的指示。因此，在一实施方式中，多个类型的抗原被固定于同一基质。在生物传感器的另一实施方式中，各类型的抗原分子被固定在分开的基质上。

生物传感器中抗原的组合可以是如上所示组合a-d中的任一个。

生物传感器可以是适用于根据本发明的方法的任何生物传感器。例如，生物传感器可包括具有固定的抗原的基于二氧化硅的基质和si环共振器。这类生物传感器可用于环共振。同样很有可能的是，生物传感器腔室的基质是基于金的。当使用表面等离子体共振或电化学阻抗谱来检测抗体与固定的抗原的结合时，基于金的基质特别有用。本发明还包括包括本发明固体基质的任何其他生物传感器。

实施例

下述实施例旨在说明本发明的原理，不应被理解为限制权利要求的范围。在实施例中，在elisa测定中测试人血清样品中对人或动物中分枝杆菌物质存在具有特异性的抗体。作为检测方法，选择elisa方法，因为它比例如表面等离子体共振或电化学阻抗谱(eis)或环共振(干涉亮度法)灵敏度低。因此可以得出这样的结论，如果用elisa获得令人满意的结果，那么也可以用更灵敏的检测方法获得这些结果。

材料：

·样品(人血浆或血清)

·0.2微米旋转过滤器(whatman公司)

·溶于己烷中的多克隆分枝菌酸，

·溶于己烷中的合成的ac2sgl(2-棕榈酰基-3-羟基结核烯酰-2'-硫酸盐-α-α'-d-海藻糖)，

·溶于己烷中的合成的1-结核基腺苷(tbad)，

·根据式(xiii)的合成的二酰基糖脂抗原

·聚苯乙烯elisa板

·pbs

·封闭缓冲液：pbs中0.5％酪蛋白

·1步超级tmb-elisa基质溶液(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))

·2m硫酸

·二抗：兔抗-人igghrp或兔抗-人igmhrp(dako)

方法

elisa板的涂覆

为了将分枝菌酸固定于elisa板，向各孔中加入50μl己烷和多克隆分枝菌酸，所述多克隆分枝菌酸浓度为96孔elisa板的各孔100μg/ml。为了将ac2sgl固定于elisa板，向96孔elisa板的各孔中加入50μl(己烷和ac2sgl，所述ac2sgl浓度为100μg/ml。为了将1-结核基腺苷固定于elisa板，向96孔elisa板的各孔中加入50μl(己烷和1-结核基腺苷，所述1-结核基腺苷浓度为100μg/ml。将板在4℃孵育24小时，然后用pbs洗涤两次。为了将1-结核病腺苷固定于elisa板，对于96孔elisa板的各孔，根据式(xiii)的固定的二酰基糖脂抗原经由末端硫代基团固定。根据式(xiii)的1μg抗原固定于各孔。

样品制备

源自已知患有结核病的血清来源于涂片阳性(患者1-9(+))和涂片阴性患者(患者11-18(-))。测试抗-tbad抗体的患者19-40样品是随机选择的涂片阴性和阳性患者。同样，使用的样品也来源于健康人(健康1、2和3)。获得0,5ml的分量，并且各自转移到0,2微米旋转过滤器，以10000g离心。将流出物在封闭缓冲液中1:20稀释。

elisa程序

为了阻断抗体与elisa板孔中的抗原的非特异性结合，向每个孔中加入300μl封闭缓冲液并孵育1小时。随后，用45μl样品替换封闭缓冲液。封闭缓冲液用作阴性对照。孵育后，用pbs洗涤板三次。将洗涤pbs缓冲液替换为封闭缓冲液中的共轭hrp的二抗(1:20.000稀释)。孵育后，再次用pbs洗涤板三次。随后，将50μl/孔的tmb-elisa基质溶液加入孔中，并在室温下孵育15-30分钟。通过添加50μl/孔的2m硫酸终止反应。测量450nm处的吸光度以定量抗体与elisa板的固定的抗原的结合。

结果

图1显示了使用固定的分枝菌酸以兔抗-人igmhrp作为二抗的elisa试验的结果。很明显，在健康人(健康1和2，白色柱)中获得了非常高背景信号。由于证实这些人是健康的，因此来自这些人的样品不含有针对分枝杆菌物质的抗体，该信号是这样物质的结果，所述物质与结核病无关，但的确结合分枝菌酸并导致elisa信号。源自涂片阴性患者(患者11-18(-)，灰色柱)的样品显示了没有显著超过健康人的信号的吸光度信号。源自涂片阳性患者(患者1-9(+)，黑色柱)的样品显示了甚至看起来低于健康人的信号的吸光度信号。源自与结核病不相关但是的确结合分枝菌酸的物质的高背景信号因此掩盖了源自指示结核病的实际抗体的信号。

图2显示了以兔抗-人igmhrp作为二抗用固定的1-结核基腺苷进行的elisa测试。这里获自健康人(健康1、2和3，白色柱)的背景信号似乎显著地低于通过使用分枝菌酸作为固定的抗原获得的背景信号。

图2中的结果显示，如果将这些固定的抗原用于检测结核病的标志物的方法中，检测到抗体与这些抗原非常高的结核病特异性结合，无论样品是否源自涂片阳性(患者1-9(+)，黑色柱)或涂片阴性的人(患者10-18(-)，深灰色柱)，因为两者的信号与随机样品的信号相似(19-40)。当应用固定于固体基质的分枝菌酸时，显然不是这种高特异性的情况。源自针对1-结核基腺苷的抗体的信号与使用固定的分枝菌酸抗原相比，似乎显著地较少被背景信号所掩盖。这导致关于结核病标志物检测的灵敏度方面显著的改善。

图3显示了当以兔抗-人igmhrp作为二抗用进行固定的ac2sgl的elisa测试时，获自健康人(健康1和2，白色柱)的背景信号似乎显著更低。源自涂片阳性患者(患者1-9(+)，黑色柱)的样品显示了高于健康人的信号的吸光度信号，因此证实了存在指示结核病的特异性抗体。该影响在源自涂片阴性患者(患者11-18(-)，灰色柱)的样品中甚至更明显，其显示了比健康人的信号显著高的吸光度信号。图3中的结果显示了，如果在用于检测结核病标志物的方法中使用这些固定的抗原，将检测到抗体对这些抗原非常高的结核病特异性结合。该影响在源自涂片阴性的患者的样品中最为明显。相比使用固定的分枝菌抗原时，源自结核病实际标志物的信号似乎显著较少地被背景信号所掩盖，因此源自结核病实际标志物的信号变得更加明显。这导致关于结核病标志物检测的灵敏度方面显著的改善。

图4显示了当用根据式(xiii)的固定的二酰基糖脂抗原进行elisa测试时，获自健康人(n＝4)的背景信号似乎显著更低。源自涂片阳性患者(n＝9)的样品显示了高于健康人的信号的吸光度信号，虽然具有相当高的标准偏差，因此证实了存在指示结核病的特异性抗体。该影响在源自涂片阴性患者(n＝32)的样品中甚至更明显，其显示了比健康人的信号显著高的吸光度信号，并且该信号显示出非常低的标准偏差。上述结论显示，如果在用于检测结核病标志物的方法中使用根据式(xiii)的固定的抗原，将检测到抗体对这些抗原非常高的结核病特异性结合。该影响在源自涂片阴性的患者的样品中最为显著，因为低标准偏差。相比使用固定的分枝菌抗原时，源自结核病实际标志物的信号似乎显著较少地被背景信号所掩盖，因此源自结核病实际标志物的信号变得更加明显。这导致关于结核病标志物检测的灵敏度方面显著的改善。

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