背景技术：
重症患者通常进入重症监护室(icu)，伴有器官功能障碍和/或器官衰竭(of)的几种迹象。为了快速有效地对这些患者进行分层和治疗，临床医生需要尽可能准确地评估患者的整体状况和疾病严重程度。这种评估及其所得结果是非常重要的，因为多器官功能障碍综合征(mods)是icu死亡的主要原因(vincent2006；ferreira和sakr2011)。只有少数人在icu由于单独的of死亡(mayr,dunser等人，2006)。各种临床研究支持这些发现并证实器官功能障碍或器官衰竭、这些受试者的发病率和死亡率之间存在强烈相关性(ferreira和sakr2011，mayr等人2006年，vincent等人，1998年，vincent等人，2006)。
在20世纪80年代和90年代，许多当前的金标准icu评分系统得到了发展。其中包括基于生理评估和患者标准的结果预测评分，例如急性生理学和慢性健康评估ii(apacheii)和简化的急性生理学评分(sapsii)。另外的评分是发病诊断评分，如sofa评分，其基于器官特异性参数(bouch和thompson2008)。所有三个评分均基于至少六个参数，并在入住icu后的前24小时内确定。apacheii由14个变量(12个生理参数，年龄和慢性健康状态)组成，随着参数异常性增加，每个的权重从0到4(knaus，draper等人1985)。sapsii由17个变量组成，包括12个生理学参数、患者年龄、入院类型和三个潜在疾病变量(legall,lemeshow等人1993)。至于sofa评分，六个器官根据其功能障碍程度评估和加权，每个评分从0至4(vincent,moreno等人1996)。
虽然sofa评分并不是用来预测结果，而是显示icu患者的连续并发症，但与因患者的累积器官衰竭的死亡率有明显相关性(vincent2006)。特别是，在高器官衰竭组的情况，例如有四个或更多of的患者，两个icu重点临床研究的死亡率为65％或83％，而比较而言，没有任何器官衰竭的患者死亡率为6％或22％(vincent,demendonca等人1998；vincent，sakr等人2006)。鉴定受试者遭受器官功能障碍或器官衰竭并因此具有高死亡率的能力仍然具有挑战性且耗时，如下所述，但具有极大的重要性。
除了其以一定概率预测或诊断重症患者的能力之外，现有技术中公开的icu评分仅用于非随机选择icu的10％至15％(通常是专注于临床研究和/或严格质量法规的医院)，并具有几个缺点(breslow和badawi2012)。例如，一个缺点是评分易受执行评估的每个临床医生的主观性的影响。几乎没有任何医院具有专门的评分专家或者至少定期培训的医务人员来关注所有参数的可靠评估，跟踪严格和相似的指导，以评估评分的不同变量(polderman,girbes等人2001)。另外，要评估的参数数量和得出结论的时间(入院后至少一天)对于许多患者而言是至关重要的，以快速解决所需的治疗。此外，重复的(潜在地每日)得分评估是费时的(legall,lemeshow等人1993)。此外，现有技术评分基于累积数据确定，其中综合结果用于患者状态的若干参数。因此，这样的评分可能被误解和可能误导医师，因为具有相同总评分的患者可以具有非常不同的和发散的结果(vincent,demendonca等人1998)。另一个不利影响是领先时间偏倚，它反映了评分评估前生理数据的自发变异性或治疗效果，特别是在分析用于计算总分数的许多可变参数时，其可能导致结果预测或诊断的不准确或偏倚评分(bouch和thompson2008)。
因此，需要简单、快速和客观的标准用于受试者，特别是重症患者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制。
因此，本发明的技术问题是提供手段和方法以提供预测受试者器官功能障碍的快速且可靠的方法。
通过提供下面提供的并且如所附权利要求中表征的实施方案解决了所述技术问题。
发明描述
本发明涉及一种受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白或其片段的水平，并且其中所述至少一种组蛋白或其片段的水平指示所述器官功能障碍。
此外，本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中肾上腺髓质素原(proadm)或其片段，特别是mr-proadm的水平，并且其中所述proadm或所述其片段的水平指示所述器官功能障碍。
此外，本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平和proadm和/或其片段的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平和所述proadm和/或其片段的水平指示所述器官功能障碍。
本发明解决了上述技术问题。如下文和所附实施例中所记载，在临床研究中出乎意料地发现，至少一种组蛋白，特别是组蛋白h2b、h4、h2a和h3的水平和/或proadm的水平表明与受试者器官功能障碍的强统计学关系；参见说明性实施例1。因此，本文记载了所述至少一种组蛋白和/或所述proadm，特别是mr-proadm，可用作器官功能障碍，特别是器官衰竭的代表物。
在所附实施例中，还令人惊讶地证明，受试者样品中至少一种组蛋白，特别是h2b、h4、h2a和h3水平的增加表明器官功能障碍；参见例如图1a至1d。此外，令人惊讶地证明，受试者样品中proadm，特别是片段mr-proadm水平的增加表明器官功能障碍；参见例如图1e。
此外，在所附实施例中记载，标志物水平的增加随着器官功能障碍的数量而增加；参见例如实施例1。例如，在下文中出乎意料地显示，与患有一至三个器官功能障碍的受试者的水平相比，在受试者中发生四种或更多种器官功能障碍的情况下，组蛋白，特别是h2b、h4、h2a和h3的水平进一步增加。因此，至少一种组蛋白蛋白质的水平特别指示四种或更多种器官功能障碍。因此，组蛋白的水平也特别指示确定受试者是否患有三种器官功能障碍或四种器官功能障碍；见表1。
另外，所附实施例出乎意料地证明proadm，特别是片段mr-proadm的水平从一个器官功能障碍、两个器官功能障碍、三个器官功能障碍到四个器官功能障碍逐步增加；参见例如图1e和表1。因此，proadm，特别是mr-proadm的水平特别指示一种器官功能障碍、两种器官功能障碍、三种器官功能障碍或四种器官功能障碍。因此，proadm，特别是mr-proadm的水平也指示确定受试者是否患有一种器官功能障碍、两种器官功能障碍、三种器官功能障碍或四种器官功能障碍。
此外，所附实施例证明至少一种组蛋白的水平，特别是组蛋白h2b的水平，指示受试者是否患有一种器官功能障碍、两种器官功能障碍至三种器官功能障碍或受试者是否患有四种或更多器官功能障碍；参见例如图1和表2a。此外，本文下文记载，proadm的水平，特别是mr-proadm的水平，指示受试者是否患有一种器官功能障碍、两种器官功能障碍、三种器官功能障碍或四种或更多种器官功能障碍；参见例如图1、表1和表2a。
另外，在所附实施例中记载，除了至少一种组蛋白或proadm的水平之外，确定另外的标志物或参数的水平进一步改善了器官功能障碍的预测；参见例如表2b。例如，临床评分，例如sapsii或sofa评分，进一步改善了诊断。此外，本文举例说明标志物的组合进一步改善了器官功能障碍的诊断。例如，与仅确定一种标志物相比，确定proadm，特别是mr-proadm的水平，以及至少一种组蛋白的水平，改善了受试者中器官功能障碍的预测；见说明性表2b。进一步证明，其他标志物，例如醛缩酶b、降钙素原或乳酸盐，改善了受试者器官功能障碍的预测。例如，除了proadm之外，确定醛缩酶b或乳酸盐的水平增加了与受试者中器官功能障碍事件的统计学关系。因此，本发明还涉及一种方法，包括确定另外的标志物和/或参数的水平，即标志物组的使用。
本发明具有优于常规方法的以下优点：本发明的方法和试剂盒快速、客观、易于使用且精确预测器官功能障碍，等等。本发明的方法和试剂盒涉及在医院常规中易于测量的标志物，因为组蛋白和proadm的水平可以在常规获得的血液样品或从受试者获得的其他生物学流体中测定。此外，确定组蛋白或proadm的水平非常快。因此，本发明的方法和试剂盒适用于器官功能障碍的快速评估、诊断和预后。因此，快速确定也适用于快速治疗决策。此外，由于生物标志物测量的简单结果作为一个特定值，当使用该方法或本发明的试剂盒时，医务人员没有主观偏见。因此，与例如在sofa评分中使用的生理参数的主观评分相比，再现性更高。组蛋白或proadm的水平还可以与其他标志物和/或参数组合作为现有评估或评分的附加物，以进一步改善预测并使分析适应特定的灵敏度和特异性，以便评估重症患者的总体状况。在观察多器官衰竭患者时，生物标志物可有助于根据患者衰竭器官数量对患者进行分层，并支持icu护理这一重要领域的诊断和治疗决策。
如上文和所附实施例中所记载的，令人惊讶地发现组蛋白水平和proadm水平与受试者的器官功能障碍相关。因此，本发明涉及通过测定受试者样品中proadm和/或组蛋白水平来确定受试者器官功能障碍的方法和试剂盒。此外，本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层和/或监测的方法和试剂盒。此外，本发明涉及用于治疗患有器官功能障碍的受试者的治疗指导和/或治疗控制的方法和试剂盒。
因此，本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括：
(i)测定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述器官功能障碍；和/或
(ii)测定所述受试者的样品中肾上腺髓质素原(proadm)水平，并且其中所述proadm水平指示所述器官功能障碍。
如本文所用，术语“确定至少一种组蛋白的水平”等是指确定受试者样品中组蛋白或其片段的水平或确定受试者样品中多于一种组蛋白或其片段的水平。特别地，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中组蛋白的水平，其中优选地组蛋白选自组蛋白h2b、h4、h2a和h3。特别地，确定组蛋白h2b的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中组蛋白的水平，其中特别地确定组蛋白h4的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中两种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白h2b和h4的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中三种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白h2b、h4和h2a的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中四种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白h2b、h4、h2a和h3的水平。
因此，在本发明的上下文中，“确定至少一种组蛋白的水平”等可以指确定组蛋白h2b的水平、组蛋白h4的水平、组蛋白h2a的水平和/或组蛋白h3的水平。
特别地，术语“确定至少一种组蛋白的水平”等可以指确定受试者样品中组蛋白的水平。因此，本发明还涉及一种受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中组蛋白或其片段的水平，并且其中所述组蛋白或所述其片段的水平指示所述器官功能障碍。
如本文所用，“组蛋白”或“组蛋白蛋白质”或“组蛋白(一种或多种)”或“组蛋白(一种或多种)”是指经典组蛋白，例如h1、h2a、h2b、h3或h4，以及组蛋白变体，例如h3.3、h2a.z等或其片段。组蛋白形成八聚体，dna围绕其包裹，以组装染色质结构(luger,nature.1997sep18；389(6648)：251-60)。例如，组蛋白蛋白质h2a、h2b、h3和h4(每个中的两者)形成八聚体，其被165个碱基对的dna包裹以形成染色质的基本亚基，即核小体。还在多个病理生理过程中在细胞核外检测到组蛋白(wo2009/061918)。已经描述了在患有涉及炎症过程的不同病因的患者的血液中细胞外组蛋白的存在。活化的免疫细胞释放的组蛋白可以通过细胞外陷阱介导。活化的中性粒细胞作为控制和清除感染的最终机制，可释放细胞外纤维，即所谓的中性粒细胞胞外陷阱(nets)(brinkmannv.，等人science2004；303(5663)：p.1532-5)。组蛋白可以释放到患者血流中的其他机制包括细胞的凋亡、坏死、细胞焦亡或坏死性凋亡。
特别地，至少一种组蛋白选自h2b、h4、h2a和h3。因此，在本发明的方法和试剂盒中测定的组蛋白水平具体地是组蛋白h2b、h4、h2a和/或h3的水平。组蛋白的序列是技术人员已知的。组蛋白的示例性序列在seqidno：1至4中给出。组蛋白h4的示例性氨基酸序列在seqidno：1中给出。组蛋白h2a的示例性氨基酸序列在seqidno：2中给出。组蛋白h3的示例性氨基酸序列在seqidno：3中给出。组蛋白h2b的示例性氨基酸序列在seqidno：4中给出。特别地，至少一种组蛋白选自h2b、h4、h2a和h3。更特别地，至少一种组蛋白选自h2b、h4和h2a。更特别地，至少一种组蛋白是h2b和h4。更特别地，至少一种组蛋白是h2b或h4。
应理解，“确定至少一种组蛋白的水平”等是指确定样品中至少一种组蛋白或至少一种组蛋白的片段的水平。特别地，在样品中测定组蛋白h2b、h3、h2a和/或h4的水平。因此，在样品中测定的至少一种组蛋白可以是游离组蛋白，或者样品中确定的至少一种组蛋白可以发生并且可以组装在大分子复合物中，例如在八聚体、核小体和/或net中。因此，样品中至少一种组蛋白的水平可包括在大分子复合物中组装的游离组蛋白蛋白质和/或组蛋白蛋白质的水平。
在本发明的特定方面，组蛋白或其片段的水平可以在未组装在大分子复合物中的样品中测定，复合物例如核小体、八聚体或嗜中性粒细胞胞外陷阱(net)。这种组蛋白在本文中称为“游离组蛋白”。因此，至少一种组蛋白的水平可以具体是至少一种游离组蛋白的水平。
这种游离组蛋白的水平可以通过检测不可在组装的化学计量大分子复合物(如单核小体或八聚体)中接近的组蛋白的氨基酸序列或结构表位来确定。在这样的结构中，组蛋白的特定区域被覆盖，因此如中性粒细胞胞外陷阱(“nets”)所示在空间上不可接近(brinkmannv.等人science303(5663):p.1532-5,2004)。此外，在八聚体或核小体中，组蛋白的区域也参与分子内相互作用，例如在各个组蛋白之间。因此，在本发明的上下文中确定的组蛋白的区域/肽/表位可以确定组蛋白是游离组蛋白还是组装在大分子复合物中的组蛋白。例如，在基于免疫测定的方法中，当它们是核小体的八聚体核心的一部分时，所利用的抗体可能不检测组蛋白，例如h4，因为表位在结构上是不可接近的。在下文中，举例说明了组蛋白的区域/肽/表位，其可用于确定游离组蛋白。例如，组蛋白的n-末端或c-末端尾部的区域/肽/表位可用于确定组蛋白，而不管它们是否在大分子复合物中组装或是根据本发明的游离组蛋白。
应理解，组蛋白的测定可包括翻译后修饰的组蛋白蛋白质。因此，翻译后修饰可包括氨基酸的脱乙酰化或乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和瓜氨酸化。
在该上下文中，“化学计量”涉及完整的复合物，例如单核小体或八聚体。“游离组蛋白”也可以包含非染色质结合的组蛋白。例如，“游离组蛋白”也可包含单个组蛋白蛋白质或非八聚体组蛋白复合物。游离组蛋白可以(例如瞬时)与个体组蛋白结合，例如，组蛋白可以形成同源或异源二聚体。游离组蛋白也可以形成同四聚体或异四聚体。同或异四聚体可以由四个组蛋白分子组成，例如h2a、h2b、h3和/或h4。典型的异四聚体由两个异二聚体形成，其中每个异二聚体由h3和h4组成。本文中还应理解，异四聚体可由h2a和h2b形成。本文还设想异四聚体可以由一种由h3和h4组成的异二聚体和一种由h2a和h2b组成的异二聚体形成。因此，游离组蛋白在本文中称为并且可以是单体、异二聚体或四聚体组蛋白蛋白质，其不组装在(“化学计量的”)大分子复合物中，所述大分子复合物由与核酸结合的组蛋白八聚体组成，例如核小体。此外，游离组蛋白也可以与核酸结合，并且其中所述游离组蛋白不在(“化学计量”的)大分子复合物中组装，例如完整的核小体。优选地，游离组蛋白基本上不含核酸。
至少一种组蛋白的片段可具有任何长度，例如至少约5、10、20、30、40、50或100个氨基酸，只要该片段允许明确确定特定组蛋白的水平即可。至少一种组蛋白的片段是指组蛋白的独立片段，例如组蛋白h2b、h4、h2a和h3。下文公开了组蛋白的各种示例性片段，其适于测定受试者样品中组蛋白的水平。在本文中还应理解，组蛋白的水平可通过确定跨越组蛋白的n-末端或c-末端尾部的片段来确定。另外，还可以修饰在本发明的上下文中确定的组蛋白或其片段，例如通过翻译后修饰。示例性的翻译后修饰可以是乙酰化、瓜氨酸化、脱乙酰化、甲基化、去甲基化，去亚胺化，异构化、磷酸化和泛素化。
如本文所用，术语“肾上腺髓质素原”或“proadm”是指肾上腺髓质素原或其片段，特别是mr-proadm。应理解，“确定proadm的水平”等是指确定样品中proadm或其片段的水平。片段可具有任何长度，例如至少约5、10、20、30、40、50或100个氨基酸，只要该片段允许明确确定proadm的水平即可。在本发明的特别优选的方面，“确定proadm的水平”是指确定中区肾上腺髓质素原(mr-proadm)的水平。mr-proadm是proadm的片段。发现肽肾上腺髓质素(adm)是包含52个氨基酸的降血压肽，其已经从人类染色体细胞中分离出来(kitamura等人，1993)。肾上腺髓质素(adm)被编码为包含185个氨基酸的前体肽(“肾上腺髓质素原前体(preproadrenomedullin)”或“pre-proadm”)。adm的示例性氨基酸序列在seqidno：5中给出。adm构成pre-proadm氨基酸序列的95-146位，并且是其剪接产物。“肾上腺髓质素原”(“proadm”)是指没有信号序列(氨基酸1至21)的pre-proadm，即pre-proadm的氨基酸残基22至285。“中区肾上腺髓质素原”(“mr-proadm”)是指pre-proadm的氨基酸42-95。mr-proadm的示例性氨基酸序列在seqidno：6中给出。本文还设想pre-proadm或mr-proadm的肽及其片段可用于本文所述的方法。例如，肽或其片段可包含pre-proadm的氨基酸22-41(pamp肽)或pre-proadm的氨基酸95-146(成熟的肾上腺髓质素)。proadm的c末端片段(preproadm的氨基酸153-185)称为肾上腺素。proadm肽的片段或mr-proadm的片段可包含例如至少约5、10、20、30或更多个氨基酸。因此，proadm的片段可以例如选自mr-proadm、pamp、肾上腺素和成熟肾上腺髓质素，优选地，本文中该片段是mr-proadm。
本文还设想可以确定多肽，其与proadm或至少一种组蛋白具有序列同一性。例如，可以在本发明的方法和试剂盒中测定多肽，其与seqidno：5或6，或分别与seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中较高的序列同一性值是优选的。根据本发明，在两个或更多个氨基酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“同源性”或“同源性百分比”或“同一”或“同一性百分比”或“百分比同一性”是指，当使用本领域已知的序列比较算法，或通过手动比对和目视检查，比较并对齐以在比较窗口(优选在整个长度上)或在测量的指定区域上进行最大对应时，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者具有指定百分比的相同氨基酸。具有例如70％至90％或更高(优选95％或更高)序列同一性的序列可以被认为是基本相同的。这样的定义也适用于测试序列的互补序列。优选地，所描述的同一性存在于长度为至少约10至约15个氨基酸的区域上，更优选地，长度至少约20至约35个氨基酸的区域上，最优选地在整个长度上。本领域技术人员将知道如何使用例如算法确定序列之间/之中的百分比同一性，所述算法例如基于clustalw计算机程序的算法(thompsonnucl.acidsres.2(1994),4673-4680)或fastdb(brutlagcomp.app.biosci.6(1990),237-245)，如本领域所知。
如本文所用，标志物的“水平”是指样品中标志物的分子实体的量。换句话说，在样品中测定标志物的浓度。例如，proadm或其片段，优选地mr-proadm的浓度和/或组蛋白h2b、h4、h3和/或h2a或其片段的浓度在受试者样品中测定。
如本文所用，术语“至少一种组蛋白的水平”是指从受试者获得的样品中至少组蛋白的分子实体的量，例如h2b、h4、h2a和/或h3或其片段的量。换句话说，在样品中测定至少一种组蛋白蛋白质或其片段的浓度。
如本文所用，术语“标志物肾上腺髓质素原(proadm)的水平”或“标志物肾上腺髓质素原(proadm)或其片段的水平”是指在从受试者获得的样品中标志物肾上腺髓质素原或其片段的分子实体的量。换句话说，在样品中测定标志物的浓度。因此，术语“标志物中区肾上腺髓质素原(mr-proadm)的水平”是指从受试者获得的样品中标志物中区肾上腺髓质素(mr-proadm)的分子实体的量。如上所述，本文还设想可以检测和定量肾上腺髓质素原(proadm)的片段，优选地mr-proadm。此外，可以检测和量化mr-proadm的片段。确定proadm或其片段(优选地mr-proadm)的水平或确定至少一种组蛋白或其片段的水平的合适方法在下文中描述。
器官是在结构单元中连接的组织的集合，以起到共同的作用。如本文所用，通用术语“器官功能障碍”还可以表示不止一个器官具有功能障碍，即除非另有说明，否则它也可以涉及器官功能障碍。术语“器官功能障碍”或“器官功能障碍(一种或多种)”涉及受试者中的病症，其中器官或一个以上器官与未受影响的器官(例如至少一个健康受试者的器官)相比不能发挥其正常功能。例如，与至少一个健康受试者的器官相比，器官可具有降低的活性或器官可能在具有器官功能障碍的受试者中异常活跃。优选地，具有器官功能障碍的器官与未受影响的器官(例如至少一个健康受试者的)相比，可具有至少约10％、20％、30％、50％、70％、90％、100％或200％的受损(减少或增加)的活性。
特别是，器官功能障碍可导致器官衰竭。因此，“器官功能障碍”优选地也可以指器官衰竭。“器官衰竭”是指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持正常的稳态。“器官衰竭”也可以指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持器官的正常的稳态。“器官衰竭”也可以指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持受试者的正常的稳态。
在本发明的特定方面，器官功能障碍是器官衰竭或至少一种器官衰竭。一般术语“器官衰竭”还可以表示不止一个器官发生衰竭，即除非另有说明，否则它也可能与器官衰竭有关。在此应理解，器官功能障碍也可称为多器官功能障碍。在此应理解，器官衰竭也可称为多器官衰竭。
示例性器官功能障碍或器官衰竭是循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒。因此，在本发明的上下文中，器官功能障碍或至少一种功能障碍可以优选地选自循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒。在本文中应理解，受试者还可具有一种以上器官功能障碍或衰竭，其是例如选自循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒的两种、三种、四种器官功能障碍的组合。例如，本发明的方法和试剂盒可以确定受试者是否患有两种器官功能障碍，例如循环休克和呼吸衰竭。
如本文所用，具有“循环休克”的受试者可以指具有低于约90mmhg的收缩动脉压的受试者，例如具有外周低灌注的迹象。因此，这样的受试者可能需要输注血管加压剂和/或正性肌力药。
如本文所用，具有“血液衰竭”的受试者可以指具有低于约100,000/mm3的血小板增多症的受试者。
如本文所用，具有“肝衰竭”的受试者可以指具有大于约2mg/dl的胆红素血症和/或天冬氨酸或丙氨酸转氨酶的酶水平大于约500国际单位/升的受试者。
如本文所用，具有“神经功能衰竭”的受试者可以指具有低于13的格拉斯哥昏迷量表的受试者。
如本文所用，具有“肾衰竭”的受试者可以指具有小于约0.5ml/kg/h的尿输出至少约3小时和/或与先前值相比上升超过约50％的肌酸血症的受试者。
如本文所用，具有“呼吸衰竭”的受试者可以指具有动脉氧分压与吸入氧分数的比率(pao2/fio2)低于约300mmhg的受试者，无论其选择的通气支持如何。
如本文所用，具有“代谢性酸中毒”的受试者可以指乳酸水平低于约2.5mmol/l、碱剩余(碱水平低于-2mequivalent/l)或碳酸氢盐水平(hco3-)低于约24mmol/l，优选低于约18mmol/l的受试者。
术语“指示所述器官功能障碍”是指受试者患有或将可能患有器官功能障碍或至少一种器官功能障碍。因此，受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平表明受试者中的器官功能障碍。
本发明的方法还涉及一种方法，其中在受试者的样品中测定至少一种组蛋白的水平，其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述器官功能障碍。
本发明还涉及一种方法，其中在受试者的样品中测定肾上腺髓质素原(proadm)，特别是mr-proadm的水平，其中将所述proadm，特别是mr-proadm的水平与proadm的参考水平进行比较，并且其中所述proadm，特别是mr-proadm的水平表明所述器官功能障碍。
该方法还涉及一种方法，其中确定至少一种组蛋白的水平，并且其中在受试者的样品中测定肾上腺髓质素原(proadm)，特别是mr-proadm的水平，其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，并且其中将所述proadm水平与proadm的参考水平进行比较，并且其中基于比较步骤鉴定所述受试者中的所述器官功能障碍。
如本文所用，术语“与至少一种组蛋白的参考水平进行比较”或其语法变体意指将受试者的至少一种组蛋白的水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较。因此，将受试者的组蛋白水平与相同组蛋白的相应参考水平进行比较。例如，将受试者样品中测定的组蛋白h2b的水平与组蛋白h2b的参考水平进行比较。加以修正，这适用于其他组蛋白。至少一种组蛋白的参考水平具体是组蛋白h2b的水平、组蛋白h4的水平、组蛋白h2a的水平和/或组蛋白h3的水平。
如本文所用，术语“与proadm的参考水平进行比较”或其语法变体意指将受试者的proadm水平与proadm的参考水平进行比较。如果确定至少一种组蛋白和/或proadm的片段的水平，则参考水平也可以是相应片段的水平。
如本文所用，“参考水平”可以反映相应标志物的正常水平，在本发明优选方面中其指示没有器官功能障碍或器官衰竭。因此，参考水平可以代表一组健康受试者(例如群组)的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平。健康受试者是没有诊断(和确认)疾病和/或医学病症的受试者。健康受试者可优选具有正常功能的器官，即没有器官功能障碍或没有器官衰竭。因此，参考水平可以是在健康受试者的样品中确定的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平。参考受试者或健康受试者在本文中优选定义为一组受试者或一组健康受试者，例如一群组受试者。健康参考受试者优选没有器官功能障碍或器官衰竭。因此，参考水平优选是没有器官功能障碍或没有器官衰竭的受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平。因此，参考水平优选地是指示没有器官功能障碍或没有器官衰竭的水平。
参考水平可以是至少一个参照受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平，其中所述参考受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proadm的水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，并且其中所述受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
此外，参考水平还可以是至少一个参照受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症以及感染(例如败血症或败血病症)，并且其中所述受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proadm的水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症并且没有感染，并且其中所述受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proadm的水平，并且其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，包括全身炎症反应综合征(sirs)，其中所述受试者没有感染，并且其中所述受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
如本文所用，至少一个参考受试者是指一个以上的参考受试者。特别地，至少一个参考受试者是参考受试者的组或群组。如下文所述，描述了用于确定例如参考受试者中的标志物水平的手段和方法，并且还提供了示例性参考水平。
这里使用的参考水平通常是预定水平，即它已被预先确定为以后在护理点例如icu使用的参考。
如本文所述，与参考水平相比，至少一种组蛋白的增加的水平(或至少一种组蛋白水平的增加)和/或proadm的增加的水平(或proadm水平的增加)，特别是mr-proadm，指示器官功能障碍。因此，本发明的方法包括一种方法，该方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述受试者的所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平相比增加指示所述受试者中的所述器官功能障碍。
此外，本发明包括一种方法，该方法包括确定所述受试者样品中proadm，特别是mr-proadm的水平，并且其中与所述proadm、特别是mr-proadm的参考水平相比，所述受试者的所述proadm、特别是mr-proadm的水平增加指示所述受试者中的所述器官功能障碍。
此外，本发明包括一种方法，该方法包括确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，并确定所述受试者样品中proadm，特别是mr-proadm的水平，并且与至少一种组蛋白的参考水平和所述proadm、特别是mr-proadm的参考水平相比，其中所述受试者的所述至少一种组蛋白的水平增加和所述受试者的所述proadm、特别是mr-proadm的水平增加指示所述受试者的所述器官功能障碍。
本发明还涉及一种方法，其包括
(i)确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
其中将所述至少一种组蛋白的水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较，
并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的至少一种组蛋白的增加的水平指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proadm)的水平，
其中将proadm的水平与proadm的参考水平进行比较，
并且其中与proadm的参考水平相比，所述受试者的proadm的增加的水平指示所述受试者的器官功能障碍。
换句话说，本发明还涉及一种方法，其包括
(i)确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
其中将所述至少一种组蛋白的水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较，
并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的至少一种组蛋白的水平增加指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proadm)的水平，
其中将proadm的水平与proadm的参考水平进行比较，
并且其中与proadm的参考水平相比，所述受试者的proadm水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍。
如本文所用，术语“标志物水平的增加”意指标志物的水平增加，即它指标志物的增加的水平。因此，术语“标志物水平的增加”在本文中可与术语“标志物的增加的水平”互换使用。受试者标志物的增加的水平或标志物水平的增加意味着标志物的水平比标志物的参考水平高至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％。
在本发明的上下文中，术语“与参考水平相比至少一种组蛋白水平的增加”等与术语“与参考水平相比所述受试者的至少一种组蛋白的增加的水平”或术语“与参考水平相比至少一种组蛋白的增加的水平”可互换使用。这些术语意指受试者的至少一种组蛋白的水平，例如h2b的水平、h4的水平、h2a的水平和/或h3的水平，比至少一种组蛋白的参考水平高至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％。
如本文所用，术语“与参考水平相比proadm水平的增加”等在本文中与术语“与所述参考水平相比，所述受试者的proadm的增加的水平”或术语“与所述参考水平相比，proadm的增加的水平”可互换地使用。这些术语意指受试者的proadm水平、特别是mr-proadm水平比proadm、特别是mr-proadm的参考水平高至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％。
本发明还可以涉及一种方法，其包括
(i)确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
其中将所述至少一种组蛋白的水平与从先前分析获得的相同受试者的至少一种组蛋白的参考水平进行比较，
并且其中与至少一种组蛋白的所述参考水平相比，至少一种组蛋白的水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍或其他器官功能障碍；和/或
(ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proadm)的水平，
其中将所述proadm的水平与从先前分析获得的相同受试者的proadm的参考水平进行比较，
并且其中与所述proadm的参考水平相比，proadm水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍或进一步的器官功能障碍。
如本文所用，“从先前分析获得”是指在过去时间确定相同受试者的样品中的标志物水平，例如在下一次分析之前28天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天，并且其中在这些方面，所述先前确定的标志物水平被认为是参考水平。如本文所用，进一步的器官功能障碍可意味着另一器官显示/具有功能障碍或衰竭。例如，如果受试者患有一种器官功能障碍，则进一步的器官功能障碍意味着受试者患有两种或更多种器官功能障碍或衰竭。
与至少一种组蛋白的参考水平相比，受试者的至少一种组蛋白的水平增加可指示至少一种器官功能障碍、至少两种器官功能障碍或至少三种器官功能障碍。特别地，与至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的至少一种组蛋白的水平增加可指示至少五种器官功能障碍，或至少六种器官功能障碍。更具体地，与至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的至少一种组蛋白的水平增加可指示所述受试者中的至少四种器官功能障碍。
与proadm的参考水平相比，受试者的proadm水平增加可指示至少一种器官功能障碍。特别地，与所述proadm的参考水平相比，所述受试者的所述proadm水平的增加可指示至少两种器官功能障碍。更具体地，与所述proadm的参考水平相比，所述受试者的所述proadm水平的增加可指示至少三种器官功能障碍。更具体地，与所述proadm的参考水平相比，所述受试者的所述proadm水平的增加可指示至少四种器官功能障碍。
如本文所用，术语“一种器官功能障碍”是指受试者具有一种器官功能障碍，即受试者的一种器官具有功能障碍。如本文所用，术语“两种器官功能障碍”是指受试者具有两种器官功能障碍，即受试者的两个器官具有功能障碍。变通地这适用于术语三种功能障碍、四种功能障碍、五种功能障碍或六种器官功能障碍。
此外，在所附实施例中记载，与患有一至三个器官功能障碍的受试者的水平相比，在受试者中发生四种或更多种器官功能障碍的情况下，组蛋白，特别是h2b、h4、h2a和h3的水平增加；参见例如图1和表1。因此，本发明的方法和试剂盒可以确定受试者患有或可能患有多少器官功能障碍。
因此，在本文提供的方法和试剂盒的上下文中，与参考水平相比，所述受试者的所述至少一种组蛋白的水平增加指示所述受试者中的至少四种器官功能障碍，其中所述参考水平指示一至三种器官功能障碍。
此外，与至少一种组蛋白的参考水平相比，受试者的至少一种组蛋白水平的增加指示所述受试者中的至少五种器官功能障碍，其中所述参考水平指示四种器官功能障碍。
此外，与至少一种组蛋白的参考水平相比，受试者的至少一种组蛋白水平的增加指示所述受试者中的至少六种或七种器官功能障碍，其中所述参考水平指示五种器官功能障碍。
另外，所附实施例证明proadm的水平，特别是片段mr-proadm的水平从一种器官功能障碍、两种功能障碍、三种功能障碍、四种器官功能障碍到五种器官功能障碍逐步增加；参见例如图1e和表1。
因此，在本文提供的方法和试剂盒的上下文中，与参考水平的proadm相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中的至少一种器官功能障碍，其中所述参考水平表示没有器官功能障碍。
此外，与proadm的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中的至少两种器官功能障碍，其中所述参考水平指示一种器官功能障碍。
此外，与proadm的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中的至少三种器官功能障碍，其中所述参考水平指示两种器官功能障碍。
此外，与proadm的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中的至少四种器官功能障碍，其中所述参考水平指示三种器官功能障碍。
此外，与proadm的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中的至少五种器官功能障碍，其中所述参考水平指示四种器官功能障碍。
此外，与proadm的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm水平的增加指示所述受试者中至少六种或七种器官功能障碍，其中所述参考水平指示五种器官功能障碍。
此外，与proadm和/或至少一种组蛋白的参考水平相比，受试者的proadm，特别是mr-proadm和/或至少一种组蛋白的相同或相似水平，例如约+/-10％、+/-15％或+/-20％指示所述受试者中的多种器官功能障碍，其中所述参考水平指示多种器官功能障碍。
如本文所用，术语“参考水平指示器官功能障碍的数量”是指反映器官功能障碍的数量的水平。例如，可以在患有所述特定数量的器官功能障碍的至少一个参考受试者(通常在一组受试者中)中确定这样的(参考)水平。这些水平记录在所附实施例中，例如患有一至六种/七种器官功能障碍的受试者的标志物水平。因此，指示器官功能障碍的数量的参考水平可以是患有器官功能障碍的数量的至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平。经必要的修改，指示功能障碍的数量的参考水平可以是至少一个患有器官功能障碍的数量或不患器官功能障碍的参考受试者的所述proadm，特别是mr-proadm的水平。
本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中在受试者的样品中测定至少一种组蛋白，并且其中至少一种组蛋白的水平指示受试者是否患有一种器官功能障碍至三种器官功能障碍或者受试者是否患有四种或更多器官功能障碍。特别地，本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中在受试者的样品中测定至少一种组蛋白，并且其中至少一种组蛋白的水平指示受试者是否患有一种器官功能障碍或者受试者是否患有四种或更多器官功能障碍。
特别地，本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中在受试者的样品中测定至少一种组蛋白，并且其中至少一种组蛋白的水平指示受试者是否患有一种器官功能障碍至三种器官功能障碍或受试者是否患有四种器官功能障碍、或五种器官功能障碍或六种或更多种器官功能障碍。
此外，本文下文记载，proadm的水平，特别是mr-proadm的水平，指示受试者是否患有一种器官功能障碍至三种器官功能障碍或受试者是否患有四种或更多种器官功能障碍；参见例如表1和表2a。
因此，本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中proadm，特别是mr-proadm在受试者的样品中测定，并且其中proadm，特别是mr-proadm的水平指示受试者是否患有一种器官功能障碍或受试者是否患有两种或更多器官功能障碍。
此外，本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中proadm，特别是mr-proadm在受试者的样品中测定，并且其中proadm，特别是mr-proadm的水平指示受试者是否患有两种器官功能障碍或受试者是否患有三种或更多种器官功能障碍。
此外，本发明还涉及本发明的方法和试剂盒，其中proadm，特别是mr-proadm在受试者的样品中测定，并且其中proadm，特别是mr-proadm的水平指示受试者是否患有三种器官功能障碍或受试者是否患有四种或更多种器官功能障碍。
这里使用的参考水平通常是预定水平，即它已被预先确定为以后在护理点例如icu使用的参考。在此应理解，参考水平和确定的标志物水平(即在护理点例如icu为个体受试者确定的水平)可以根据确定水平的测定/方法而变化，表4也举例说明。例如，通过基于质谱法的方法确定的参考水平和确定的标志物水平可以不同于通过免疫测定法确定的各自水平。所附实施例证明标志物的水平可以通过几种方法确定，例如基于免疫测定和基于质谱的方法，例如表4，并且参考水平可以另外通过统计方法优化，例如youden指数(例如rota等，bmcmedicalresearchmethodology(2015)15:24；和ruopp等，biomj.2008年6月；50(3)：419-430))。因此，技术人员知道如何确定参考水平。例如，水平(包括参考水平)可以通过免疫测定来确定，例如通过测定受试者(或参考受试者)样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm例如mr-proadm的水平，所述受试者(或参考受试者)没有患有器官功能障碍或器官衰竭，或者确实患有器官功能障碍或器官衰竭。
在一个实施方案中，通过免疫测定确定至少一种组蛋白的参考水平。至少一种组蛋白的参考水平可以是约100ng/ml，更优选约90ng/ml，更优选约80ng/ml，更优选约70ng/ml，更优选约60ng/ml，更优选约50ng/ml，更优选约45ng/ml，更优选约40ng/ml，或最优选约35ng/ml。通过免疫测定确定的至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml，更优选约15ng/ml，更优选约20ng/ml，更优选约25ng/ml，更优选约30ng/ml，或最优选约35ng/ml。
至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约10ng/ml至约60ng/ml，更优选约10ng/ml至约40ng/ml，更优选约15ng/ml至约40ng/ml，或最优选约20ng/ml至约40ng/ml。
通过免疫测定确定的组蛋白h4的参考水平可以是约100ng/ml，更优选约90ng/ml，更优选约80ng/ml，更优选约70ng/ml，更优选约60ng/ml，更优选约50ng/ml，更优选约45ng/ml，更优选约40ng/ml，和最优选约35ng/ml。通过免疫测定确定的组蛋白h4的参考水平可以是约10ng/ml，更优选约15ng/ml，更优选约20ng/ml，更优选约25ng/ml，更优选约30ng/ml，或最优选约35ng/ml。
组蛋白h4的参考水平可以是约10ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约10ng/ml至约60ng/ml，更优选约10ng/ml至约40ng/ml，更优选约15ng/ml至约40ng/ml，或更最优选约20ng/ml至约40ng/ml。
如所附实施例中所述，通过免疫测定法测定proadm的示例性参考水平。例如，proadm的参考水平可以是约4nmol/l，更优选约5nmol/l，更优选约7nmol/l，更优选约8nmol/l，更优选约9nmol/l或特别优选约6nmol/l。
与示例性参考水平相比，标志物水平的增加可以指示受试者中的一种器官功能障碍、两种器官功能障碍、三种器官功能障碍、四种器官功能障碍、五种器官功能障碍或六种或更多种器官功能障碍。
此外，在另一个实施方案中，水平(包括参考水平)可以通过基于质谱的方法确定，例如确定相对定量或确定感兴趣的蛋白质或其片段的绝对定量的方法。
相对定量“rsrm”可以通过以下实现：
1.通过比较样品中检测到的给定靶片段肽的srm(选择的反应监测)特征峰面积与在至少两个、三个、四个或更多生物样品中所述靶片段肽的相同srm特征峰面积来确定靶蛋白的存在的增加或减少。
2.通过比较样品中检测到的给定靶肽的srm特征峰面积与在来自不同和单独生物来源的其他样品中来自其他蛋白质的片段肽产生的srm特征峰面积，确定靶蛋白的存在的增加或减少，其中两个样品之间的肽片段的srm标记峰面积比较例如对于每个样品中分析的蛋白质的量归一化。
3.通过比较给定靶肽的srm特征峰面积与来源于同一生物样品中不同蛋白质的其他片段肽的srm特征峰面积来确定靶蛋白的存在的增加或减少，以便将组蛋白的变化水平对于在各种细胞条件下不改变其表达水平的其他蛋白质的水平归一化。
此类测定可应用于靶蛋白的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定修饰肽的相对水平。
可以通过以下方式实现给定肽的绝对定量：
1.将来自单个生物样品中的靶蛋白的给定片段肽的srm/mrm(多反应监测)特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物的内部片段肽标准的srm/mrm特征峰面积进行比较。所述内标可以是来自被询问的靶蛋白的片段肽的标记合成形式或标记的重组蛋白。将该标准品在消化之前(重组蛋白必需)或消化后加入已知量的样品中，并且可分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽二者的srm/mrm特征峰面积，然后比较两个峰面积。这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(例如单、二、三甲基化)、瓜氨酸化、泛素化并且其中可以以与确定未修饰肽的绝对量相同的方式确定修饰肽的绝对水平。
2.肽也可以使用外部校准曲线进行定量。正常曲线方法使用恒定量的重肽作为内标，并将不同量的轻合成肽掺入样品中。需要使用类似于测试样品的代表性基质来构建标准曲线以考虑基质效应。此外，反向曲线方法避免了基质中内源性分析物的问题，其中将恒定量的轻肽掺入内源性分析物上面以产生内标，并且加入不同量的重肽以产生一组浓度标准。将要与正常曲线或反向曲线进行比较的测试样品中掺入与掺入用于产生校准曲线的基质中的内标物相同量的标准肽。
因此，技术人员知道如何确定标志物水平，特别是适当的参考水平，这也在所附实施例中举例说明。
如上所述，参考水平可以通过确定患有例如一种器官功能障碍、两种器官功能障碍、三种器官功能障碍或四种或更多种器官功能障碍的受试者样品中的至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平来确定。与代表一种或多种器官功能障碍的每种靶蛋白的参考水平相比，受试者样品中靶蛋白水平的增加则指示器官功能障碍的数量，其中在受试者的样品中器官功能障碍的数量高于参考水平所代表的器官功能障碍的数量。例如，表3和4中举例说明了至少一种组蛋白和/或proadm的参考水平指示至少四种器官功能障碍。因此，指示至少四种器官功能障碍的至少一种组蛋白的参考水平可以是约100ng/ml，更优选约90ng/ml，更优选约80ng/ml，更优选约70ng/ml，更优选约60ng/ml，更优选约50ng/ml，更优选约45ng/ml，更优选约40ng/ml，或最优选约35ng/ml。指示至少四种器官功能障碍的至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml，更优选约15ng/ml，更优选约20ng/ml，更优选约25ng/ml，更多优选约30ng/ml，或最优选约35ng/ml。
指示至少四种器官功能障碍的至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约10ng/ml至约60ng/ml，更优选约10ng/ml至约40ng/ml，更优选约15ng/ml至约40ng/ml，或最优选约20ng/ml至约40ng/ml。
指示至少四种器官功能障碍的proadm的参考水平可以是约4nmol/l，更优选约5nmol/l，更优选约7nmol/l，更优选约8nmol/l，更优选约9nmol/l或特别优选约6nmol/l。与这样的示例性参考水平相比，标志物水平的增加可以指示受试者中的至少四种器官功能障碍。
所提供方法的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析质量。灵敏性和特异性还取决于构成异常(例如器官功能障碍)或正常结果的定义。所提供方法的特异性和灵敏度还可以取决于表4中举例说明的所用参考水平。对于具有和不具有器官功能障碍的受试者，至少一种组蛋白和/或proadm的水平，优选mr-proadm的水平的分布可以重叠。在这样的条件下，测试并不准确度为100％地完全区分正常和功能障碍状态。技术人员知道这样的事实：受试者的病症本身或受试者的至少一个另外的标志物和/或参数可以帮助解释数据，并且该进一步的信息允许在重叠区域中更可靠的预后。因此，确定至少一个另外的标志物和/或参数的水平。还可以将至少一种另外的标志物和/或参数的水平与参考水平进行比较，其中受试者的所述至少一种另外的标志物和/或参数与所述参考水平的所述至少一种另外的标志物和/或参数的相应水平相比较相似或相同的值/水平指示受试者患有器官功能障碍的风险降低，和/或其中与所述参考水平的所述至少一种另外的标志物和/或参数的相应水平相比，所述至少一种另外的标志物和/或参数的更高或更低的水平/值指示具有器官功能障碍的风险增加。
因此，除了至少一种组蛋白和/或proadm之外，本发明的方法和试剂盒还可以包括确定至少一种另外的标志物和/或参数。
如这里所使用的，参数是可以帮助限定特定系统的特性、特征或可测量因素。参数是健康和生理学相关评估的重要因素，例如疾病/病症/临床病症风险，优选地器官功能障碍。此外，参数被定义为客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示。示例性参数可选自急性生理学和慢性健康评估评分(apache评分i-iv)、apacheii、简化急性生理学评分(sapsi-iii评分)、序贯器官衰竭评估评分(sofa评分)、简化急性生理学评分ii(sapsii评分)、死亡概率模型(mpmi-iii)、多器官功能障碍评分(mods)、治疗干预评分系统(tiss)、护理人力使用评分的九个等价物(nems)、世界神经外科学会联合会(wfns)评分、格拉斯哥昏迷量表(gcs)、年龄、性别、家族史、种族、体重、体重指数(bmi)、膀胱镜检查报告、白细胞计数、ct扫描、血压、心率、抗高血压治疗、液体摄入、喘息、体温、糖尿病的存在和目前的吸烟习惯。
如本文所用，诸如“标志物”、“替代物”、“预后标志物”、“因子”或“生物标志物”或“生物学标志物”的术语可互换使用并且涉及可测量和可量化的生物学标志物(例如，特定蛋白质或酶浓度或其片段、特定激素浓度或其片段、或生物物质或其片段的存在)，其作为健康和生理学相关评估的指标，例如疾病/病症/临床病症风险，优选地不良事件。标志物被定义为可以客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示。可以在样品中测量生物标志物(作为血液、血浆、尿液或组织测试)。所述受试者的至少一种另外的标志物可选自降钙素原、降钙素、内皮素-1(et-1)、精氨酸加压素(avp)、心房利钠肽(anp)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)、肌钙蛋白、脑利钠肽(bnp)、c反应蛋白(crp)、胰腺结石蛋白(psp)、在骨髓细胞1上表达的触发受体(trem1)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1、白细胞介素-24(il-24)其他ils、前列腺素(scd14-st)、脂多糖结合蛋白(lbp)、α-1-抗胰蛋白酶、基质金属蛋白酶2(mmp2)、基质金属蛋白酶9(mmp9)、基质金属蛋白酶7(mmp7))、嗜铬粒蛋白a、s100a蛋白、s100b蛋白和肿瘤坏死因子α(tnfα)或其片段。
在本发明的特定方面，所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数可选自醛缩酶b、和肽素、前内皮素-1、乳酸盐、降钙素原(pct)、序贯器官衰竭评估得分(sofa评分)、简化的急性生理学评分(sapsii)、肝素结合蛋白(hbp)、急性生理学和慢性健康评估ii(apacheii)评分、以及可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)。在此应理解，在受试者的样品中确定另外的标志物的特定水平。
在本发明的某些方面，所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数可以选自降钙素原、降钙素、内皮素-1(et-1)、精氨酸加压素(avp)、心房利钠肽(anp)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)、肌钙蛋白、脑利钠肽(bnp)、c反应蛋白(crp)、胰腺结石蛋白(psp)、骨髓细胞1上表达的触发受体(trem1)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1，白细胞介素-24(il-24)其他ils、前列腺素(scd14-st)、脂多糖结合蛋白(lbp)、α-1-抗胰蛋白酶、基质金属蛋白酶2(mmp2)、基质金属蛋白酶9(mmp9)、基质金属蛋白酶7(mmp9)、嗜铬粒蛋白a、s100a蛋白、s100b蛋白、肿瘤坏死因子α(tnfα)、年龄、性别、家族史、种族、体重、体重指数(bmi)、膀胱镜检查报告、白细胞计数、ct扫描、血压、心率、降压治疗、液体摄入、喘息、体温、糖尿病的存在、目前的吸烟习惯、急性生理学和慢性健康评估评分(apache评分i-iv)、简化的急性生理学评分(sapsi-iii评分)、序贯器官衰竭评估评分(sofa评分)、igsii、死亡概率模型(mpmi-iii)、多器官功能障碍评分(mods)、治疗干预评分系统(tiss)、护理人力使用评分的九个等价物(nems)、世界神经外科学会联合会(wfns)评分和格拉斯哥昏迷量表(gcs)。
如本文所用，“醛缩酶b”是指果糖-二磷酸醛缩酶b或肝型醛缩酶，其是i类果糖1,6-二磷酸醛缩酶的三种同工酶(a、b和c)之一。可以通过基于质谱的方法确定受试者样品中的醛缩酶b水平。
“和肽素”也称为“ct-proavp”或“加压素的c-末端部分”。血管加压素是一种强大的血管收缩剂。可以通过如下所述的免疫测定在受试者的血浆或血清中测量ct-proavp的水平。
如本文所用，“乳酸盐”是指在血液中测量的最大乳酸盐浓度。通常，每天或甚至更频繁地评估乳酸盐浓度。血液中的乳酸盐浓度可通过乳酸氧化酶分光光度法测定。
如本文所用，“降钙素原”或“pct”涉及跨越氨基酸残基1-116、2-116、3-116或其片段的肽。因此，降钙素原片段的长度为至少12个氨基酸，优选多于50个氨基酸，更优选多于110个氨基酸。pct可包括翻译后修饰，例如糖基化、脂质化或衍生化。降钙素原是降钙素和卡他卡林的前体。因此，在正常条件下，循环中的pct水平非常低(<约0.05ng/ml)。受试者样品中的pct水平可以通过如下所述的免疫测定来确定。
如本文所用，“序贯器官衰竭评估得分”或“sofa得分”是用于在重症监护病房(icu)中停留期间跟踪患者状态的一个评分。sofa评分是一种评分系统，用于确定一个人的器官功能或衰竭率。该评分基于六个不同的评分，每个各自用于呼吸、心血管、肝脏、凝血、肾脏和神经系统。平均和最高的sofa评分都是结果的预测因子。在icu的最初24至48小时内sofa评分的增加预示死亡率至少为50％至95％。评分低于9的预测死亡率为33％，而14岁以上的评分可接近或高于95％。
如本文所用，“sapsii”或“简化急性生理学评分ii”涉及用于对疾病或病症的严重性进行分类的系统(参见legalljr等人，anewsimplifiedacutephysiologyscore(sapsii)basedonaeuropean/northamericanmulticenterstudy.jama.1993；270(24)：2957-63)。sapsii评分主要由12个生理变量和3个与疾病相关的变量组成。点评分由12个常规生理测量值、关于先前健康状态的信息和在入住icu时获得的一些信息计算。sapsii评分可以在任何时间确定，优选在入院后第2天确定。“最差”测量被定义为与最高点数相关的度量。sapsii评分范围为0到163分。分类系统包括以下参数：年龄、心率、收缩压、温度、格拉斯哥昏迷量表、机械通气或cpap、pao2、fio2、尿量、血尿素氮、钠、钾、碳酸氢盐、胆红素、白细胞、慢性病和入院类型。死亡率与总sapsii评分之间存在s形关系。sapsii评分为29分时，受试者的死亡率为10％，sapsii评分为40分时死亡率为25％，sapsii评分为52分时死亡率为50％，sapsii评分为64分时死亡率为75％，sapsii评分为77分时死亡率为90％(legallloc.cit.)。
如本文所用，“肝素结合蛋白”或“hbp”是指从活化的嗜中性粒细胞释放的蛋白质，其是血管渗漏的有效诱导物。受试者样品中的hbp水平可以通过如下文所述的基于质谱仪的测定来确定。
如本文所用，“apacheii”或“急性生理学和慢性健康评估ii”是疾病严重程度分类评分系统(knaus等，1985)。它可以在患者入住重症监护病房(icu)后24小时内应用，并且可以基于例如12或14种不同的生理参数确定。
如本文所用，“可溶性fms样酪氨酸激酶-1”或“sflt-1”是酪氨酸激酶蛋白，其使得导致血管生长的蛋白质失活。可溶性flt-1(sflt-1)是vegf受体1(flt-1)的剪接变体，其由多种组织产生。受试者样品中sflt1的水平可以通过基于质谱的测定或通过免疫测定来确定。
如上所述，本发明的方法或试剂盒可包括确定至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平和另外的标志物和/或参数的水平。
例如，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者的sofa得分。
此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者的sapsii评分。
此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者样品中醛缩酶b的水平。
此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者样品中的pct水平。
此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者样品中的乳酸盐水平。
此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平以及受试者样品中的和肽素水平。
特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h2b的水平和所述受试者的sofa评分。特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h4的水平和所述受试者的sofa评分。
特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h2a的水平和所述受试者的sofa评分。特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h2a的水平和所述受试者的sapsii评分。特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h4的水平和所述受试者的sapsii评分。特别地，该方法可以包括确定所述样品中组蛋白h2b的水平和所述受试者的sapsii评分。
特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中所述醛缩酶b的水平。特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中的所述h2b水平。特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中的所述h2a水平。特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中的所述h4水平。特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中的所述乳酸盐水平。特别地，该方法可以包括确定所述样品中的proadm水平和所述样品中的所述h3水平。
如本文所用，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的方法适用于人和动物受试者。因此，所述受试者可以是动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、牛物种、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。最优选地，受试者是人。
如所附实施例所示，预测患有各种病症或疾病的受试者的器官功能障碍。因此，本文提供的方法可用于任何健康受试者或患有任何疾病或病症的受试者。在优选的方面，所述受试者患有疾病、病症或医疗状况。待测试的受试者可以是重症患者，优选地，其中所述受试者进入急诊室或其中所述受试者进入重症监护病房。
待测试的受试者可以是患有疾病或医学病症的受试者，并且其中所述疾病或医学病症选自心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、呼吸系统疾病、肝病、肾病免疫抑制、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身炎症反应综合征(sirs)、败血症、严重败血症和/或败血症性休克。
特别是，受试者患有败血症。更具体地，受试者患有严重的败血症和/或败血症性休克。
在本发明的上下文中，“系统性炎症”优选涉及特征在于释放促炎细胞因子和活化的先天免疫系统的病症，其可以由生物因子、化学因子或遗传因素引起。严重的“全身性炎症”可导致器官衰竭和死亡。
在本发明的上下文中，“sirs”是全身性炎症反应综合征，没有感染迹象。它包括但不限于以下临床表现中的一种以上：(1)体温大于38℃或小于36℃；(2)心率大于每分钟90次；(3)呼吸急促，表现为呼吸频率大于每分钟呼吸20次，或过度通气，如paco2小于32mmhg所示；和(4)白细胞计数的变化，如计数大于12,000/mm3、计数小于4,000/mm3，或存在超过10％的未成熟中性粒细胞(bone等，chest101(6):1644-55,1992)。
在本发明的上下文中，“败血症”是指对感染的全身反应。或者，败血症可被视为sirs与确认的感染过程或感染的组合。败血症可以表征为临床综合征，由感染和全身炎症反应的存在定义(levymm等人2001sccm/esicm/accp/ats/sisinternationalsepsisdefinitionsconference.critcaremed.2003年4月；31(4)：1250-6)。本文使用的术语“败血症”包括但不限于败血症、严重败血症、败血症性休克。在这种情况下，严重败血症是指与器官功能障碍、灌注不足异常或败血症引起的低血压相关的败血症。灌注不足异常包括乳酸性酸中毒、少尿和精神状态的急性改变。败血症引起的低血压的定义是，在没有其它低血压原因(如心源性休克)的情况下，收缩压低于约90mmhg或从基线降低约40mmhg或更高。败血性休克定义为严重败血症，尽管有足够的液体复苏，但败血症诱导的低血压持续存在，伴有灌注不足异常或器官功能障碍(bone等，chest101(6)：1644-55,1992)。
本文使用的术语“败血症”涉及败血症发展的所有可能阶段。
如本文所用，本发明范围内的“感染”是指由致病性或潜在致病性微生物侵入正常无菌组织或流体引起的病理过程，并且涉及细菌、病毒、真菌和/或寄生虫引起的感染。因此，感染可以是细菌感染、病毒感染和/或真菌感染。感染可以是局部或全身感染。此外，患有感染的受试者可同时患有一种以上的感染源。例如，患有感染的受试者可能患有细菌感染和病毒感染；病毒感染和真菌感染；细菌和真菌感染，以及细菌感染、真菌感染和病毒感染。
如本文所用，术语“样品”是从受试者获得的生物样品。术语“受试者的样品”和“来自受试者的样品”在本文中可互换使用。如本文所用的“样品”可以例如是指为了诊断、预后或评估感兴趣的受试者(例如患者)而获得的体液或组织样品。在此优选地，样品是体液样品，例如血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。特别地，样品是血液、血浆、血清或尿液。可以处理(预处理)样品，例如通过分级或纯化程序，例如，将全血分离成血清或血浆组分。此类预处理还可包括但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀或透析。预处理还可包括向溶液中添加化学或生物化学物质，例如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、洗涤剂、乳化剂、螯合剂。优选地，样品是血液样品，更优选血清样品或血浆样品。
在本发明的上下文中，“血浆”是离心后获得的含有抗凝血剂的血液的几乎无细胞的上清液。示例性抗凝血剂包括钙离子结合化合物如edta或柠檬酸盐和凝血酶抑制剂如肝素盐或水蛭素。通过离心抗凝血(例如柠檬酸盐、edta或肝素化血液)，例如在2000至3000g下离心至少15分钟，可以获得无细胞血浆。
在本发明的上下文中，“血清”是在允许血液凝结后收集的全血的液体部分。当凝固的血液(凝结的血液)离心时，可以获得血清作为上清液。
如本文所用，“尿液”是由肾脏通过称为撒尿(或排尿)的过程分泌并通过尿道排泄的身体的液体产品。
如上所述，在受试者的样品中测定至少一种组蛋白和/或proadm的水平。技术人员知道可用于确定样品中生物标志物水平的方法/测定。
如上所述，确定至少一种组蛋白的水平，特别地，确定组蛋白h2b、h4、h2a和/或h3的水平。特别地，可以确定组蛋白或组蛋白片段。这些片段在下文中举例说明。
这种组蛋白或其片段也可以代表游离组蛋白。例如，本发明的方法、试剂盒和抗体可以特别检测游离组蛋白的肽或表位。这种氨基酸段在本文中也称为组蛋白的中心区域或部分。在下文中，描述了肽或表位，其也可用于使用本文提供的方法检测游离组蛋白。
特别地，至少一种组蛋白可以是组蛋白h4，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：1的组蛋白h4的氨基酸残基22至102的序列的肽。特别地，至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：seqidno：1的残基46至56，seqidno：1的残基67至78，seqidno：1的残基60至67，seqidno：1的残基22至30，seqidno：1的残基67至78，seqidno：1的残基92至102，seqidno：1的残基22至34，seqidno：1的残基46至102，seqidno：1的残基46至55，seqidno：1的残基80至91，seqidno：1的残基24至35，和seqidno：1的残基68至77。例如，可以确定两种肽。
特别地，至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中肽由跨越seqidno：1的残基46至56和seqidno：1的残基67至78的氨基酸序列确定。
此外，至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：2的组蛋白h2a的氨基酸残基20至118的序列的肽。特别地，至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：seqidno：2的残基21至53，seqidno：2的残基21至29，seqidno：2的残基30至53，seqidno：2的残基120至129，seqidno：2的残基21至29，seqidno：2的残基82至88，seqidno：2的残基89至95，以及seqidno：2的残基100至118。
此外，至少一种组蛋白是组蛋白h3，并且其中至少测定了根据seqidno：3的跨越组蛋白h3的氨基酸残基27至62的序列的肽。此外，至少一种组蛋白是组蛋白h3，并且其中至少测定跨越seqidno：3的氨基酸残基27至37和/或跨越seqidno：3的氨基酸残基52至62的序列的肽。
此外，至少一种组蛋白是组蛋白h2b，并且其中至少测定了根据seqidno：4的跨越组蛋白h2b的氨基酸残基41至69的序列的肽。
此外，至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少测定选自seqidno：7、8、9和10的肽或其片段。
此外，至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中至少测定选自seqidno：11、12、13、14、15和16的肽或其片段。
在此应理解，可以测定一种、两种、三种、四种或更多种肽。
标志物的水平，例如至少一种组蛋白或其片段和/或proadm或其片段，可以通过可靠地确定标志物浓度的任何测定来确定。特别地，可以使用质谱(ms)和/或免疫测定，如所附实施例中举例说明的。如本文所用，免疫测定是通过使用抗体或抗体结合片段或免疫球蛋白测量溶液中大分子/多肽的存在或浓度的生物化学测试。
或者，代替抗体，特异性和/或选择性识别组蛋白序列、组蛋白表位和组蛋白结构构象的其他捕获分子或分子支架可包括在本发明的范围内。本文中，术语“捕获分子”或“分子支架”包括可用于结合靶分子或目标分子的分子，即来自样品的分析物(例如组蛋白和/或proadm)。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征方面充分成形，例如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体，以特异性结合靶分子或目标分子。因此，结合可以例如通过在捕获分子或分子支架和靶分子或目标分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或两种或更多种上述相互作用或共价相互作用来介导。在本发明的上下文中，捕获分子或分子支架可以例如选自核酸分子、碳水化合物分子、pna分子、蛋白质、肽和糖蛋白。捕获分子或分子支架包括例如适体、darpins(设计的锚蛋白重复蛋白)、affimers和类似物。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。根据本发明，抗体可以是单克隆抗体以及多克隆抗体。特别地，使用特异性结合至少一种组蛋白和/或特异性结合proadm的抗体。如果抗体对目标分子(例如至少一种组蛋白和/或proadm或其片段)比对含有目标分子的样品中包含的其他分子的亲和力至少高50倍、优选高100倍、最优选至少高1000倍，则认为抗体是特异性的。本领域众所周知如何开发和选择具有给定特异性的抗体。在本发明的上下文中，优选单克隆抗体。抗体或抗体结合片段与本文定义的标志物或其片段特异性结合。特别地，抗体或抗体结合片段与本文定义的至少一种组蛋白蛋白质的肽结合。因此，本文定义的肽也可以是抗体特异性结合的表位。此外，抗体或抗体结合片段用于本发明的方法和试剂盒中，其特异性结合proadm，特别是mr-proadm。示例性免疫测定可以是发光免疫测定(lia)、放射免疫测定(ria)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫吸附测定(elisa)、基于发光的珠测定、基于磁珠的测定、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(rapidtestformats)或稀有穴合物测定(rarecryptateassay)。此外，可以使用适用于即时测试和快速测试形式的测定，例如免疫层析带测试。
在本发明的某些方面，该方法是用于受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括：
(i)获得受试者的样品；
(ii)通过将样品与特异于至少一种组蛋白和/或proadm的表位的抗体或其抗原结合片段或衍生物接触，并检测抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述至少一种组蛋白和/或所述proadm之间的结合，检测所述受试者的样品中所述至少一种组蛋白的水平和/或所述肾上腺髓质素原(proadm)的水平；和
(iii)其中所述至少一种组蛋白的水平和/或所述肾上腺髓质素原(proadm)的水平指示所述器官功能障碍。
在本发明的某些方面，该方法是免疫测定，其包括以下步骤：
a)将样品与以下接触
(i)对组蛋白的或proadm的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和
(ii)对所述组蛋白或所述proadm的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和
b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述组蛋白或proadm的结合。
优选地，可以标记一种抗体，并且可以将另一种抗体结合至固相，或者可以选择性地结合至固相。在测定的一个特别优选的方面，一种抗体被标记，而另一种抗体与固相结合或者可以选择性地结合到固相上。第一抗体和第二抗体可以分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与所述至少一种组蛋白和/或与所述proadm的待检测的结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。标记系统可包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
在一个优选的实施方案中，该方法作为多相夹心免疫测定法进行，其中一种抗体固定在任意选择的固相上，例如，涂覆的试管壁(例如聚苯乙烯试管；涂层管；ct)或微量滴定板，例如由聚苯乙烯构成的，或者固定至颗粒，例如磁性颗粒，其中另一种抗体具有类似于可检测标记的基团或能够选择性地附着到标记上，并且用于检测形成的夹层结构。使用合适的固相暂时延迟或随后固定也是可能的。
此外，根据本发明的方法可以体现为均相方法，其中由抗体/多个抗体和待检测的标志物(例如组蛋白或proadm或其片段)形成的夹心复合物保持悬浮于液相。在这种情况下，优选的是，当使用两种抗体时，两种抗体都用检测系统的部分标记，如果两种抗体整合到单个夹心物中，则导致产生信号或触发信号。这些技术尤其体现为荧光增强或荧光猝灭检测方法。特别优选的方面涉及成对使用的检测试剂的用途，例如us4882733a、ep-b10180492或ep-b10539477和其中引用的现有技术中描述的检测试剂。以这种方式，仅检测在反应混合物中直接在单一免疫复合物中包含两种标记组分的反应产物的测量变得可能。例如，这种技术以商标名
此外，本发明的免疫测定方法可以优选利用对至少一种组蛋白和/或proadm的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。本文下文和上文描述了示例性肽，其可适用于测定proadm和/或至少一种组蛋白的水平。
例如，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白h4的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：1的氨基酸残基22至102的序列中的组蛋白h4的表位。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：1的氨基酸残基46至56的序列中存在的组蛋白h4的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对跨越seqidno：1的氨基酸残基67-78的序列中存在的组蛋白h4的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
例如，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白h2b的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：4的氨基酸残基41至69的序列中的组蛋白h2b的表位。
此外，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白h2a的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：2的氨基酸残基20至118的序列中的组蛋白h2a的表位。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白h2a的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：2的氨基酸残基21至53、20至118或120至129的序列中的组蛋白h2a的表位。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白h3的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：3的氨基酸残基27至62的序列中的组蛋白h3的表位。
更优选地，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白h4的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中表位选自跨越以下的的氨基酸序列：seqidno：1的残基22至30，seqidno：1的残基46至56，seqidno：1的残基67至78，seqidno：1的残基92至102，seqidno：1的残基22至34，和seqidno：1的残基46至102。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白h2a的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中表位选自跨越以下的氨基酸序列：seqidno：2的残基21至53，seqidno：2的残基21至29，seqidno：2的残基30至53，和seqidno：2的残基120至129。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno:4的残基41-69的组蛋白h2b的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno:3的残基27-37和/或跨越seqidno:3的残基52-62的组蛋白h3的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越由seqidno：2表示的组蛋白h2a序列的氨基酸残基21至53/或120至129的序列中存在的组蛋白h2a的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：1的氨基酸残基22至102的序列中存在的组蛋白h4的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白h2a、h2b或优选h3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：4的氨基酸残基41至69的序列中存在的组蛋白h2b的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白h2a、h4或h3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：2的氨基酸残基20至118的序列中存在的组蛋白h2b的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白h2b、h4或h3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：3的氨基酸残基27至62的序列中存在的组蛋白h2b的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白h2b、h4或h2a的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越seqidno：2的氨基酸残基21至53、120至129或20至118的序列中存在的组蛋白h2a的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白h3、h4或优选地h2b的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
本发明还涉及对如上详述的组蛋白蛋白质或其片段的表位具有特异性的抗体或其抗原结合片段或衍生物。成功用于检测组蛋白或proadm、优选mr-proadm的示例性抗体显示在所附实施例中。因此，本发明涉及对组蛋白h2b、h4、h2a、h3和/或proadm(优选mr-proadm)的表位具有特异性的抗体、其抗原结合片段或衍生物。抗体特异性结合的示例性表位或肽在本文中和下文中记载。
标志物例如至少一种组蛋白和/或proadm的水平也可以通过如所附实施例中所述的基于质谱(ms)的分析来确定。这种方法可以包括检测在所述生物样品中或来自所述样品的蛋白质消化物(例如胰蛋白酶消化物)中所述一种或多种修饰的或未修饰的片段肽(例如proadm和/或组蛋白的)的存在、量或浓度，并任选地用色谱方法分离样品，并将制备的和任选分离的样品进行ms分析。例如，选择的反应监测(srm)、多反应监测(mrm)或平行反应监测(prm)质谱可以用于ms分析，特别是用于确定至少一种组蛋白肽的量。本文中，术语“质谱法”或“ms”是指通过其质量鉴定化合物的分析技术。为了增强质谱的质量分辨和质量确定能力，可以在ms分析之前处理样品。因此，本发明涉及可以与免疫富集技术、与样品制备和/或色谱方法有关的方法，优选与液相色谱(lc)、更优选高效液相色谱(hplc)或超级高效液相色谱(uhplc)组合的ms检测方法。样品制备方法包括用于裂解、分级分离、将样品消化成肽、消耗、富集、透析、脱盐、烷基化和/或肽还原的技术。但是，这些步骤是可选的。分析物离子的选择性检测可以用串联质谱(ms/ms)进行。串联质谱的特征在于质量选择步骤(如本文所用，术语“质量选择”表示分离具有指定m/z或窄范围m/z的离子)，随后是所选离子的碎裂和所得产物(碎裂)离子的质量分析。
技术人员知道如何通过质谱法量化样品中标志物的水平。例如，如上所述，可以采用相对定量“rsrm”或绝对定量。
如本文所用，在本发明的上下文中的“诊断”涉及受试者中器官功能障碍和/或器官衰竭的识别和(早期)检测，并且还可以包括差别诊断。此外，器官功能障碍的严重程度的评估可以包括在术语“诊断”中。例如，评估受试者可能遭受多少器官功能障碍和/或器官衰竭。
“预后”涉及预测受试者患器官功能障碍和/或器官衰竭的结果或特定风险。这还可以包括估计所述受试者的恢复机会或不良结果的可能性。
本发明的方法也可用于监测。“监测”涉及跟踪已经诊断的器官功能障碍和/或器官衰竭、疾病、病症、并发症或风险，例如以分析疾病的进展或特定治疗对器官功能障碍/或器官衰竭、疾病或病症的进展的影响。
在本发明的上下文中，术语“治疗控制”是指对受试者的治疗性处理的监测和/或调整。
在本发明中，术语“风险评估”和“风险分层”涉及根据受试者的进一步预后将受试者分组到不同的风险组中。风险评估还涉及应用预防和/或治疗措施的分层。
如本文所用，术语“治疗指导”是指基于一种或多种生物标志物的值和/或临床参数和/或临床评分应用某些疗法或医学干预。
本发明还涉及试剂盒、试剂盒的用途和使用这种试剂盒的方法。本发明涉及用于实施本文上文和下文提供的方法的试剂盒。本文提供的定义，例如关于方法提供的定义，也适用于本发明的试剂盒。特别地，本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
(i)用于测定来自所述受试者的样品中至少一种组蛋白的所述水平的检测试剂，和/或
参考数据，其包括至少一种组蛋白的参考水平，并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述样品的至少一种组蛋白的增加的水平指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)用于确定所述样品中所述proadm水平的检测试剂，和/或
包括proadm的参考水平的参考数据，和
其中与proadm的参考水平相比，样品中proadm水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍。
本发明还涉及用于受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的试剂盒及其在其中的用途，
(i)其中在来自所述受试者的样品中确定至少一种组蛋白的水平，
其中将至少一种组蛋白的水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较，和
其中，基于所述样品中测定的至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平的比较，鉴定器官功能障碍；和/或
(ii)其中在所述受试者的所述样品中测定proadm的水平，
其中将proadm的水平与proadm的参考水平进行比较，和
其中，基于所述样品中测定的所述proadm水平与proadm参考水平的比较，鉴定器官功能障碍。
本发明还涉及所述试剂盒及其在受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制中的用途，
(i)其中所述试剂盒包括用于确定至少一种组蛋白的水平的检测试剂，和
其中至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)其中所述试剂盒包含用于测定受试者样品中proadm水平的检测试剂，和
其中proadm的水平指示受试者的器官功能障碍。
如本文所用，“参考数据”包括至少一种组蛋白和/或proadm，特别是mr-proadm的参考水平。可以将受试者样品中至少一种组蛋白和/或proadm的水平与试剂盒的参考数据中包含的参考水平进行比较。所确定的标志物水平的增加指示器官功能障碍。这里参考水平如上所述，并且也在所附实施例中举例说明。参考数据还可以包括参考样品，至少一种组蛋白的水平和/或proadm的水平与之比较。参考数据还可以包括如何使用本发明的试剂盒的说明书。
如本文所用，“检测试剂”等是适合于确定本文所述标志物例如至少一种组蛋白和/或proadm的试剂。此类示例性检测试剂是例如配体，例如抗体或其片段，其特异性结合本文所述标志物的肽或表位。这些配体可用于如上所述的免疫测定。用于免疫测定以确定标志物水平的其他试剂也可以包含在试剂盒中，并且在本文中被认为是检测试剂。检测试剂还可以涉及用于通过基于ms的方法检测标志物或其片段的试剂。因此，这种检测试剂也可以是用于制备用于ms分析的样品的试剂，例如酶、化学品、缓冲液等。质谱仪也可以被认为是检测试剂。根据本发明的检测试剂也可以是校准溶液，例如可以用于确定和比较标志物水平的校准溶液。
给出的定义和解释也比照适用于以下项目。在某些实施方案中，本发明还涉及以下项目。
1.本发明涉及受试者的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、风险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的方法，其中所述方法包括：
(i)测定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示器官功能障碍；和/或
(ii)测定所述受试者的样品中肾上腺髓质素原(proadm)水平，并且其中所述proadm水平指示器官功能障碍。
2.根据权利项目1所述的方法，其中
(i1)将至少一种组蛋白的所述水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较；和/或
(ii1)将proadm的所述水平与proadm的参考水平进行比较；和(iii)其中分别基于在步骤(i1)和/或(ii1)中的比较鉴定所述受试者中的器官功能障碍。
3.根据权利项目1或2所述的方法，其中
(i)与至少一种组蛋白的所述参考水平相比，至少一种组蛋白水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)与proadm的参考水平相比，proadm水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中与至少一种组蛋白的参考水平相比，至少一种组蛋白的水平的增加指示在所述受试者中的至少四种器官功能障碍。
5.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中与proadm的所述参考水平相比，所述受试者的proadm的水平的增加指示至少一种器官功能障碍。
6.根据项目2至5中任一项所述的方法，其中至少一种组蛋白的参考水平和/或proadm的参考水平是来自至少一个参考受试者的至少一种组蛋白和/或proadm的水平(视具体情况而定)，并且优选地其中所述至少一个参考受试者中的每一个是健康的，或优选地，其中所述参考受试者没有器官功能障碍或没有器官衰竭。
7.根据项目1至6中任一项所述的方法，其中所述proadm是中区肾上腺髓质素原(mr-proadm)。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2b、组蛋白h2a、组蛋白h3和/或组蛋白h4。
9.根据项目1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2b。
10.根据项目1至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白的参考水平为约10ng/ml至约100ng/ml和/或所述proadm的参考水平为约6nmol/l。
11.根据项目1至10中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定在所述样品中的选自下述的至少一种标志物：醛缩酶b水平、和肽素水平、乳酸盐水平、降钙素原(pct)水平、肝素结合蛋白(hbp)水平和可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)水平，和/或确定所述受试者的选自下述的至少一个参数：急性生理学和慢性健康评估ii(apacheii)评分、序贯器官衰竭评估评分(sofa评分)和简化急性生理学评分(sapsii)。
12.根据项目1至11中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定
(i)所述样品中组蛋白h2b的水平和所述受试者的sofa评分，
(ii)所述样品中组蛋白h4的水平和所述受试者的sofa评分，
(iii)所述样品中组蛋白h2a的水平和所述受试者的sofa评分，
(iv)所述样品中组蛋白h2a的水平和所述受试者的sapsii评分，
(v)所述样品中组蛋白h4的水平和所述受试者的sapsii评分，
(vi)所述样品中组蛋白h2b的水平和所述受试者的sapsii评分，
(vii)所述样品中的proadm水平和所述样品中醛缩酶b的所述水平，
(viii)所述样品中的proadm水平和所述样品中组蛋白h2b的所述水平，和/或
(ix)所述样品中的proadm水平和所述样品中所述组蛋白h2a的水平。
13.根据项目1至12中任一项所述的方法，其中所述器官功能障碍是选自循环性休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒的至少一种器官功能障碍。
14.根据项目1至13中任一项所述的方法，其中所述器官功能障碍是器官衰竭或至少一种器官衰竭。
15.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症。
16.根据项目1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者是重症患者，优选地，其中所述受试者进入重症监护病房。
17.根据项目1至16中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症，并且其中所述疾病或医学病症选自心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、呼吸系统疾病、肝病、肾病免疫抑制、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身炎症反应综合征(sirs)、败血症、严重败血症和/或败血症性休克。
18.根据项目1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是体液、血液、血浆、血清或尿液。
19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法确定所述至少一种组蛋白和/或proadm的水平：质谱(ms)、发光免疫测定(lia)、放射免疫测定(ria)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫吸附测定(elisa)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(rapidtestformats)和稀有穴合物测定(rarecryptateassay)。
20.根据项目19所述的方法，其中所述方法是免疫测定，且其中在均相或多相中进行测定。
21.根据项目19所述的方法，其中所述方法是包括以下步骤的免疫测定：
a)将样品与以下接触
(i)对第一组蛋白或proadm的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和
(ii)对所述第一组蛋白或proadm的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和
b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述第一组蛋白或proadm的结合。
22.根据项目21所述的方法，其中第一或第二抗体之一被标记，而另一抗体与固相结合或能够选择性地结合固相。
23.根据项目21或22所述的方法，其中第一抗体和第二抗体分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与所述至少一种组蛋白或与所述proadm的待检测的结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。
24.根据项目23所述的方法，其中所述标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
25.根据项目19所述的方法，其中所述ms分析方法是反应监测(srm)、多反应监测(mrm)或平行反应监测(prm)。
26.根据项目1-25中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：1的组蛋白h4的氨基酸残基22至102的序列的肽。
27.根据项目1至26中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：seqidno：1的残基47至59，seqidno：1的残基68至79，seqidno：1的残基60至67，seqidno：1的残基22至30，seqidno：1的残基67至78，seqidno：1的残基92至102，seqidno：1的残基22至34，seqidno：1的残基46至102，seqidno：1的残基46至55，seqidno：1的残基80至91，seqidno：1的残基24至35，和seqidno：1的残基68至77。
28.根据项目1-27中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：2的组蛋白h2a的氨基酸残基20至118的序列的肽。
29.根据项目1至28中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：seqidno：2的残基21至53，seqidno：2的残基21至29，seqidno：2的残基30至53，seqidno：2的残基120至129，seqidno：2的残基21至29，seqidno：2的残基82至88，seqidno：2的残基89至95，以及seqidno：2的残基100至118。
30.根据项目1-29中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h3，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：3的组蛋白h3的氨基酸残基27至62的序列的肽。
31.根据项目1至30中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h3，并且其中至少测定跨越seqidno：3的氨基酸残基27至37和/或跨越seqidno：3的氨基酸残基52至62的序列的肽。
32.根据项目1-31中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2b，并且其中至少确定了跨越根据seqidno：4的组蛋白h2b的氨基酸残基41至69的序列的肽。
33.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h2a，并且其中至少测定选自seqidno：7、8、9和10的肽或其片段。
34.根据项目1至33中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白h4，并且其中至少测定选自seqidno：11、12、13、14、15和16的肽或其片段。
35.一种用于执行根据项目1至34中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括
(i)用于测定所述样品中至少一种组蛋白的所述水平的检测试剂，和
参考数据，其包括至少一种组蛋白的所述参考水平，并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述样品的所述至少一种组蛋白的水平增加指示所述受试者的器官功能障碍；和/或
(ii)用于确定所述样品中所述proadm水平的检测试剂，和
包括proadm的参考水平的参考数据，和
其中与proadm的参考水平相比，所述样品中proadm水平的增加指示所述受试者的器官功能障碍。
36.根据项目35所述的试剂盒在项目1至35中任一项的方法中的用途。
31.根据项目30项所述的试剂盒用于所述受试者中的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、危险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的用途，
(i)其中在所述受试者的所述样品中确定至少一种组蛋白的所述水平，
其中将所述至少一种组蛋白的所述水平与至少一种组蛋白的所述参考水平进行比较，和
其中，基于所述样品中测定的至少一种组蛋白的所述水平与至少一种组蛋白的所述参考水平的比较，鉴定所述器官功能障碍；和/或
(ii)其中在所述受试者的所述样品中测定proadm的所述水平，
其中将所述proadm的水平与proadm的所述参考水平进行比较，和
其中基于所述样品中测定的所述proadm的水平与所述proadm的参考水平的比较来鉴定所述器官功能障碍。
32.试剂盒用于所述受试者中的器官功能障碍的诊断、预后、风险评估、危险分层、监测、治疗指导和/或治疗控制的用途，
(i)其中所述试剂盒包括用于确定至少一种组蛋白的水平的检测试剂，和
其中所述至少一种组蛋白的所述水平指示所述器官功能障碍；和/或
(ii)其中所述试剂盒包含用于测定受试者样品中proadm水平的检测试剂，和
其中所述proadm的所述水平指示所述器官功能障碍。
如这里所使用的，术语“包括”和“包含”或其语法变体应被视为至少指定所述的特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加特征、整数、步骤、组件或其组。该术语涵盖术语“由...组成”和“基本上由......组成”，二者被理解为仅指定所述的特征、整数、步骤或组件以排除任何附加特征。
因此，术语“包含”/“包括”/“具有”意味着可能/可以存在任何其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)。
术语“由......组成”是指不存在其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)。
当在本文中使用时，术语“基本上由......组成”或其语法变体应被视为指定所述的特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加的特征、整数、步骤、组件或其组，但仅当附加的特征、整数、步骤、组件或其组不会实质上改变所要求保护的组合物、装置或方法的基本和新颖特征时。
因此，术语“基本上由......组成”是指可以存在那些特定的其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)，即那些实质上不影响组合物、装置或方法的基本特征的组分。换句话说，术语“基本上由......组成”(其在本文中可与术语“基本上包含”互换使用)允许除了强制性组分(或同样地特征、整数、步骤等)之外在组合物、装置或方法中存在其他组分，只要该装置或方法的基本特征不受其他组分的存在的实质性影响。
术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、生物和生物物理领域的从业者已知的方式、手段、技术和程序，或者通过化学、生物和生物物理领域的从业者从已知方式、手段、技术和程序容易地开发的方式、手段、技术和程序。
术语“约”优选地表示指示数值的±10％，更优选指示数值的±5％，特别是指示的精确数值。
如本文所用，术语“约”是指指示数值的±10％，特别是指示数值的±5％。每当使用术语“约”时，还包括对指示的精确数值的特定参考。如果术语“约”与以整数量化的参数结合使用，例如给定核酸中的核苷酸数，则对应于指示数值的±10％或±5％的数字应为四舍五入到最接近的整数。例如，表述“约25个氨基酸”是指23至28个氨基酸的范围，特别是24至26个氨基酸的范围，并且优选地是指25个氨基酸的特定值。
诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅仅取决于测试的分析“质量”。灵敏度和特异性还取决于构成异常结果的定义。在实践中，接收者操作特征曲线(roc曲线)通常通过绘制变量的值与其在“正常”(即显然健康的没有产前病症或病症的个体)和“疾病”群体中的相对频率的关系来计算，“疾病”群体例如具有一种或多种器官功能障碍或衰竭的受试者。对于任何特定标志物(如mr-proadm)，具有和不具有疾病/病症的受试者的标志物水平的分布可能重叠。在这样的条件下，测试并不以准确度为100％完全区分正常与疾病，并且重叠区域可能表明测试无法区分正常与疾病。选择阈值，低于该阈值，测试被认为是异常的，高于该阈值，测试被认为是正常的，或低于或高于该阈值，测试表明特定病症，例如器官功能障碍。roc曲线下面积是感知测量值允许正确识别条件的概率的度量。即使测试结果不一定能给出准确数字，也可以使用roc曲线。只要可以对结果进行排名，就可以创建roc曲线。例如，可以根据程度对“疾病”样品的测试结果进行排名(例如，1＝低，2＝正常，3＝高)。该排名可以与“正常”群体中的结果相关联，并且创建roc曲线。这些方法在本领域中是众所周知的；参见，例如，hanley等1982.radiology143:29-36。优选地，选择阈值以提供大于约0.5、更优选大于约0.7、还更优选大于约0.8、甚至更优选大于约0.85、最优选大于约0.9的roc曲线面积。在该上下文中，术语“约”是指给定测量的+/-5％。
roc曲线的横轴表示(1-特异性)，其随着假阳性的比率而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性的比率而增加。因此，对于所选择的特定截止值，可以确定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。roc曲线下面积是测量的标志物水平允许正确识别疾病或病症的概率的量度。因此，roc曲线下面积可用于确定测试的有效性。
在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、优势比或风险比用作测试预测风险或诊断病症或病症(“患病组”)的能力的量度。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中阳性结果同样可能；大于1的值表示在患病组中阳性结果更可能；并且小于1的值表示阳性结果在对照组中更可能。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中的阴性结果同样可能；大于1的值表示测试组中阴性结果更可能；并且小于1的值表示阴性结果在控制组中更可能。
在优势比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中阳性结果同样可能；大于1的值表示在患病组中阳性结果更可能；并且小于1的值表示阳性结果在对照组中更可能。
在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中终点(例如死亡)的相对风险相等；大于1的值表示患病组的风险更大；并且小于1的值表示对照组中的风险更大。
技术人员将理解，将诊断或预后指标与诊断或未来临床结果的预后风险相关联是统计分析。例如，低于x的标志物水平可以表示患者比具有大于或等于x的水平的患者更可能患有不良结果，如通过统计学显著性水平所确定的。另外，标志物浓度从基线水平的变化可以反映患者的预后，并且标志物水平的变化程度可以与不良事件的严重性相关。通常通过比较两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性；参见，例如，dowdy和wearden，statisticsforresearch，johnwiley&sons，newyork，1983。本发明优选的置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
除非另有说明，否则使用已建立的重组基因技术方法，例如，在sambrook，russell“molecularcloning，alaboratorymanual”，coldspringharborlaboratory，n.y.(2001)中所述，其以全文通过引用并入本文中。
通过参考以下非限制性图和实施例进一步描述本发明。
附图说明
图1：标志物水平和临床评分相对于ofs数量的分布。对于每个由ofs数表示的组，箱形图显示标志物水平(组蛋白h2a(a)；组蛋白h2b(b)；组蛋白h3(c)；组蛋白h4(d)；和mr-proadm(e))或显示评分((f)：sofa评分)。每组患者的数量用括号(n)表示。
实施例1
方法
研究群体
‘centrehospitalieruniversitaire(chu)dedijonbourgogne’从2013年6月1日至2014年6月14日收治到内科重症监护病房(icu)的237位危重患者连续纳入临床研究中。年龄小于18岁的患者被排除在外。该研究得到了当地机构审查委员会的批准。在纳入之前，从患者本人或患者的近亲获得书面知情同意书。所有患者均表现出广泛的疾病，包括心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、呼吸系统疾病、肝病、肾病和免疫抑制，并出院或在医院死亡前进行监测。根据医疗记录、成像和微生物学结果的回顾性研究，两名独立医生根据国际标准化标准将入院当天的患者分类为非败血症(全身炎症反应综合征(sirs)或无sirs，严重败血症或败血症性休克(bone,balk等人1992)。在入院当天，即在最初的24小时内采集血样。记录基线人口统计学和临床数据，包括病史、体检结果、常规血液分析(如血培养)、非实验室诊断检查(如sirs标准、器官衰竭(of)标准)、治疗干预(如机械通气(mv)、血管加压剂和肾脏替代疗法(rrt))以及结果参数(例如停留时间、所有原因死亡率)。入院时计算序贯器官衰竭评估(sofa)评分(根据6个器官参数)以及简化急性生理评分(sapsii)(根据17个主要生理变量)(legall,lemeshow等1993；vincent,moreno等人1996)。
入院时记录了7种类型的急性器官衰竭，例如循环性休克(i)、血液衰竭(ii)、肝衰竭(iii)、神经衰竭(iv)、肾衰竭(v)以及呼吸衰竭(vi)和代谢性酸中毒(vii)。每个单一器官衰竭的标准如下使用。例如，循环性休克被定义为低于90mmhg的收缩动脉压，伴有外周灌注不足迹象或需要持续输注血管加压剂或正性肌力药。血液衰竭定义为低于100,000/mm3的血小板增多症。肝衰竭定义为大于2mg/dl的胆红素血症和/或天冬氨酸或丙氨酸转氨酶的酶水平大于500国际单位/升。神经衰竭被定义为格拉斯哥昏迷量表低于13。肾衰竭定义为尿量小于0.5ml/kg/h至少3小时和/或肌酸血症与之前的值相比上升超过50％。呼吸衰竭定义为动脉氧分压与吸入氧分数的比率(pao2/fio2)低于300mmhg的受试者，无论其选择的通气支持如何。代谢性酸中毒定义为乳酸盐水平低于2.5mmol/l、碱剩余(碱水平低于-2mequivalent/l)或碳酸氢盐水平(hco3-)低于18mmol/l。
生物标志物
使用超敏感测定法例如开发用于kryptor随机存取分析仪的那些，测定血浆样品中的mr-proadm(中区肾上腺髓质素原)、和肽素和pct(降钙素原)水平(thermoscientificb·r·a·h·m·s)。通过例如如下所述的选择反应监测或多反应监测(srm/mrm)测定，在血浆样品中测定组蛋白h2a、h2b、h3和h4的水平以及醛缩酶b的水平。通过lc-ms/ms技术(tsqquantiva质谱仪(ms)；thermofisherscientific)测量衍生自标志物的特定肽。发现每种肽的鉴定的肽序列及其碎片化离子(所谓的跃迁)是监测血液样品中标志物蛋白质水平的有用替代物。对可以同位素重标记的合成肽进行优化。关于信噪比选择最佳肽。对于每种肽，分别设置最佳保留时间和至少4个最好的跃迁。
肽和跃迁的示例性ms定量和选择
将5μl每种临床血浆样品加入到20μl的8m尿素/2.5％正丙醇/300mmtris/10mmdttph8.5中，并在37℃下温育1小时。将在1m碳酸氢铵中制备的500mm碘乙酸加入到每个样品孔中，并在黑暗中在室温下温育1小时。向每个孔中加入113ul的50mmtris/5mmcacl2ph8.0。将胰蛋白酶(thermofisherscientific)用150μl的25mm乙酸再水化，以1:10(总蛋白质含量：蛋白酶)的比例加入并在37℃下温育20小时。最后用另外的2ul甲酸淬灭消化。然后在注射前加入胰高血糖素(1ng/ul)和标准重肽。
srm测定在连接hplcultimate3000的三重四极杆质谱仪tsqquantiva(thermofisherscientific)上开发。反相分离在从5至40％b的20min线性梯度中进行，总运行时间为40分钟(溶剂a：水0.2％fa，溶剂b：acn0.2％fa)。线性梯度期间的流速设定为240μl/min。对于所有样品和曲线上的点，总注射体积为160μl。在50℃的温度下运行150mm×2.1mmaccucoreaq柱(thermofisherscientific)。
对重标记的合成肽进行优化，掺入13c-和15n-标记的精氨酸或赖氨酸(thermofisherscientific或newenglandpeptide)。对于每个跃迁都自动测试各个仪器参数，如碰撞能量、镜筒透镜和停留时间。在多次迭代之后，优化的肽和跃迁的列表(即最高强度信号和与其他跃迁的最小重叠)和相应的保留时间最终为每个选择的肽至少四个碎片跃迁。
通过在色谱分离中共洗脱轻和重标记的跃迁来鉴定肽。pinpoint(thermofisherscientific)和skyline(maccosslab)软件用于时间比对、跃迁的相对定量和靶向蛋白定量。
通过采用如下所述的示例性方法进行标志物的相对和绝对定量。
相对定量：
1.通过比较生物样品中检测到的给定肽的srm特征峰面积与在至少两个、三个、四个或更多生物样品中相同片段肽的相同srm特征峰面积来确定标志物的存在的增加或减少。
2.通过比较生物样品中检测到的给定肽的srm特征峰面积与在来自不同和单独生物来源的其他样品中来自其他蛋白质的片段肽产生的srm特征峰面积，确定标志物的存在的增加或减少，其中2个样品之间的肽片段的srm标记峰面积比较对于每个样品中分析的蛋白质的量归一化。
3.通过比较给定肽的srm特征峰面积与来源于同一生物样品中不同蛋白质的其他片段肽的srm特征峰面积来确定标志物的存在的增加或减少，以便将标志物的变化水平对于在各种细胞条件下不改变其表达水平的其他蛋白质的水平归一化。
4.将这些测定应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，例如组蛋白蛋白质，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定修饰肽的相对水平。
给定肽的绝对定量：
将来自单个生物样品中的标志物的给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物的内部片段肽标准的srm/mrm特征峰面积进行比较。
所述内标是来自被询问的标志物蛋白的片段肽的标记合成形式或标记的重组蛋白。将该标准品在消化之前或消化后加入已知量的样品中，并且分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽二者的srm/mrm特征峰面积，然后比较两个峰面积。
这种测定应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三甲基化)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的绝对量相同的方式确定修饰肽的绝对水平。
还通过免疫测定方法测量组蛋白h4的水平。因此，组蛋白h4免疫测定(h4ia)由以下组成：与magplex-cmicropheres(luminex，austintexas)偶联的针对合成肽(seqidno：1的氨基酸46-56)的小鼠单克隆抗体和针对合成肽(seqidno1的氨基酸67-78)的生物素化的绵羊多克隆抗体(pab)。合成肽(seqidno：1的氨基酸46-102)用作标准物质。在具有xponent4.2system(luminex，austintexas)的magpix上测量样品。使用来自jmp-12(sas统计软件，uk)的5参数逻辑回归分析数据。
使用来自rochediagnostics(法国meylan)的e501模块分析仪通过比色测定法测量血清乳酸盐水平。乳酸盐的参考限为0.5-2.2mmol/l。
统计分析
所有分析均使用软件r3.0.2进行。数据表示为括号中的中位数和四分位数范围[iqr]。由于所有分析的生物标志物显示高度右倾的分布，因此在包含到回归模型之前对值进行log10变换，以减少极值对模型拟合的影响。
低于定量限(loq)的值被低于loq的小值替换。丢失的值没有被替换。每个模型包括所有患者，其具有模型中所有变量的完整数据。p值<0.05被认为是显著的。箱形图中的框显示了下四分位数和上四分位数以及中位数(粗线)。细须延伸到最极端的数据点，其不超过离框的四分位数范围(iqr)的1.5倍。铰链之外的所有数据点都显示为异常值。使用对log10转化的生物标志物值的anova进行组间比较(临床评分未被转化)。使用tukey的诚实显著距离分析事后比较。对于二分结果变量，使用逻辑回归模型。显示的结果是嵌套似然比-χ2测试((l.r.χ2和p值)和c指数(harrel)。
通过youden指数的最大化来优化示例性截止值，其被定义为‘灵敏度+特异性-1’。使用r库‘optimalcutpoints’进行截止值优化。
结果
研究人群包括237名患者。由于死亡率数据的记录相互矛盾，必须将两名患者(一名没有sirs的患者，一名败血症患者)排除在分析之外。172名患者(73％)出现严重败血症或败血性休克，15名患者(6％)患有sirs，49名患者(21％)患有sirs。中位年龄为67[59-77岁]岁。大多数患者为男性(60％)。最常见的潜在病症是心血管疾病(35％)、糖尿病(31％)和恶性肿瘤(27％)，其次是呼吸系统疾病(16％)、肝脏疾病(12％)、肾脏疾病(12％)和免疫抑制(7％)。最常见的感染部位是下呼吸道(46％)和泌尿道(45％)。入院时sapsii评分(例如中位数56[40-69]点)和sofa评分(例如中位数9[6-12]点)增加。观察到的器官衰竭最常见于呼吸衰竭(61％)、循环休克(56％)和肾衰竭(41％)。因此，许多患者在icu住院期间需要机械通气(mv)(78％)、血管加压药(68％)和肾替代疗法(rrt)(37％)。所有原因icu死亡率为32％，icu住院时间中位数为5.4[2.5-10.6天]天。
以下分析仅限于患有器官衰竭的患者，因此限于如上所述的172名患有严重败血症和败血症性休克的患者。根据所有图和表中的急性器官衰竭数(1、2、3、4、5或6/7)对患者进行分组。
不同的选定生物标志物和临床评分与危重病患者中器官衰竭的数量增加有不同的相关性。在显示四种或更多器官衰竭的受试者中，组蛋白的水平显著增加(图1a至1d)。因此，受试者中器官衰竭的数量与组蛋白水平之间存在相关性。组蛋白h2a、h2b、h3和h4以及醛缩酶b在区分比较的具有一种、两种或三种器官衰竭的受试者中不如测试的其他生物标志物(见下文)。
此外，mr-proadm水平(图1e)或和肽素水平随着器官衰竭数量的增加而增加(例如从1至4种器官衰竭)。因此，受试者中器官衰竭的数量与mr-proadm的水平之间存在相关性。然而与组蛋白相比，mr-proadm和和肽素在区分具有多种衰竭例如4、5或6/7种器官的受试者方面较差(图1e)。对于作为乳酸的其他生物标志物和两个临床评分sofa和sapsii，它们的每个指定器官衰竭组的中值水平与1至6/7种器官衰竭的整个范围正相关(图1f)。
当比较器官衰竭组时，pct及和肽素能够区分具有统计学显著性的少量器官衰竭的患者，由p值<0.05表示，例如1种器官衰竭与3或4种器官衰竭比较(表1)。
在区分具有不同器官衰竭数量的患者方面，mr-proadm、乳酸盐、sapsii和sofa评分具有最宽的范围和能力(表1)。当比较1或2个器官衰竭与多达5个器官衰竭时，组蛋白h2a、h2b、h3和h4以及醛缩酶b较差。组蛋白在将患者分为3对4种器官衰竭的组中具有显著值，其中其他生物标志物如和肽素、乳酸盐、mr-proadm和pct较差(表1)。
表1：所选生物标志物的器官衰竭数与临床评分之间的成对组比较。
给出了每个生物标志物/得分的p值用于比较1、2或3个器官衰竭(of)与2、3、4、5或6/7ofs，如所示(事后分析使用tukey测试)。对于组的比较，具有p值<0.05的统计学显著的生物标志物/得分以灰色突出显示。
表1
通过逻辑回归模型计算区分具有多达3个ofs的患者与具有较高ofs数的患者的生物标志物/得分预测值。除临床评分外，mr-proadm、乳酸盐和组蛋白h2b显示出最佳预测结果(表2a)。
另外，确定另外的标志物(附加标志物)可以进一步改善受试者中器官衰竭的预测(表2b)。例如，sofa评分或sapsii评分改善了所用单一标志物例如组蛋白或mr-proadm的预测。此外，与用作单一标志物的这些标志物的预测即仅确定例如h2b或mr-proadm相比，mr-proadm和组蛋白(h2a、h2b、h3或h4)的组合进一步改善了器官衰竭的预测。该分析还表明，三种最佳表现单一标志物/评分(sofa、sapsii、mr-proadm)的最佳附加标志物包括组蛋白h2a、h2b、h4和醛缩酶b(表2b)。
对于组蛋白h2a、h2b和醛缩酶b，≥4个ofs患者的预测特异性最高(分别为92.39％、88.04％、91.30％)，同时灵敏度分别为45.00％、51.25％和45.00％，对于给定的截止值(参考水平)，如表3所示。通过质谱法测定这种截止水平或参考水平。此外，组蛋白h4的示例性参考水平也通过免疫测定(ia)确定(表4)。使用免疫测定法测定的那些水平的特异性和灵敏度与通过质谱法测定的参考水平相当。例如，35ng/ml的参考水平显示>80％的特异性和53％的灵敏度(表4)。通过使用临床评分sofa和sapsii或和肽素获得最高灵敏度(分别为87.50％、85.00％、78.21％)，相应的特异性分别为76.09％、72.83％和58.62％(表3)。
表2：单个生物标志物/评分模型(2a)以及两个生物标志物/评分的组合(2b)的≥4个ofs的结果的逻辑回归。
对于每个列出的生物标志物/评分，指示以下模型特征：分析的患者数量、结果≥4ofs的患者数量、似然比χ2以及c指数。该列表按似然比排序，范围从最高值到最低值。这些表中所有模型的p值<0.001。对于具有两个生物标志物/评分的组合的双变量模型(表2b)，显示所有模型具有附加物(l.r.χ2>7的增加)至相应的单变量模型。该表仅限于表2a中的三个最佳单一模型(sofa、sapsii和mr-proadm)。对于这些标志物/评分中的每一个，三个最佳附加模型以灰色突出显示。
表2a
表2b
表3：生物标志物的截止值和预测≥4个ofs的临床评分。
确定等于或高于给定截止值的生物标志物水平/评分值以预测具有指示的灵敏度和特异性的患者≥4个ofs(ppv：阳性预测值；npv：阴性预测值)。指示了参考水平(截止值)的单位。通过质谱法确定的参考水平以任意单位(au)提供。
表3
表4：组蛋白h4的截止值(参考水平)，用于预测≥4个ofs。
确定组蛋白h4水平/评分值等于或高于给定的截止值以预测具有指示的灵敏度和特异性的患者的≥4个ofs(ppv：阳性预测值；npv：阴性预测值)。通过使用质谱(ms)或免疫测定(luminex)技术测量来自患者的样品来产生组蛋白h4水平。由ms确定的参考水平以任意单位(au)提供，并且由免疫测定(luminex或ia)确定的参考水平以ng/ml提供。
表4：
本文引用的所有参考文献都通过引用完全并入。
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