本发明涉及分析化学领域和脂质组学研究领域，具体而言，涉及一种基于UHPLC-QTrap MS检测斑马鱼脑组织中鞘脂的方法。
背景技术：
斑马鱼(英文名：Danio rerio)，是一种常用的毒理学评价模式生物。与其它模式生物相比，斑马鱼具有天然的内在优势。首先，斑马鱼易获得、易饲养，可在实验室实现规模养殖。其次，斑马鱼传代周期短，可满足试验要求。最重要的是，斑马鱼的基因与人类基因相似度高达87％。基于以上优点，斑马鱼常作为模式生物对农药、兽药、持久性有机污染物及新型环境污染物等进行毒理学评价。
鞘脂(sphingolipids)是一类含有鞘氨醇骨架的两性脂，一端连接着一个长链的脂肪酸，另一端为一个极性的醇。鞘脂主要包括鞘磷脂、脑苷脂和神经节苷脂等，主要存在于动物的生物膜上，尤其是在神经细胞的轴突和髓鞘质含量尤为丰富。目前对于脂质组学的研究还处于起步阶段，对于鞘脂的研究也尚未成熟。但复杂的结构赋予了鞘脂许多重要的生理功能，如作为信号分子在细胞生长、分化、衰老和死亡中起到重要作用。当生物体或细胞受到威胁时，内部的鞘脂代谢会发生，从而在含量上表现出明显的上调或下调。所以，鞘脂对于化学污染物对生物神经系统的影响方面具有重要的指示性作用。
目前，对斑马鱼脑组织中鞘脂的定量检测方法还未见报道，所以开发斑马鱼脑组织中鞘脂的快速和灵敏的检测方法具有重要现实意义。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于UHPLC-QTrap MS(超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱)检测斑马鱼脑组织中鞘脂的方法，该方法的优点是简单，快速，准确，稳定，并且是首次以基于UHPLC-QTrap MS技术的非靶向代谢组学技术应用于斑马鱼不同鞘脂的检测与鉴别。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的一方面，本发明涉及一种基于UHPLC-QTrap MS检测斑马鱼脑组织中鞘脂的方法，其特征在于，在进行所述UHPLC测定斑马鱼脑组织蛋白的提取液时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为0.3v/v％～0.5v/v％的甲酸水溶液；
所述流动相B为体积比为40：(50～70)的0.07v/v％～0.13v/v％的甲酸水溶液：异丙醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的方法，以超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱技术为基础，采用AB SCIEX QTRAP 6500+，通过对其参数进行优化，建立了检测斑马鱼脑组织中46种鞘脂的定量方法。另外，采用线性离子阱质谱的信息依赖扫描(IDA)模式，还可以在定量分析的同时获得相关鞘脂的二级碎片质谱图，从而可以跟谱库进行匹配而实现准确定性的目的。本发明的方法可实现对上述鞘脂类物质的同步定量和定性有效检测，且耗时短、成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱图；
图2为本发明一个实施例中空白斑马鱼脑组织中鞘脂色谱图；
图3为本发明一个实施例中5μg/kg添加水平的鞘脂色谱图；
图4为本发明一个实施例中10μg/kg添加水平的鞘脂色谱图；
图5为本发明一个实施例中50μg/kg添加水平的鞘脂色谱图。
具体实施方式
根据本发明的一方面，本发明涉及一种基于UHPLC-QTrap MS检测斑马鱼脑组织中鞘脂的方法，其特征在于，在进行所述UHPLC测定斑马鱼脑组织蛋白的提取液时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为0.3v/v％～0.5v/v％的甲酸水溶液；
所述流动相B为体积比为40：(50～70)的0.07v/v％～0.13v/v％的甲酸水溶液：异丙醇。
优选的，所述流动相A为0.4v/v％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积比为40：60的0.010v/v％的甲酸水溶液：异丙醇。
在一些实施方式中，所述梯度洗脱的程序为：
0～3min时，流动相B 0v/v％～80v/v％；
3～8min时，流动相B 80v/v％～90v/v％；
8～15min时，流动相B 90v/v％～95v/v％；
15.1～17.0min时，流动相B 0v/v％；
在一些实施方式中，所述梯度洗脱的流速为0.3～0.5mL/min；还可以选择0.4mL/min。
在一些实施方式中，在进行所述UHPLC测定斑马鱼脑组织蛋白的提取液时，所述色谱柱的固定相为硅胶键合C18官能团；
在一些实施方式中，所述色谱柱规格长度为100～200mm，内径为2.1～5.0mm，填料粒径为1.7～5μm；
在一些实施方式中，所述色谱柱规格长度为150mm，内径为4.6mm，填料粒径为3.5μm；
在一些实施方式中，所述色谱柱为Waters X-bridge C18；
在一些实施方式中，所述色谱柱的柱温为28℃～32℃，还可以选择30℃。
在一些实施方式中，所述QTrap MS的条件为：
采集模式为正离子模式下的动态多反应监测模式；
离子源电压为5000V，离子源温度为600℃，雾化气为55psi，干燥气为55psi；
其中上述条件涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10％。
在一些实施方式中，采用所述QTrap MS的信息依赖扫描模式获得鞘脂的二级碎片质谱图。
在一些实施方式中，所述QTrap MS的质谱系统为AB SCIEX Qtrap6500+超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱系统。
在一些实施方式中，所述斑马鱼脑组织蛋白的制备方法包括：
1)通过蛋白沉淀剂裂解脑组织并沉淀蛋白；
2)加入氯仿震荡分层，取氯仿层；
可选的，重复步骤2)；
3)将所述氯仿层用氮气吹干。
在一些实施方式中，所述蛋白沉淀剂选自甲醇和/或乙腈。
在一些实施方式中，所述斑马鱼脑组织蛋白的制备方法还包括：
用甲醇复溶，过0.20～0.24μm微孔滤膜，还可以选择0.22μm。
由于动物组织中杂质很多，有机溶剂的理化性质差别较大，所以样品前处理是非常关键的部分。前处理的工作量和误差来源占到了整个检测过程的60％以上，重点有提取溶剂和辅助提取方式的选择、净化方式的选择等。本发明采用有机溶剂沉淀蛋白后氯仿分层，可有效去除组织中的核酸、水溶性杂质等物质，为后续检测打好基础。
在一些实施方式中，所述鞘脂选自下列成分中的至少一种：
N-乙酰基-D-鞘磷脂、N-己酰基-D-鞘磷脂、N-十二烷酰基-D-鞘磷脂、N-十六烷酰基-D-鞘磷脂、N-十七烷酰基-D-鞘磷脂、N-十八烷酰基-D-鞘磷脂、N-油酰基-D-鞘磷脂、N-十二烷酰基-D-二氢鞘磷脂、N-乙酰基-D-鞘氨醇、N-丁酰基-D-鞘氨醇、N-己酰基-D-鞘氨醇、N-辛酰基-D-鞘氨醇、N-癸酰基-D-鞘氨醇、N-十二烷酰基-D-鞘氨醇、N-十四酰基-D-鞘氨醇、N-十六烷酰基-D-鞘氨醇、N-十七烷酰基-D-鞘氨醇、N-十八烷酰基-D-鞘氨醇、N-油酰基-D-鞘氨醇、N-二十酰基-D-鞘氨醇、N-二十二酰基-D-鞘氨醇、N-二十四酰基-D-鞘氨醇、N-神经酸酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-辛酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-十二烷酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-十六烷酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-十八烷酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-油酰基-D-鞘氨醇、D-葡糖基-N-神经酸酰基-D-鞘氨醇、D-乳糖基-N-辛酰基-D-鞘氨醇、D-乳糖基-N-十二烷酰基-D-鞘氨醇、D-乳糖基-N-十六烷酰基-D-鞘氨醇、D-乳糖基-N-神经酸酰基-D-鞘氨醇、D-乳糖基-N-二十四酰基-D-鞘氨醇、N-十六烷酰基-神经酰胺-1-磷酸盐、N-油酰基-神经酰胺-1-磷酸盐、N-二十四酰基-神经酰胺-1-磷酸盐、N-二十四酰基--鞘氨醇-1-磷酸盐、N-乙酰基-D-二氢鞘氨醇、N-己酰基-D-二氢鞘氨醇、N-辛酰基-D-二氢鞘氨醇、N-十二烷酰基-D-二氢鞘氨醇、N-十六烷酰基-D-二氢鞘氨醇、N-油酰基-D-二氢鞘氨醇、N-二十四酰基-D-二氢鞘氨醇、N-神经酸酰基-D-二氢鞘氨醇。
本发明最多能给检测46种磷脂，详细信息见表1。
表1 46种鞘脂名称信息
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
斑马鱼脑组织中鞘脂的检测
1、实物样的制备：取5个鱼脑(约20mg)，进行空白扣除添加回收试验，同时设置空白对照和添加样品，添加浓度为5μg/kg、10μg/kg和50μg/kg，涡旋混匀，充分静置。将180μL甲醇加入盛有斑马鱼脑组织样品的2mL离心管中，然后在冰上进行充分研磨。将研磨均匀的脑组织转移到5mL离心管中，然后再加入180μL甲醇冲洗2mL离心管的管壁，同样转移到5mL离心管中。加入1.2mL氯仿，涡旋1min，超声提取3min。超声结束后，加入240μL水，振荡后使之出现分层。取氯仿层，重复加氯仿后提取。然后将两次取得的氯仿层合并，室温下氮气吹干。用1mL甲醇进行复溶，过0.22μm微孔滤膜。
2、数据采集：按照超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱仪器分析条件，进行样品的数据采集和分析。
超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱的仪器分析条件为：
液相条件：柱温为30℃，样品室温度为4℃，进样量为1μL，流速为0.4mL/min，流动相A为含0.1％甲酸的甲醇/水(40/60)，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇/异丙醇(40/60)，洗脱梯度为：0～3min，0～80％B；3～8min，80～90％B；8～15min，90～95％B；15.1～17.0min，0％B。
质谱条件：采集模式为正离子模式下的动态多反应监测(schedule MRM)模式，离子源电压为5000V，离子源温度为600℃，Gas1为55psi，Gas 2为55psi，每种鞘脂的离子对信息及解簇电压(DP)和碰撞能(CE)见表2。同时，采用线性离子阱质谱的信息依赖扫描(IDA)模式，还可以获得鞘脂的二级碎片质谱图，跟谱库匹配而实现准确定性目的。
表2 46种鞘脂的监测离子对、保留时间、DP和CE信息
实验结果表明，利用该方法可检测斑马鱼脑组织中的46种鞘脂含量，超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱图如图1所示。空白斑马鱼脑组织中46种鞘脂的的典型色谱图如图2所示，不同添加水平的典型色谱图见图3、4、5。结果见表3，回收率和精密度分别在82.4～117.9％和0.3～14.4％，其中44种鞘脂的检出限(LOD)均低于1μg/g，46种鞘脂的定量限(LOQ)均低于2μg/g(具体结果见表3)。由实验结果可知，该方法适用于斑马鱼脑组织中46种鞘脂的定量检测。
表3 46种鞘脂检测方法的准确度、精密度和灵敏度
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。