本发明涉及水样中有机物的分析方法，具体涉及一种基于微波辅助破乳-分散液液微萃取分析水样中有机物的方法。
(二)
背景技术：
随着世界的快速发展，我们生活的环境发生较大的变化，对人类健康产生重要影响。一方面，由于世界工业化的快速蔓延，新技术的诞生，人口不断增加，为了努力满足新出现的需求而制造、消费大量的化学物品如农药。农药被广泛用于农业生产，以控制昆虫，真菌，细菌，杂草，线虫等对生产的影响。虽然农药在环境中浓度较低，但是通过水、土壤、食品等途径的富集还是会对人体健康造成危害。另一方面新鲜蔬菜和水果是人类均衡饮食的重要组成部分，它们可提供必需的营养物质(如维生素，碳水化合物，微量金属元素等)和矿物质。因此，植物对人类健康和福祉至关重要。植物中挥发性和半挥发性植物成分在植物生长过程中起重要作用，例如植物-植物竞争共进化、对害虫的防御、抗微生物病原体等。与主要植物成分(例如脂质，蛋白质和碳水化合物)相比，挥发性和半挥发性化合物的浓度在植物中的含量非常低。因此，在分析两类化合物时需要开发新型样品前处理技术来对其进行分离、富集以达到仪器的灵敏度要求。当代分析所面临的样品组成复杂、样品前处理占整个分析过程三分之二，可见它在分析中起到重要的作用，样品前处理技术是近十年来分析化学中重要的研究领域之一。
传统的前处理技术如索式萃取、液-液萃取、水蒸气蒸馏萃取等，这些技术的萃取效率低、处理时间冗长，且很多方法中大量使用的有毒有害有机溶剂会造成环境污染。为了克服液液萃取中有机溶剂用量大、耗时长、操作繁琐和富集效率低的问题。2006年由Rezaee等首次报道提出了分散液液微萃取技术。首先在样品溶液中加入数十微升萃取剂和一定体积分散剂，混合液经轻轻震荡后即形成一个水/分散剂/萃取剂的乳浊液体系，再经离心分离，用微量进样器取出萃取剂就直接进样分析。该方法集采样、萃取和浓缩于一体，避免了固相微萃取中可能存在的交叉污染问题，是一种操作简单、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理技术。传统的分散液液微萃取技术中使用密度大于水的卤代烷烃(毒性较大)为萃取剂，采用离心进行相分离，而分析实验室中离心机的规格限制了样品的体积。因此本发明主要对相分离(破乳)方式进行探索。相分离(破乳)指的是在萃取完成后通过某种途径使得萃取溶剂与水溶液样品的表面张力再次扩大而达到两相分离的过程。研究学者对相分离的方式做了如下改进：溶剂终止方式、磁性相分离以及冒泡辅助分离。
溶剂终止-分散液液微萃取是在低密度溶剂作为萃取剂的情况下设计的，主要是在乳化结束后继续加入分散剂使得两相分离。该方法在乳浊液形成之后继续加入分散剂，根据液液分配原理，分散剂的加入可能会使萃取剂进一步溶解于水溶液中而导致萃取效率降低；同时该方法中所需的分散剂体积也会有一定程度上的放大，而使得方法中增加了有机溶剂的使用量。
分散液液微萃取与磁性分散微固相萃取相结合的方法关键在于萃取溶剂与所制备的磁性颗粒之间的作用力，使得在外加磁场的作用下，磁性颗粒在与水相分离的同时将萃取溶剂也一同带出水相。例如，萃取剂正辛醇在涡旋辅助下充分与水溶液接触，将经过修饰的磁性颗粒放入水溶液中，由于正辛醇与此类磁性颗粒具有特殊的作用力使得萃取剂分散于颗粒表面，在外加磁场的作用力下实现两相分离之后，弃去水溶液，加入洗脱溶剂对目标分析物进行洗脱。只有某些特定的萃取溶剂和与其具有相互作用力的磁性颗粒的组合能够满足该方法的要求，使得该方法在萃取溶剂的选择上受到很大的限制。
浮选冒泡辅助分散液液微萃取方法利用超声辅助快速在溶液中生成二氧化碳的方式来实现相分离。具体萃取过程如下：萃取装置底部用硅胶塞密封，将分散剂和萃取剂的混合液注入装置中，然后再将样品水溶液快速注入装置。密闭顶部窄管，颠倒装置摇晃使得萃取剂与水溶液充分接触，在该步骤中，样品中的目标分析物被萃取到萃取剂的细小液滴中。然后通过底部的硅胶塞向装置中注射NaHCO3溶液，随后放入超声水浴中使得CO2生成速率加快以快速破除乳化。待气泡结束后，通过底部硅胶塞注入蒸馏水抬高液面，移取上层有机相。但是这种方法使用的装置大多具有长且细的支管，在清洗的过程中会遇到困难，使得样品和溶剂在装置壁的残留无法清除而影响之后的使用；而且这些装置在进行放大的时候也有一定难度，因此对样品体积的限制使得该方法的应用受到限制。
综上，目前分散液液微萃取中使用的破乳方法存在如下不足：(1)使用离心进行破乳，离心机的规格限制使得该方法在分析实验室内的应用受限；(2)使用溶剂终止法，分散剂体积的增加会使得所需的有机溶剂增多，同时降低萃取效率，此外有机溶剂体积的增加会对环境造成污染；(3)使用与磁性固相微萃取结合的方法，对于不同的萃取剂体系必须研究采用不同的磁性颗粒，具有较大的局限性；(4)冒泡辅助破乳所使用的萃取装置大多难清洗而易导致样品和试剂的残留。
(三)
技术实现要素：
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于微波辅助破乳-分散液液微萃取的前处理方法并且用于分析水样中有机物，本发明方法操作简便，破乳简单且微波破乳所需要的时间短，可以适用于不同体积样品的前处理操作，同时具有批量样品同时进行破乳操作的优点。
本发明的基本构思充分利用了微波辐射显著的加热效应以及极性分子在场内的转动活化效应的特点：(1)在微波辐射作用下，水溶液的粘度明显降低，促使有机溶剂的小液滴碰撞机会增加从而使得液滴积聚增大，加速了有机溶剂上浮的速率；(2)极性水分子在微波产生的高频磁场中旋转，破坏了原来有机溶剂-水界面的结构，使得有机溶剂的小液滴聚合机会增多。本发明基于此原理将微波辅助破乳与分散液液微萃取技术进行结合，将乳液置于微波场辐射，微波破乳的时间短，同时破乳效果明显加强。本发明的方法可以适用于不同体积样品的前处理操作，同时具有批量样品同时进行破乳操作的优点。
本发明的技术方案如下：
一种基于微波辅助破乳-分散液液微萃取分析水样中有机物的方法，所述水样中的有机物为多环芳烃类化合物或三唑类农药，所述多环芳烃类化合物为下列化合物中的至少一种：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘，所述三唑类农药为下列化合物中的至少一种：腈菌唑、戊唑醇、苯醚甲环唑；
所述方法包括如下步骤：
(1)样品前处理及检测
样品前处理：取待测水样，注入萃取剂，于40KHz超声乳化90～150s形成乳浊液，之后经200～500W微波处理30～90s破乳，得到分层的液体，取上层有机层，干燥后即完成前处理过程；所述待测水样与萃取剂的体积比为1：0.0025～0.003；所述萃取剂为甲苯、正己烷或环己烷；
样品检测：将经过前处理的样品注入气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到样品气相色谱图和质谱图，通过对照标准物质谱图对样品中所含有机物进行定性；
气相色谱条件为：色谱柱DB-5MS(长度30m×内径0.25mm×膜厚0.25μm)，初始柱温为60～180℃保持1～2min，然后以5～10℃/min升至200～230℃并且保持1～5min，再以2～10℃/min升至220～290℃并且保持0.67～6min；载气为高纯度的氦气(≥99.999％)，流速为1mL/min；进样口温度为280℃，不分流模式进样；
质谱条件为：选择离子扫描模式，离子阱温度为180℃，传输线温度为250℃，岐管温度为50℃，电子碰撞能量为70eV；
进样量：1μL；
(2)建立标准曲线
取所述有机物的标准物质，以甲醇为溶剂配制混合标准储备液(-4℃避光保存)，所得混合标准储备液经稀释(用去离子水)得到标准曲线工作溶液，按照步骤(1)所述前处理方法进行前处理之后，再于步骤(1)中的检测条件下注入气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到标准物质气相色谱图和质谱图，以气相色谱图中的标准物质特征峰面积值为纵坐标，标准曲线工作溶液中的标准物质浓度为横坐标，绘制标准曲线；
各个有机物的标准物质在标准曲线工作溶液中的浓度范围如下：
萘0.05～2.0μg·L-1；苊烯0.05～5.0μg·L-1；苊0.05～10.0μg·L-1；芴0.05～5.0μg·L-1；菲0.05～5.0μg·L-1；蒽0.05～10.0μg·L-1；荧蒽0.05～10.0μg·L-1；芘0.05～10.0μg·L-1；
腈菌唑1～100μg·L-1；戊唑醇1～100μg·L-1；苯醚甲环唑1～100μg·L-1；
各个有机物的标准物质在气相色谱图中特征峰如下：
萘8.81min；苊烯12.41min；苊12.84min；芴14.06min；菲16.32min；蒽16.55min；荧蒽19.15min；芘19.64min；
腈菌唑13.04min；戊唑醇17.74min；苯醚甲环唑25.07min；
(3)获取样品中有机物的含量
将步骤(1)所得样品气相色谱图中的有机物特征峰面积值代入步骤(2)所得标准曲线中，计算获得样品中有机物的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供了提取环境水样中多环芳烃和三唑类农药残留的有效方法；
2、首次使用微波辅助破乳技术与分散液液微萃取技术结合，克服了传统分散液液微萃取方法中使用离心进行破乳的问题，可以适用于不同体积样品的前处理操作，同时具有批量样品同时进行破乳操作的优点；
3、采用低密度有机溶剂作为萃取剂，克服了传统分散液液微萃取方法中使用密度大于水的卤代烷烃(毒性较大)为萃取剂，减少对环境的污染；
4、萃取装置易于清洗从而减少样品和溶剂的残留；
5、应用本发明能结合实际，为环境污染物和农药残留等环境和食品安全问题提供了一种检测手段。
(四)附图说明
图1为本发明建立的微波辅助破乳-分散液液微萃取技术的萃取过程示意图；
图2a、2b分别为实施例1中的微波辅助破乳萃取功率和时间优化结果；(其中Nap,ACY,Ace,FLU,PHE,ANT,FLT,PYR分别是指萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘)
图3a、3b分别为实施例1中的空白样品加标以及实施例1实际样品的总离子流图；(其中的数字标识依次为：1萘，2苊烯，3苊，4芴，5菲，6蒽，7荧蒽，8芘)
图4a、4b分别为实施例2中的微波辅助破乳萃取功率和时间优化结果；
图5a、5b分别为实施例2中的空白水样和加标水样以及实施例2实际样品的的总离子流图，A：空白水样，B：2.0μg·L-1加标水样，C：20.0μg·L-1加标水样，D：50.0μg·L-1加标水样，E:实际样品；(其中数字标识的依次为1腈菌唑、2戊唑醇、3苯醚甲环唑)
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：环境水样中多环芳烃的检测
(1)样品前处理及检测
量取20mL水样于萃取装置(平底玻璃瓶)中，用微量进样针将50μL萃取剂甲苯快速注入到水样中，接着放入超声装置中于40KHz超声乳化150s，此过程结束后可以观察到明显的乳白色溶液，即乳浊液的形成。然后将萃取装置放入微波反应器中，在500W的功率下保持30s使乳浊液破乳得到分层的液体。接下来将15％NaCl溶液加入侧管，从而提高液面。然后用气相色谱进样针取出全部的甲苯层(上层液体)，转移至装有无水硫酸钠的PCR管中进行除水。吸取干燥后的甲苯层1μL进入气相色谱-质谱联用仪进行分析。
气相色谱条件为：色谱柱DB-5MS(长度30m×内径0.25mm×膜厚0.25μm)，初始柱温为60℃保持2min，然后以10℃/min升至230℃并且保持5min，再以3℃/min升至285℃并且保持0.67min；载气为高纯度的氦气(≥99.999％)，流速为1mL/min；进样口温度为280℃，不分流模式进样。
质谱条件为：选择离子扫描模式，离子阱温度为180℃，传输线温度为250℃，岐管温度为50℃，电子碰撞能量为70eV。
(2)建立标准曲线
取萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘的混合标准溶液(各物质浓度200μg·mL-1)，用甲醇稀释100倍后再稀释20倍得到100μg·L-1的混合标准储备液，分别取所得混合标准储备液2、5、10mL用去离子定容至100mL得到2、5、10μg·L-1的标准溶液，继续用去离子水稀释一定倍数后得到1、0.5、0.2、0.1、0.05μg·L-1的标准曲线工作溶液，按照(1)中的前处理进行前处理后用气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到标准物质气相色谱图和质谱图，以气相色谱图中的标准物质特征峰面积值为纵坐标，标准曲线工作溶液中的标准物质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
各标准物质在气相色谱图中特征峰如下：
萘8.81min；苊烯12.41min；苊12.84min；芴14.06min；菲16.32min；蒽16.55min；荧蒽19.15min；芘19.64min。
分别得到如下标准曲线：
萘：Y＝181386X+1199
苊烯：Y＝112739X+753.4
苊：Y＝56343X-104.2
芴：Y＝120926X+810.7
菲：Y＝100975X+316.2
蒽：Y＝65526X+1057
荧蒽：Y＝24520X-99.64
芘：Y＝21685X+905.6
(3)获取水样中多环芳烃的含量
将步骤(1)所得水样气相色谱图中各多环芳烃的特征峰面积值代入步骤(2)所得标准曲线中，计算获得水样中各多环芳烃的含量，结果如下：萘0.684μg·L-1、苊0.138μg·L-1、芴0.094μg·L、芘0.392μg·L-1。
(4)方法评估
计算了优化条件下的检测限，定量限，线性范围以及相关系数，如表1所示。大部分多环芳烃的线性范围为0.05-10.0μg·L-1或0.05-5.0μg·L-1，只有萘的线性范围在0.05-2.0μg·L-1。所有目标分析物的相关系数在0.9981-0.9999的范围内。检测限和定量限分别为0.3-7.1ng·L-1和0.9-21.3ng·L-1。通过三种浓度(0.1、0.5、2.0μg·L-1)的加标空白水样品评估分析的准确度，平行重复测定五次，结果如表2所示。使用相对标准偏差(RSD)评估方法的精确度，所有目标分析物的相对标准偏差均在1.1-6.7％之间。
表1
表2
为了评估方法，与文献已有报道的方法进行了一系列的比较，包括操作时间，样品体积，萃取溶剂体积，线性范围和定量限等分析参数来评估。结果总结在表3中。与单滴微萃取相比，本发明所提出的方法操作时间更短，获得的定量限更低。此外，该方法的微波破乳时间(30秒)与其他提及的分散液液微萃取方法的破乳时间相比，破乳时间更短，这主要是因为破乳方式的改变，通过微波辐射进行相分离，克服了传统离心技术中存在的困难，同时具有批量样品同时进行破乳操作的优点。总体来说，这种方法被认为是一种快速、简单、高效、可靠、环保的预浓缩方法，无需离心，可以适用于不同体积样品的前处理操作，同时具有批量样品同时进行破乳操作的优点。
表3
实施例2：环境水样中三唑类农药残留的检测
(1)样品前处理及检测
量取20mL水样于萃取装置(平底玻璃瓶)中，用微量进样针将60μL萃取剂甲苯快速注入到水样中，接着放入超声装置中于40KHz超声乳化90s，可以明显观察到乳浊液的形成。然后将萃取装置放入微波反应器中，在200W的功率下保持90s使乳浊液破乳得到分层的液体。接下来将纯净水加入侧管，从而提高液面。然后用气相色谱进样针取出全部的甲苯层(上层液体)，转移至装有无水硫酸钠的PCR管中进行除水。吸取干燥后的甲苯层1μL进入气相色谱-质谱联用仪进行分析。
气相色谱条件为：色谱柱DB-5MS(长度30m×内径0.25mm×膜厚0.25μm)，初始柱温为180℃，保持1min，然后以5℃·min-1升温至200℃，保持1min，之后以2℃·min-1升温至220℃，最后以10℃·min-1升至290℃，保持6min；载气为高纯度的氦气(≥99.999％)，流速为1mL/min；进样口温度为280℃，不分流模式进样。
质谱条件为：选择离子扫描模式，离子阱温度为180℃，传输线温度为250℃，岐管温度为50℃，电子碰撞能量为70eV。
(2)建立标准曲线
分别称取腈菌唑0.0103g、戊唑醇0.0103g、苯醚甲环唑0.0104g的标准物质，先溶于100mL甲醇得到混标储备液，取所得混标储备液1mL，用去离子水稀释至500mL容量瓶中；再取稀释后的溶液1mL，用去离子水分别稀释200、100、50、20、10、4、2倍，得到7个标准曲线工作溶液，然后按照步骤(1)进行前处理并注入气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到标准物质气相色谱图和质谱图，以气相色谱图中的标准物质特征峰面积值为纵坐标，标准曲线工作溶液中的标准物质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
各标准物质在气相色谱图中特征峰如下：
腈菌唑13.04min；戊唑醇17.74min；苯醚甲环唑25.07min。
分别得到如下标准曲线：
腈菌唑：Y＝5170X+3260
戊唑醇：Y＝1713X-878.2
苯醚甲环唑：Y＝8608X-2760
(3)获取水样中三唑类农药的含量
将步骤(1)所得水样气相色谱图中各三唑类农药的特征峰面积值代入步骤(2)所得标准曲线中，计算获得水样中各三唑类农药的含量，结果如下：腈菌唑1.839μg·L-1、戊唑醇2.194μg·L-1、苯醚甲环唑1.973μg·L-1。
(4)方法评估
在最优条件下，对线性范围、相关系数、相对标准偏差、检测限、定量限以及富集倍数等参数进行了考察。标准曲线在7个不同浓度点进行三次平行测定后得到，结果列在表4中。如表4所示，三种三唑类农药的线性范围为1-100μg·L-1，相应的相关系数为0.998-0.999。当信噪比(S/N)分别为3和10得到的检测限和定量限分别为0.14-0.27μg·L-1和0.47-0.90μg·L-1。此外，方法的精密度通过相对标准偏差(n＝5)在目标分析物的浓度为20μg·L-1时测定得到，最终结果在5.4-8.6％的范围内。此外，该方法的富集倍数为425-636，因此，新开发的方法被认为是一种快速、高效、可靠，适用于水样中三唑类农药残留测定的方法。
表4