本发明涉及蜂蜜的鉴别技术领域，尤其涉及以迷迭香酸作为特征物识别夏枯草蜂蜜。
背景技术：
夏枯草为常见中药材，含有丰富的多糖类、酚酸类、黄酮类等活性成分，具有清火明目、散结消肿等功效，在抗肿瘤、抗炎抗菌、调节免疫等方面有明显的药理作用。夏枯草蜂蜜是蜜蜂采集夏枯草植物的花蜜并与自身分泌物混合后经充分酿造而成的天然甜味物质。由于蜂蜜的活性成分和药理作用大都来源于其植物源，因此夏枯草蜂蜜具有很大的开发价值和商品价值。本申请通过特征物建立一种识别夏枯草蜂蜜的方法，对于夏枯草蜂蜜品种鉴别具有重要意义，并为夏枯草蜂蜜的质量控制和真伪鉴别提供参考。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种夏枯草蜂蜜的鉴别方法，其主要贡献为，以迷迭香酸作为特征识别物进行鉴别。
优选的，采用液相-四级杆-飞行时间质谱对待测夏枯草蜂蜜样品进行检测，若所得飞行时间质谱图中在对应时间内含有所述迷迭香酸对应的特征峰时，则判定蜂蜜中含有夏枯草蜂蜜；不含有所述特征峰时，判定蜂蜜中不含有夏枯草蜂蜜。
优选的，所述特征峰为359.0772(允许偏差±5ppm)质量数准分子离子峰。
优选的，在飞行时间质谱图中包括以下一个或多个质量数准分子离子峰，137.0249(允许偏差±5ppm)、179.0352(允许偏差±5ppm)、187.0984(允许偏差±5ppm)、359.0772(允许偏差±5ppm)、723.5048(允许偏差±5ppm)、582.2619(允许偏差±5ppm)。
优选的，在检测前对所述夏枯草蜂蜜进行如下预处理：
1)将夏枯草蜂蜜按质量体积比1:4～6充分溶于pH为1.8～2.2的醋酸溶液中，形成蜂蜜溶液；
2)将活化后的大孔树脂添加到所述蜂蜜溶液中，搅拌吸附0.8～1.5h，得到吸附有有效成分的大孔树脂；
3)将步骤2)得到的吸附有有效成分的大孔树脂装填到洗脱柱中，先用pH为1.8～2.2的醋酸水溶液淋洗，再用纯水淋洗，最后用无水乙醇洗脱并收集洗脱液；
4)将所述洗脱液进行低温浓缩，去除乙醇后成固形物，将所述固形物复溶于水，用乙酸乙酯对其进行萃取，收集乙酸乙酯层，挥发溶剂，即得。
优选的，液相色谱检测的条件为：
色谱柱为C18色谱柱；流动相A为纯水，流动相B为甲醇；梯度洗脱的程序为：0-2min流动相B的体积分数增加至15％，2-10min流动相B的体积分数由15％增加至30％，10-25min流动相B的体积分数由30％增加到90％，25-30min，流动相B的体积分数维持在90％，30-31min，流动相B的体积分数下降至15％。上述方法可提高检测的精准度。
进一步优选的，所述色谱柱为proshell 120 SB-C18色谱柱，其规格为2.1mm×100mm，2.7μm；
优选的，流动相的流速为0.2mL/min；进样量为2μL；柱温为30℃。通过上述的液相色谱检测方法，可将夏枯草蜂蜜中的迷迭香酸进行理想的分离，为准确检测奠定基础。
优选的，所述四级杆-飞行时间质谱的检测条件为：ESI负离子，气体温度：350℃；气体流速:11L/min；喷雾气压力：40psig；毛细管电压：3500V；鞘气温度：350℃；鞘气流速：10L/min。上述方法可提高检测的灵敏度和目标离子的响应值。
作为优选的方案，本发明的方法包括如下步骤：
(1)夏枯草蜂蜜提取物的制备：
1)将夏枯草蜂蜜按质量体积比1:4～6充分溶于pH为1.8～2.2的醋酸溶液中，形成蜂蜜溶液；
2)将活化后的大孔树脂添加到所述蜂蜜溶液中，搅拌吸附0.8～1.5h，得到吸附有有效成分的大孔树脂；
3)将步骤2)得到的吸附有有效成分的大孔树脂装填到洗脱柱中，先用pH为1.8～2.2的醋酸水溶液淋洗，再用纯水淋洗，最后用无水乙醇洗脱并收集洗脱液；
4)将所述洗脱液进行低温浓缩，去除乙醇后成固形物，将所术固形物复溶于水，用乙酸乙酯对其进行萃取，收集乙酸乙酯层，挥发溶剂，即得；
(2)采用液相-四级杆-飞行时间质谱对待测蜂蜜样品进行检测；
液相色谱检测的条件为：
色谱柱为C18色谱柱；流动相A为纯水，流动相B为甲醇；梯度洗脱的程序为：0-2min流动相B的体积分数增加至15％，2-10min流动相B的体积分数由15％增加至30％，10-25min流动相B的体积分数由30％增加到90％，25-30min，流动相B的体积分数维持在90％，30-31min，流动相B的体积分数下降至15％；
四级杆-飞行时间质谱的检测条件为：
ESI负离子，气体温度：350℃；气体流速:11L/min；喷雾气压力：40psig；毛细管电压：3500V；鞘气温度：350℃；鞘气流速：10L/min；并判断在飞行时间质谱图中是否包括359.0772(允许偏差±5ppm)质量数准分子离子峰，以及以下一个或多个质量数准分子离子峰，137.0249(允许偏差±5ppm)、179.0352(允许偏差±5ppm)、187.0984(允许偏差±5ppm)、359.0772(允许偏差±5ppm)、723.5048(允许偏差±5ppm)和582.2619(允许偏差±5ppm)。
本发明的方法具有如下有益效果：
(1)本发明确定了迷迭香酸可以作为鉴别夏枯草蜂蜜的特征识别物，迷迭香酸在夏枯草植物和蜂蜜种含量很高，且标准样品易于获得，适合作为特征识别物。
(2)本发明通过LC-Q-TOF建立了蜂蜜中迷迭香酸的检测方法，此方法可以实现迷迭香酸的快速分析，对于夏枯草蜂蜜的鉴别有着重要意义。
附图说明
图1A为夏枯草植物提取物Q-TOF分析总离子图；
图1B为夏枯草植物提取物Q-TOF分析特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图；
图1C为采集的夏枯草蜂蜜提取物Q-TOF分析总离子图；
图1D为夏枯草蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图；
图2A为夏枯草提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图，
图2B为夏枯草蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；
图3A为迷迭香酸标准品Q-TOF分析特征离子259.0772提取色谱图；
图3B为迷迭香酸标准品Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；
图4A为油菜蜂蜜总离子流图
图4B为油菜蜂蜜特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图；
图5A为椴树蜂蜜总离子流图
图5B为油菜蜂蜜特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图
图6A为枣花蜂蜜总离子流图
图6B为油菜蜂蜜特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图
图7A为洋槐蜂蜜总离子流图
图7B为洋槐蜂蜜的特征离子359.0772(迷迭香酸)提取色谱图
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及对夏枯草蜂蜜迷迭香酸的检测，包括如下步骤：
(1)制备蜂蜜样品待测液
1)称取夏枯草蜂蜜50g，将蜂蜜放入500mL烧杯中，加入250mL pH＝2的纯水，超声溶解30min，得蜂蜜的水溶液；
2)向烧杯中加入50g经乙醇活化好的大孔树脂，搅拌吸附1h，静置弃去上清液，得吸附有有效成分的大孔树脂；
3)将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用100mL pH＝2的酸水和300mL纯水淋洗，后加入400mL乙醇洗脱，收集洗脱液；
4)将所述洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至固形物。固形物经10mL纯水溶解移至50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯震荡萃取。共萃取4次，10min/次。收集乙酸乙酯层氮气吹干，用2mL甲醇溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤，得待测液；
(2)采用LC-Q-TOF对夏枯草蜂蜜进行检测
液相色谱的条件为：
色谱柱：proshell 120 SB-C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；
流速：0.2mL/min；
流动相：纯水(A)，甲醇(B)；梯度洗脱：0-2min 15％B，2-10min15％-30％B，10-25min 30％-90％B，25-30min 90％B；30-31min，15％B
进样量2μL；
柱温：30℃；
Q-TOF条件为：
ESI负离子，气体温度(Gas Temp)：350℃；气体流速(Gas Flow):11L/min；喷雾气压力(Nebulizer)：40psig；毛细管电压：3500V；鞘气温度(Sheath Temp)：350℃；鞘气流速(Sheath Gas Flow)：10L/min；
扫描方式：MS scan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。
(3)检测结果
图1C为夏枯草蜂蜜提取物Q-TOF分析总离子图，然后采用Target MS模式做二级质谱，找到了一些准确分子量(M-H)为137.0249、179.0352、187.0984、359.0772、723.5048、582.2619这6个备选物质，将其生成分子式，并结合夏枯草植物报道的相关化合物数据，最终确定质量数为359.0772，分子式为C18H16O8入选，进一步确定其为迷迭香酸。
实验例1
为进一步明确和验证迷迭香酸可作为夏枯草蜂蜜中的植物源标记物，本实验例对夏枯草植物成分进行检测。
(1)制备夏枯草植物提取液：
将夏枯草粉碎，过筛。称取50g夏枯草粉末，按固液比1:30加入75％乙醇，浸泡30min，超声1h(温度55℃，功率200W，超声频率53kHz)。抽滤收集提取液，滤渣按上述条件下再提取一次，合并两次滤液，40℃旋转蒸发至固形物，乙醇复溶，用0.2μm滤膜过滤。
从图1A和1C可以看出，夏枯草植物提取物和夏枯草蜂蜜提取物有一些重叠峰，用分子特征软件形成分子式，并采用Target MS模式做二级质谱，在夏枯草植物提取物中也找到了准确分子量(M-H)为137.0249、179.0352、187.0984、359.0772、723.5048、582.2619这6个备选物质，将其生成分子式，并结合夏枯草植物报道的相关化合物数据，最终确定质量数为359.0772，可以看出夏枯草植物提取物和夏枯草蜂蜜提取物中均含有这两种物质(参见图1B和D，图2A和图2B)。通过购买标准品与提取样品中的物质比对，保留时间和准确质量数一致，确认夏枯草植物中也为迷迭香酸(见图3A和图3B，保留时间为22.210min，分子离子峰为359.0779)。
对比例1～4
采用与实施例1相同的方法对油菜蜂蜜、椴树蜂蜜、枣花蜂蜜和洋槐蜂蜜进行检测(图4-图7)，提取准确质量数359.0772(迷迭香酸)，在对应的保留时间内未检测出迷迭香酸特征离子。进一步说明迷迭香酸可以作为夏枯草蜂蜜的特征识别物。结果发现，以上4种蜂蜜中均没有迷迭香酸。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。