本发明涉及一种水质的生物毒性检测方法，属于生物毒性检测技术领域。
背景技术：
现有的水质生物毒性检测方法所采用的测试物种通常为发光菌、绿藻、大型溞或斑马鱼。这其中，基于发光菌的水质生物毒性检测方法因发光菌对生物毒性物质的敏感度过高而不适用于毒性当量较高的煤化工废水的检测。而在采用基于绿藻、大型溞或斑马鱼的水质生物毒性检测方法来检测煤化工废水的生物毒性时，都存在检测周期过长的问题，这严重限制了这三种水质生物毒性检测方法在煤化工废水生物毒性检测领域的应用。
技术实现要素：
本发明为解决现有的水质生物毒性检测方法不适用于对煤化工废水进行生物毒性检测的问题，提出了一种煤化工废水的生物毒性检测方法。
本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法采用四膜虫作为毒性测试物种。
作为优选的是，本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法包括：
步骤一、培养四膜虫，获得四膜虫溶液；
步骤二、计算四膜虫溶液的四膜虫密度，并判断四膜虫密度是否小于5×104cell/ml，当判断结果为是时，执行步骤一，否则，采用无菌培养液将预定体积的四膜虫溶液稀释10倍，获得四膜虫测试液；
步骤三、制备控制组、实验组、第一空白组和第二空白组；
控制组为四膜虫测试液，实验组为四膜虫测试液与待检测水样的混合溶液，第一空白组为无菌培养液，第二空白组为待检测水样；
步骤四、培养控制组、实验组、第一空白组和第二空白组；
步骤五、根据培养好的控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的吸光度，计算待检测水样对四膜虫的半数抑制浓度；
步骤六、根据所述半数抑制浓度，计算待检测水样的毒性当量。
作为优选的是，步骤一的具体流程为：
在120℃条件下，对培养基进行20分钟的灭菌；
在无菌环境下，对培养基进行冷却；
在无菌环境下，对培养基进行四膜虫接种；
在无菌、25℃环境下，对培养基进行培养；
每日摇晃培养基2～3次，直至四膜虫生长至对数期；
对四膜虫进行扩大培养，获得对数期的四膜虫溶液。
作为优选的是，在步骤一中，
四膜虫为四膜虫；
培养基为ppys培养基；
采用灭菌锅对培养基进行灭菌；
将培养基置于超净台上冷却；
将培养基置于恒温培养箱内培养。
作为优选的是，步骤二基于血球计数板和显微镜计算四膜虫溶液的四膜虫密度。
作为优选的是，在步骤三中，
采用滤膜对煤化工废水进行过滤，得到待检测水样；
采用实验孔板盛放控制组、实验组、第一空白组和第二空白组。
作为优选的是，在步骤三中，将控制组、实验组、第一空白组和第二空白组均置于实验孔板的中间区域，在实验孔板的边缘区域滴加无菌培养液。
作为优选的是，在步骤四中，控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的培养方式为：在无菌、25℃条件下，将控制组、实验组、第一空白组和第二空白组暗置暴露24小时。
作为优选的是，步骤五先采用酶标仪同时测定控制组、实验组、第一空白组和第二空白组在490nm处的吸光度，再根据抑制浓度计算公式获得多份抑制浓度数据；
抑制浓度计算公式为：
式中，μ为抑制浓度，odc为控制组中样本的吸光度，odbc为第一空白组中样本的吸光度，odt为实验组中样本的吸光度，odbt为第二空白组中样本的吸光度；
通过对多份抑制浓度数据进行拟合，获得量效曲线，并根据该量效曲线，获得半数抑制浓度。
作为优选的是，步骤六根据毒性当量计算公式和半数抑制浓度，计算得到待检测水样的毒性当量；
毒性当量计算公式为tu＝100％/ec50，式中，tu为毒性当量，ec50为半数抑制浓度。
本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法采用四膜虫作为毒性测试物种。由于四膜虫普遍存在于煤化工废水中，四膜虫对生物毒性物质具有一定的适应性，敏感度不会过高。因此，本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法适用于对煤化工废水进行检测。另一方面，与绿藻、大型溞或斑马鱼相比，四膜虫具有易于培养和繁殖周期短的优点。因此，与现有基于绿藻、大型溞或斑马鱼的水质生物毒性检测方法相比，本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法的检测周期较短，易于在煤化工废水的生物毒性检测领域获得普及和推广。
附图说明
在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法进行更详细的描述，其中：
图1为实施例提及的煤化工废水的生物毒性检测方法的流程框图；
图2为实施例提及的四膜虫的扫描电镜图；
图3为实施例提及的48孔板内控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的分布示意图，图中，t11至t26均为实验组的样本，c1至c3均为控制组的样本，bt1至bt6均为第二空白组的样本，bc1至bc3均为第一空白组的样本；
图4为实施例提及的四膜虫与大型溞的量效曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明所述的煤化工废水的生物毒性检测方法作进一步说明。
实施例：下面结合图1～图4详细地说明本实施例。
本实施例所述的煤化工废水的生物毒性检测方法包括：
步骤一、培养四膜虫，获得四膜虫溶液；
步骤二、计算四膜虫溶液的四膜虫密度，并判断四膜虫密度是否小于5×104cell/ml，当判断结果为是时，执行步骤一，否则，采用无菌培养液将预定体积的四膜虫溶液稀释10倍，获得四膜虫测试液；
步骤三、制备控制组、实验组、第一空白组和第二空白组；
控制组为四膜虫测试液，实验组为四膜虫测试液与待检测水样的混合溶液，第一空白组为无菌培养液，第二空白组为待检测水样；
步骤四、培养控制组、实验组、第一空白组和第二空白组；
步骤五、根据培养好的控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的吸光度，计算待检测水样对四膜虫的半数抑制浓度；
步骤六、根据所述半数抑制浓度，计算待检测水样的毒性当量。
本实施例的步骤一的具体流程为：
在120℃条件下，对培养基进行20分钟的灭菌；
在无菌环境下，对培养基进行冷却；
在无菌环境下，对培养基进行四膜虫接种；
在无菌、25℃环境下，对培养基进行培养；
每日摇晃培养基2～3次，直至四膜虫生长至对数期；
对四膜虫进行扩大培养，获得对数期的四膜虫溶液。
本实施例的步骤一，四膜虫为嗜热四膜虫；
培养基为ppys培养基；
采用灭菌锅对培养基进行灭菌；
将培养基置于超净台上冷却；
将培养基置于恒温培养箱内培养。
本实施例的步骤二基于血球计数板和显微镜计算四膜虫溶液的四膜虫密度。
本实施例的步骤三中，采用滤膜对煤化工废水进行过滤，得到待检测水样；
采用实验孔板盛放控制组、实验组、第一空白组和第二空白组。
本实施例的步骤三中，将控制组、实验组、第一空白组和第二空白组均置于实验孔板的中间区域，在实验孔板的边缘区域滴加无菌培养液。
本实施例的步骤四中，控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的培养方式为：在无菌、25℃条件下，将控制组、实验组、第一空白组和第二空白组暗置暴露24小时。
本实施例的步骤五先采用酶标仪同时测定控制组、实验组、第一空白组和第二空白组在490nm处的吸光度，再根据抑制浓度计算公式获得多份抑制浓度数据；
抑制浓度计算公式为：
式中，μ为抑制浓度，odc为控制组中样本的吸光度，odbc为第一空白组中样本的吸光度，odt为实验组中样本的吸光度，odbt为第二空白组中样本的吸光度；
通过对多份抑制浓度数据进行拟合，获得量效曲线，并根据该量效曲线，获得半数抑制浓度。
本实施例的步骤六根据毒性当量计算公式和半数抑制浓度，计算得到待检测水样的毒性当量；
毒性当量计算公式为tu＝100％/ec50，式中，tu为毒性当量，ec50为半数抑制浓度。
下面详细说明本实施例所述的煤化工废水的生物毒性检测方法的各个步骤：
步骤一：采用灭菌锅对ppys培养基进行灭菌，灭菌温度为120℃，灭菌时长为20分钟。灭菌完成后，将ppys培养基置于超净台中进行自然冷却。冷却完成后，在无菌条件下，对ppys培养基进行嗜热四膜虫接种。接种完成后，将ppys培养基置于25℃恒温培养箱中培养，每题摇瓶2～3次。当四膜虫生长至对数期时，将四膜虫溶液按比例转接到50ml的灭菌ppys培养基中，如此反复转接3次以上，以对四膜虫进行扩大培养，直至其进入对数期，备用。
步骤二、选取适量的四膜虫溶液，并按照2.5％的比例混合戊二醛。采用burker-turk型一次性计数板和光学显微镜观测混有戊二醛的四膜虫溶液，进而计算四膜虫溶液的四膜虫密度。四膜虫的扫描电镜图像如图2所示。本实施例的步骤二操作便捷，经实际操作后发现：接种后每隔24小时的四膜虫密度均可达到实验要求，后续无需连续计数观察，检测效率高。
步骤三：采用0.45微米滤膜对煤化工废水进行过滤，得到待检测水样。将待检测水样按照6个梯度的体积比例加入到48孔板的相应的位置。通过滴加四膜虫测试液将控制组和实验组定容至1ml。再取无菌培养液滴加入第一空白组和48孔板的边缘区域。本步骤采用等分移液器滴加四膜虫测试液。等分移液器能够实现将四膜虫测试液等分加入。本步骤通过设置第一空白组和第二空白组，能够有效地减小实验误差，大幅度地提高测试精准度和缩小平行样本的差异。除此之外，本步骤通过在48孔板的边缘区域加入无菌培养液的方式来减轻边缘效应引起的样品蒸发。经实验对比发现，相比于更节省样品的96孔板，48孔板的使用能够有效地防止煤化工废水的高色度引起的显色影响。48孔板内控制组、实验组、第一空白组和第二空白组的分布示意图如图3所示。
步骤四：经预实验对比，在煤化工废水水质较好的情况下，暴露24h的检测效果明显。当煤化工废水的生物毒性或者色度较高时需增大稀释倍数检测。煤化工废水中可能含有酚类，酚类易发生光反应而使待检测水样变色，进而对检测产生影响。因此，本步骤将控制组、实验组、第一空白组和第二空白组暗置培养。
步骤五：对多份抑制浓度数据进行origin拟合，得到量效曲线。
步骤六：本步骤所采用的毒性当量计算公式为tu＝100％/ec50，式中，tu为毒性当量，ec50为半数抑制浓度。如果未对待检测水样进行稀释而产生半数效应，即tu＝1，但按照本方案通常无法实现原水样测定，且实际废水检测结果均大于1，如出水水质较好，最小稀释倍数得不到半数效应，则根据ec20效应对应0.4tu(量效曲线可求得)，来计算实际水样的毒性单位。
本实施例所述的煤化工废水的生物毒性检测方法具有操作便捷、成本低廉、节约高效和可重现性高等诸多优点，能够为煤化工废水的毒性评估建立系统的指标，具有广阔的应用前景。
为了进一步验证四膜虫对煤化工废水的敏感性，本实施例还进行了后续实验，以对比煤化工废水对四膜虫和国际通用受试物种大型溞的毒性分级结果。
按照《水质物质对大型溞急性毒性测定方法》(gb/t13266-91)，将孵化6～24h、体长不大于1mm的幼体溞加入多浓度梯度的煤化工废水(利用大型溞测试稀释液配制)暗置培养48h后计数，并根据下式计算抑制浓度：
式中，抑制数为轻微振动培养液、15s内无明显运动的大型溞数量。
表1为四膜虫酶标仪输出的检测结果：
四膜虫酶标仪输出的检测结果
根据表1可知平行样本之间有很强的关联性。
图4为四膜虫与大型溞的量效曲线图。两种受试生物的量效曲线拟合度均高于95％，说明四膜虫方法的合理性，且ec50接近重合，通过计算tu值，tu大型溞＝2.726，tu四膜虫＝2.240，毒性分级均为急性毒性，说明两种生物的敏感性较为接近。本实施例所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。其中，供试四膜虫为中科院武汉水生所提供的嗜热四膜虫sb210，对比试验的大型溞来自中科院沈阳生态研究所，实验所用等分移液器为德国brand出厂的handystep等分移液器，酶标仪为美国biotek出厂的elx800型酶标仪，细胞计数板为日本watson出厂的burker-turk型细胞计数板。
以下是实际实验中的操作：
采用自制ppys培养基(质量浓度为1％的蛋白胨、0.1％的酵母浸提粉、0.2％的葡萄糖)，按比例配制培养基，根据实际测试结果，本方案在1l培养基中加入50～100mg罗红霉素，可有效抑制后期测试样本染菌且对四膜虫生长无明显影响，然后将培养基放入灭菌锅于120℃下灭菌20min。取出后放入超净台冷却，于无菌条件下进行接种。接种完成，置于恒温培养箱中培养。培养条件是25℃±0.5℃避光培养，每日振荡3次，将生长24h至对数期的虫液按2％比例转接到50ml灭菌培养基中，如此反复转接3次对四膜虫进行扩大培养，生长至对数期，备用。
测试条件的选取
测试周期在预实验中按6h、12h与24h实验结果对比，发现水样毒性较高且稀释倍数较低时6h、12h抑制已较明显，但控制组四膜虫生长往往不足以与实验组吸光度区分，24h暴露后控制组四膜虫浓度引起的吸光度足够与实验组吸光度区分。利用等分移液器，可实现微生物等分加入，同时第一空白组和第二空白组的设置可以有效减少系统误差，大幅度提高测试精准度和缩小平行样本的差异。最后外边缘加入的培养液可有效减轻边缘效应引起的样品蒸发。此外，实验对比发现，相比于更节省样品的96孔板，48孔板的利用可有效防止煤化工废水高色度引起的显色影响。
量效曲线的绘制
由于每次试验均至少有两组平行样，可取测试的平均值绘制量效曲线，为提高实验准确度，也可以采用两个48孔板同时测试，筛选其中数据较合理的3组按照标准误差绘制量效曲线。根据输出的ec20、ec50值结合tu计算公式得出水样的毒性单位和分级。
虽然在本文中参照了特定的实施方式来描述本发明，但是应该理解的是，这些实施例仅是本发明的原理和应用的示例。因此应该理解的是，可以对示例性的实施例进行许多修改，并且可以设计出其他的布置，只要不偏离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。应该理解的是，可以通过不同于原始权利要求所描述的方式来结合不同的从属权利要求和本文中所述的特征。还可以理解的是，结合单独实施例所描述的特征可以使用在其他所述实施例中。