本发明属于乳制品安全检测技术领域，具体涉及高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法。
背景技术：
核苷酸是生物体内的一种极其重要的低分子的化合物，在生物体内有许多重要的生理生化作用，如：作为RNA和DNA合成的前体物质，参与信息传递；作为代谢的调节物质；作为生命过程的通用能ATP的组成部分，参与能量的传递；作为辅酶的成分，活化代谢中间产物，可调节平滑肌的收缩特性，调节血流量。促进铁质吸收及影响脂质代谢，改变肠道菌丛及提供肠道黏膜完整所需的营养，达到提升免疫功能的效果。一些研究表明，婴幼儿处于快速生长发育的时期，体内合成的核苷酸可能不能满足这些重要组织生长的需要，从而影响了婴幼儿的身体发育。很多国家制定了婴幼儿奶粉中核苷酸含量的相关标准，我国也规定了婴幼儿配方食品中允许添加的核苷酸的使用的总量为0.12g/kg-0.58g/kg。
目前，国内外关于核苷酸的定量检测方法主要包括高效液相色谱法、高效毛细管电泳法以及高效液相色谱-质谱联用法等。试样的前处理方法则包括固相萃取法、水解法、酶解法和沉淀杂质法。高效液相色谱和高效毛细管电泳法利用核苷酸具有紫外吸收的特性，采用紫外检测器进行检测，具有重现性好、成本较低；但是上述方法的缺陷在样品的前处理净化方面。缺点一、前处理方法相对简单，直接用超纯水进行提取，蛋白沉淀后，未进行进一步净化等处理，因此，杂质的干扰相对比较严重。其二、由于核苷酸的酸性强和极性大，色谱分离效果较差和峰型较差，杂质和目标物不能有效分离。这些问题是导致我国虽然早在2012年就颁布了GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》，规定了婴幼儿食品中核苷酸的含量，但直到2017年3月1日才颁布实施了核苷酸的检验检测GB5413.40-2016《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》。该方法规定了婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定的高效液相色谱法，但是方法前处理依然相对简单，只是采用了酸沉淀蛋白后，直接进行样品检测，在实际样品检测中，其基质干扰非常严重，特别是胞嘧啶核苷酸(简称CMP)在色谱中的保留时间仅为3.6分钟，这个时间刚好也是色谱基质的保留时间，如图1和图2所示，分别为GB5413.40-2016核苷酸标准物质色谱图及实际样品色谱图。因此在实际样品检测过程中CMP始终不能准确的定量测定。同时样品的前处理方法简单，几乎没有净化的步骤，因此样品的杂质干扰很大，这也加大了准确定量的难度。
由于核苷酸的酸性强和极性大，在常规色谱柱上保留能力比较差，目标物和杂质不能有效分离。虽然文献也有报道采用Hillic模式进行分离，但是也由于其强极性，样品很难进行有效的净化。而核苷相对于核苷酸其分子的极性较弱，通过采用碱性磷酸酯酶把核苷酸上的磷酸根酶解去除，水解核苷酸生成核苷，大大降低了检测的目标物的极性，有效增加了使各化合物在色谱柱上的保留时间，腺嘌呤核苷酸在碱性磷酸酯酶作用下水解为腺嘌呤核苷，从而降低了极性，采用了水解法将核苷酸水解成为核苷后，虽然大大降低了极性，但是乳粉基质复杂且添加了各种营养强化剂，仅采用蛋白质沉淀法达不到很好的效果，腺嘌呤核苷酸在碱性磷酸酶作用下水解成腺嘌呤核苷的过程如式1所示：
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)标准储备液的配制
核苷标准储备液：准确称取20mg各核苷分别加入相应的20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到1.0mg/mL各核苷标准储备液，于2-8℃下储存；
核苷酸标准储备液：准确称取20mg各核苷酸分别加入相应的20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到1.0mg/mL各核苷酸标准储备液，于2-8℃下储存；
2)混合中间标准液的配制
核苷混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1)中的各核苷标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合得到得核苷混合中间标准液，于2-8℃下储存；
核苷酸混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1)中的各核苷酸标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合，于2-8℃下储存；
3)内标储备液的配制
准确称取20mg 5-甲基胞嘧啶核苷和20mg 1-甲基鸟嘌呤核苷于20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到内标储备液，于2-8℃下储存；
4)工作内标液的配制
移取2mL步骤3)的内标储备液到10mL容量瓶中，用纯水定容，得工作内标液，于2-8℃下储存；
5)混合工作标准液：用移液管分别移取0.050mL、0.10mL、0.25mL、0.5mL和1.0mL步骤2)中的核苷混合中间标准液至5个相应的独立25mL容量瓶中，且在每个容量瓶分别加入0.5mL步骤4)的工作内标液，再向每个容量瓶中添加6.25mL的1M磷酸，用纯水定容，并充分摇动混合后，分别转移到自动进样器瓶内待HPLC分析；
6)样品溶液的配制
6.1)碱性磷酸酶溶液的配制
将0.02ml碱性磷酸酶用5.0mL 0.5M醋酸铵完全溶解，得到碱性磷酸酶溶液，在4℃冰箱保存备用；所配制的溶液中碱性磷酸酶溶液含量为12个单位/50μL；
6.2)Affi-gel 601胶浆体的配制
准确量取50mL的0.1M磷酸钾于100mL烧杯中，放入磁力搅拌棒置于搅拌器上搅拌，并加入5gAffi-gel 601胶搅拌均匀，盖上金属铝箔，持续搅拌4个小时后完全转移至100mL离心管中2000r/min离心3min，吸取上清液弃掉后得凝胶；用50mL 0.25M磷酸冲洗并强力涡旋重悬凝胶，2000r/min离心3min，吸取上清液弃掉；所得凝胶中加入50mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管重悬凝胶，2000r/min离心3min，弃去上清液，再向凝胶中准确加入75mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管分散凝胶，得到Affi-gel 601胶浆体，将Affi-gel601胶浆体分别按1.0mL的量装入带有扣盖的2.0mL小离心管中密封保存备用；
6.3)样品前处理
准确称取15g奶粉，用50℃温水充分溶解并定容100mL，准确移取5.0mL于25.0mL离心管中，加入3mL水涡旋3min混匀，准确加入500μL步骤4)的工作内标溶液、1mL 0.5M醋酸铵、50μL浓氨水、50μL 1M MgCl2、50μL 10mM ZnSO4和50μL步骤6.1)的碱性磷酸酶溶液，混匀后，在35-39℃的恒温摇床中以150r/min振荡2小时，取出离心管加入12.5mL的0.5M磷酸钾后用纯水稀释至25mL刻度，加盖，摇动混合，得待净化样品液；
6.4)样品净化
取步骤6.2)的装有1.0mLAffi-gel 601胶浆体的2.0mL小离心管，2000r/min离心2min后弃去上清液，准确加入步骤6.3)的待净化样品液1.0mL后加盖涡旋30min，再于100r/min振荡器中振荡15分钟，2000r/min离心2min，弃去上清液；加入1mL 0.25M磷酸钾缓冲液，涡旋离心管使Affi-gel 601胶浆体分散，2000r/min离心2min，弃去上清液，重复清洗1次，2000r/min离心2min，弃去上清液得凝胶；向凝胶中加入250μL 1M磷酸，强力涡旋离心管10秒分散凝胶并释放出核苷，打开离心管，加入750μL 0.1M磷酸，涡旋离心管8-12秒，得样品溶液，用0.22μm HPLC有机滤膜将样品溶液直接过滤入HPLC小瓶中待HPLC分析；
7)用高效液相色谱法测定步骤5)的混合工作标准液，测得各分析物的峰面积，其中尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和腺嘌呤核苷采用5-甲基胞嘧啶核苷作为内标物，鸟嘌呤核苷采用1-甲基鸟嘌呤核苷作为内标物，各核苷的峰面积与相应内标物的比值(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线；
8)用高效液相色谱法测定步骤6)的净化后的样品溶液，测得各分析物的峰面积，其中尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和腺嘌呤核苷采用5-甲基胞嘧啶核苷作为内标物，鸟嘌呤核苷采用1-甲基鸟嘌呤核苷作为内标物，测得各核苷的峰面积与相应内标物的比值代入步骤7)的标准曲线中，获得各核苷组分的质量浓度；通过公式(1)和公式(2)计算得出样品中核苷酸的总量：
X＝XCMP+XUMP+XGMP+XIMP+XAMP………(2)
X-样品中核苷酸的总量，单位为g/kg；
Xi-样品中核苷酸各组分的含量，分别是：XCMP、XUMP、XGMP、XIMP、XAMP，单位为g/kg；
Ci-样品溶液中核苷各组分的质量浓度，单位为mg/L；
Vi-样品溶液的体积，单位为mL；
n-样品稀释倍数；
fi-各核苷-核苷酸转化系数；
mi-样品的质量，单位为g。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于步骤1)中的核苷包括胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶核苷及1-甲基鸟嘌呤核苷，其中5-甲基胞嘧啶核苷及1-甲基鸟嘌呤核苷作为内标物；核苷酸包括5’-胞嘧啶核苷酸、5’-鸟嘌呤核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸及5’-次黄嘌呤核苷酸。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于各核苷及核苷酸的相关系数R2均在0.999以上。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于以3倍信噪比计算方法计算出最低检出限，以10倍信噪比计算方法计算出最低定量限，其中尿嘧啶核苷酸检出限为1.0mg/kg，定量限为3.0mg/kg、鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸的检出限均为0.4mg/kg，定量限均为1.0mg/kg。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于步骤6.3)中的浓氨水质量百分含量为30％。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于步骤2)的核苷酸混合中间标准液用于检测回收率及精密度，具体过程如下：准确称取15g奶粉样品，用50℃温水充分溶解并定容100mL，分别准确移取3份于3个25.0mL离心管中，每份5.0mL，3个离心管分别精密加入核苷酸混合中间标准液0.25mL、1.0mL、3.0mL，再分别加入2.75mL、2.0mL、0.0mL水，涡旋3min混匀，准确加入500μL步骤4)的工作内标液后，对样品进行前处理后进行HPLC检测，每个添加水平重复6次，各核苷酸的平均回收率在80.00％～111.23％之间，RSD在1.8％～6.3％。
所述的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，其特征在于高效液相色谱的检测条件如下：
液相色谱柱:250×4.6mm,5.0μm的BostonpHlex ODS column；
柱温:35℃；
进样量：15μL；
流动相：A相:离子对试剂离子对试剂包括2mM己烷磺酸和20.9mM醋酸铵，pH＝4.3；B相:6.0％乙腈-离子对试剂，离子对试剂包括2mM己烷磺酸和20.9mM醋酸铵，pH＝4.3；
梯度洗脱：0.0～6.0min，90％A，10％B，6.0～10.0min，55％A，45％B，10.0～12.0min，0.0％A，100.0％B，12.0～26.0min，0.0％A，100.0％B，26.0～26.5min，90.0％A，10.0％B，26.5～35.0min，90.0％A，10.0％B；
流速1.0mL/min；二极管阵列检测器检测波长：260nm。
通过采用上述技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过采用上述技术，采用了碱性磷酸酯酶水解核苷酸得到核苷，采用了硼酸凝胶净化技术进行净化后，建立一种硼酸基亲和凝胶对复杂基质样品中核苷进行吸附清洗后，再将目标核苷释放出来，达到了富集和净化目的，从而排除基质的干扰能够准确的测定核苷的含量，从而间接准确测得核苷酸的含量，在检测过程中采用了内标法进行定量，进一步的提高了定量的准确性，该方法准确度高、净化效果明显、重复性好，该方法适用于各种基质复杂的营养强化婴幼儿乳粉中核苷酸的准确检验。
附图说明
图1为GB 5413.40-2016核苷酸标准物质色谱图；
图2为GB 5413.40-2016核苷酸实际样品色谱图；
图3为本发明的7种核苷标准溶液高效液相色谱图；
图4为本发明的7种核苷样品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的高效液相色谱法测定婴幼儿营养强化奶粉中核苷酸含量的方法，具体包括如下步骤：
1.实验部分
1.1仪器与试剂
岛津LC20AD高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(日本岛津公司)；恒温振荡器(德国IKA公司)；高速离心机(美国Thermo公司产品)；旋转蒸发仪(德国IKA公司)；氮气吹干仪(天津市恒奥科技有限公司)；涡旋混合器(德国IKA公司)；
试剂：甲醇、乙腈：色谱级(德国Merck公司)；甲酸、乙酸铵、氨水：色谱级(美国SIGMA公司)；冰醋酸、磷酸(85％)、氢氧化钠、氢氧化钾(45％溶液)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、六水氯化镁、七水硫酸锌、1-己磺酸钠盐：分析纯(华东医药股份有限公司)，Affi-gel 601购自Bio-Rad Laboratories公司，碱性磷酸酯酶(来自牛肠黏膜)购自SIGMA公司，实验用水由Milli-Q型超纯水仪制备；
标准物质：5’-胞嘧啶核苷酸(CMP，≥99％)、5’-鸟嘌呤核苷酸(GMP，≥99％)、5’-尿嘧啶核苷酸(UMP，≥98％)、5’-腺嘌呤核苷酸(AMP，≥97％)、5’-次黄嘌呤核苷酸(IMP，≥98％)、胞嘧啶核苷(C，≥99％)、鸟嘌呤核苷(G，≥98％)、尿嘧啶核苷(U，≥99％)、腺嘌呤核苷(A，≥97％)、次黄嘌呤核苷(I，≥98％)均购自Sigma，5-甲基胞嘧啶核苷(MC，≥99％)购自Sigma、1-甲基鸟嘌呤核苷(MG，≥98％)购自carbosynth公司。
1.2标准溶液的配制：
1)标准储备液的配制
核苷标准储备液：准确称取20mg各核苷分别加入相应的20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到1.0mg/mL各核苷标准储备液，于2-8℃下储存；
核苷酸标准储备液：准确称取20mg各核苷酸分别加入相应的20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到1.0mg/mL各核苷酸标准储备液，于2-8℃下储存；
2)混合中间标准液的配制
核苷混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1)中的各核苷标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合得到得核苷混合中间标准液，于2-8℃下储存；
核苷酸混合中间标准液：用移液管分别移取2mL步骤1)中的各核苷酸标准储备液至相应的10mL容量瓶中，用纯水定容，并充分混合，于2-8℃下储存；
3)内标储备液的配制
准确称取20mg 5-甲基胞嘧啶核苷和20mg 1-甲基鸟嘌呤核苷于20mL容量瓶中，用50％甲醇水溶解定容，得到内标储备液，于2-8℃下储存；
4)工作内标液的配制
移取2mL步骤3)的内标储备液到10mL容量瓶中，用纯水定容，得工作内标液，于2-8℃下储存；
5)混合工作标准液：用移液管分别移取0.050mL、0.10mL、0.25mL、0.5mL和1.0mL步骤2)中的核苷混合中间标准液至5个相应的独立25.0mL容量瓶中，且在每个容量瓶分别加入0.5mL步骤4)的工作内标液，再向每个容量瓶中添加6.25mL的1M磷酸，用实验室水定容，并充分摇动混合后，分别转移到自动进样器瓶内待HPLC分析；
6)样品溶液的配制
6.1)碱性磷酸酶溶液的配制
将0.02ml碱性磷酸酶用5.0mL 0.5M醋酸铵完全溶解，得到碱性磷酸酶溶液，在4℃冰箱保存备用；所配制的溶液中碱性磷酸酶溶液含量为12个单位/50μL；
6.2)Affi-gel 601胶浆体的配制
准确量取50mL的0.1M磷酸钾于100mL烧杯中，放入磁力搅拌棒置于搅拌器上搅拌，并加入5gAffi-gel 601胶搅拌均匀，盖上金属铝箔，持续搅拌4个小时后完全转移至100mL离心管中2000r/min离心3min，吸取上清液弃掉后得凝胶；用50mL 0.25M磷酸冲洗并强力涡旋重悬凝胶，2000r/min离心3min，吸取上清液弃掉；所得凝胶中加入50mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管重悬凝胶，2000r/min离心3min，弃去上清液，再向凝胶中准确加入75mL 0.25M磷酸钾，强力涡旋离心管分散凝胶，得到Affi-gel 601胶浆体，将Affi-gel601胶浆体分别按1.0mL的量装入带有扣盖的2.0mL小离心管中密封保存备用；
6.3)样品前处理
准确称取15g奶粉，用50℃温水充分溶解并定容100mL，准确移取5.0mL于25.0mL离心管中，加入3mL水涡旋3min混匀，准确加入500μL步骤4)的工作内标溶液、1mL 0.5M醋酸铵、50μL浓氨水、50μL 1M MgCl2、50μL 10mM ZnSO4和50μL步骤6.1)的碱性磷酸酶溶液，混匀后，在35-39℃的恒温摇床中以150r/min振荡2小时，取出离心管加入12.5mL的0.5M磷酸钾后用纯水稀释至25.0mL刻度，加盖，摇动混合，得待净化样品液；
6.4)样品净化
取步骤6.2)的装有1.0mLAffi-gel 601胶浆体的2.0mL小离心管，2000r/min离心2min后弃去上清液，准确加入步骤6.3)的待净化样品液1.0mL后加盖涡旋30min，再于200r/min振荡器中振荡15分钟，2000r/min离心2min，弃去上清液；加入1mL 0.25M磷酸钾缓冲液，涡旋离心管使Affi-gel 601胶浆体分散，2000r/min离心2min，弃去上清液，重复清洗1次，2000r/min离心2min，弃去上清液得凝胶；向凝胶中加入250μL 1M磷酸，强力涡旋离心管10秒分散凝胶并释放出核苷，打开离心管，加入750μL 0.1M磷酸，涡旋离心管8-12秒，得样品溶液，用0.22μm有机滤膜将上述样品溶液直接过滤入HPLC小瓶中待HPLC分析；
1.3色谱条件：
液相色谱柱:Boston pHlex ODS column(250×4.6mm,5.0μm；Boston公司).；柱温:35℃；进样量15μL；流动相为A:离子对试剂(2mM己烷磺酸，20.9mM醋酸铵，pH＝4.3)、B:6.0％乙腈-离子对试剂(2mM己烷磺酸，20.9mM醋酸铵，pH＝4.3)，梯度洗脱：0.0～6.0min，90％A，10％B，6.0～10.0min，55％A，45％B，10.0～12.0min，0.0％A，100.0％B，12.0～26.0min，0.0％A，100.0％B，26.0～26.5min，90.0％A，10.0％B，26.5～35.0min，90.0％A，10.0％B；流速1.0mL/min。二极管阵列检测器检测波长：260nm；
1.4分析结果见图3和图4
本发明的7种核苷标准溶液高效液相色谱图如图3所示，本发明7种核苷样品溶液高效液相色谱图如图4所示，图3、图4中的C为胞嘧啶核苷，G为鸟嘌呤核苷，U为尿嘧啶核苷，A为腺嘌呤核苷，I为次黄嘌呤核苷，MC为5-甲基胞嘧啶核苷，MG为1-甲基鸟嘌呤核苷；
由图3可知，核苷酸经过水解后转化为核苷，降低了极性，采用了碱性化合物分析柱BostonpHlex ODS column作为分析柱，采用离子对试剂作为流动相，经过色谱条件优化后，各核苷均得到了基线分离。特别是在国家标准GB 5413.40-2016《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》中，胞嘧啶核苷酸(简称CMP)在色谱中的保留时间仅为3.6分钟，而经过本方法优化后，尿嘧啶核苷的保留时间推迟到了17.6min，很好的避开了基质干扰，而保留时间最短的尿嘧啶核苷保留时间也在9.3min，也没有基质干扰。图4中为经过凝胶净化后样品的液相色谱图。经过凝胶净化，有效的去除了样品中的杂质，目标物附近没有干扰，实现了准确的定量。
1.5方法学验证
1.5.1线性范围，检出限和定量限
配制各核苷系列浓度的标准溶液，测得各分析物的峰面积，其中尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和腺嘌呤核苷采用5-甲基胞嘧啶核苷作为内标物，鸟嘌呤核苷采用1-甲基鸟嘌呤核苷作为内标物，各核苷的峰面积与相应内标物的比值为(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，其曲线关系表达式如表1的方程(Regression equation，在0.4～8.0μg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，各分析物的相关系数R2均在0.9995以上。以3倍信噪比(S/N＝3)计算方法的最低检出限，以10倍信噪比(S/N＝10)计算方法的最低定量限，其中尿嘧啶核苷检出限和定量限为1.0mg/kg和3.0mg/kg、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷检出限和定量限为0.4mg/kg和1.0mg/kg，详见表1。
表15种核苷的回归方程、相关系数(R2)、检出限和定量限
1.5.2回收率和精密度
本实验采用标准加入法进行回收率和精密度的考察。准确称取15g奶粉，用50℃温水充分溶解并定容100mL，分别准确移取5.0mL完全溶解的样品于25.0mL离心管中，分别精密加入混合标准中间液0.25mL、1.0mL、3.0mL后(折算到样品中含量为0.0667、0.267、0.801g/kg，约为国家最低限量值的1/2倍、2倍和6倍)，分别加入2.75mL、2.0mL、0.0mL水，涡旋3min混匀，准确加入500μL内标工作溶液后，按照样品前处理方法进行同法处理，检测。每个添加水平重复6次，各核苷酸的平均回收率在80.00％～111.23％之间，RSD在1.8％～6.3％，详见表3。
实验中核苷酸通过水解变成核苷后测定核苷的量来间接确定核苷酸的量，因此核苷换算成核苷酸存在核苷-核苷酸转化系数。通过两者的分子量计算得到两者的转化系数如表2。例如：腺嘌呤核苷酸的分子量为347.06，腺嘌呤核苷的分子量为267.10，两者转化系数为1.2993。
表2核苷-核苷酸转化系数
试样中游离核苷酸各组分的含量Xi(CMP、UMP、GMP、IMP、AMP)按式(1)计算:
X＝XCMP+XUMP+XGMP+XIMP+XAMP………(2)
X-试样中核苷酸的总量，单位为克每千克(g/kg)；
Xi-试样中核苷酸各组分的含量(分别是:XCMP、XUMP、XGMP、XIMP、XAMP)，单位为克每千克(g/kg)；
Ci-试样溶液中核苷各组分的浓度,单位为毫克每升(mg/L)；
Vi-试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；
n-样液稀释倍数；
fi-各核苷-核苷酸转化系数；
mi-试样的质量，单位为克(g)。
表3乳粉中5种核苷酸的加标回收率结果(n＝6)
2实际样品测定
从市场购买了5批在标签中标识含有核苷酸的婴幼儿核苷酸营养强化奶粉中的核苷酸进行检测，利用本方法测定了样品中在最优的处理条件下进行处理，通过液相色谱法进行分析。5批样品标称含有核苷酸的量分别为0.13，0.18，0.18，0.25，0.45g/kg，测得量分别为0.137，0.178，0.192，0.261，0.440g/kg(n＝3)，测得数据符合国家标准GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》所规定的婴幼儿强化乳粉中核苷酸含量的规定。实验结果表明，本方法具有准确度高、稳定性好、适用性广，适用于各种复杂基质中核苷酸营养强化产品的检测。
3结论
本研究采用了碱性磷酸酯酶水解核苷酸得到核苷，采用了硼酸凝胶净化技术进行净化后，建立了一种测定核苷的含量间接准确得到核苷酸的含量的高效液相色谱法，实现了复杂基质中核苷酸准确定量检测，同时方法采用了内标法更加保证了检验结果的准确性和可靠性。方法使用于各种基质复杂的营养强化婴幼儿乳粉中核苷酸的准确检验。