本发明涉及拉曼光谱检测技术领域，具体为一种拉曼光谱检测土壤氨基 酸化合物中异构体的方法。
背景技术：
随着科学技术发展突飞猛进，各种新技术、新发明层出不穷，并被迅速 应用并服务于社会，大大促进了经济的发展，氨基酸是土壤有机质的重要组 成部分，一般占土壤有机氮含量的20％～50％，在土壤碳、氮循环过程及作 物养分供给中具有重要地位。除甘氨酸外，土壤氨基酸均以手性异构体存在， 其中L-氨基酸在数量上占有绝对优势，主要构成蛋白质或多肽；D-氨基酸尽 管数量很少，但由于来源不同，具有各自独特的生态化学和生物化学意义。 非生物即异构化来源的D-氨基酸可用以研究土壤生态化学过程；生物来源的 D-氨基酸主要参与细菌细胞壁的构建，如D-谷氨酸、D-丙氨酸等是细菌细胞 壁肽聚糖的重要成分，在生物地球化学研究中，微生物来源的氨基酸手性异 构体可作为土壤微生物标识物，通过D-和L-异构体数量的比例变化评价细菌 在碳氮循环中的相对贡献。然而，在氨基酸代谢过程中，合成与分解作用同 时发生且存在动态平衡，即氨基酸不仅是糖酵解过程中的重要产物；同时， 当环境中缺乏碳源物质时，氨基酸又会通过脱氨基作用，作为碳源被大多数 微生物利用。因而，仅关注氨基酸手性异构体数量的变化并不能真实地体现 氨基酸的碳循环特征，必须有效区分土壤中原有的和新合成的氨基酸才能满 足研究的需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的 方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的方法，包括步骤如下：
S1，采集土壤样品，有机碳含量为12.51g·kg-1，全氮1.52g·kg-1.将采集得 到的土壤样品过2mm筛，并将土壤湿度调节到田间持水量的60％，预培养1-2 周；
S2，称取10g土壤于小烧杯中，每周加入一次13C-葡萄糖和(NH4)2SO4 的混合溶液500μl，使加入的养分含量为每克土0.1mgN与1.0mgC，烧杯口覆 盖封口膜，于24-26℃下培养，分别在3-6周后将土壤风干，过0.25mm筛后 进行土壤氨基酸化合物中异构体测定，培养试验设1-3次重复，每周利用称量 法补充水分，使土壤湿度保持为田间持水量的60％；
S3，将土壤样品利用拉曼光谱检测，每次测定均以原土为对照，然后水 解：准确称取含有0.5g土壤样品置于水解瓶中，然后加入10ml的6mol·L-1HCl， 在105℃下水解12h；
S4，纯化：向水解物中加入200μl浓度为80μg·ml-1的正缬氨酸，振荡15s 后过滤，滤液利用旋转蒸发仪，蒸发至干，将残留物用4ml浓度为 0.05mol·L-1HCl溶解后，利用阳离子交换树脂进行纯化，树脂用0.1mol·L-1草 酸，pH1.6～1.8，淋洗5次以除去土壤中Fe3+、Al3+等金属离子，每次用量5ml；
S5，向树脂柱中先后加入5ml的0.01mol·L-1HCl和5ml去离子水，淋洗 液弃去，氨基酸利用25ml浓度为2.5mol·L-1的NH3·H2O分5次洗脱，而后将 各次洗脱液利用旋转蒸发仪蒸发至干，将干燥后的样品用4ml浓度为 0.1mol·L-1的HCl溶解，离心机15min，将上清液倒入5ml反应瓶中进行冷冻 干燥；
S6，衍生：向干燥后的样品中加入400μl浓度为4mol·L-1的HCl-异丙醇 溶液后，旋紧反应瓶瓶塞，在110℃下加热30min，冷却后，将上清液转移至 1ml反应瓶中，用N2将溶液吹干，再向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟 丙酸酐，在110℃下加热10min，冷却至室温后，用N2将过量试剂吹干，将 衍生物溶于150μl二氯甲烷，振荡并平衡30min后将上清液移至色谱内插管瓶 中即可进行拉曼光谱检测。
优选的，所述阳离子交换树脂为Dowex50WX8，100-200目，所述葡萄糖 为U-13C-glucose，13C99％atom。
优选的，所述土壤样品为黑土(10-20cm)，采自吉林省公主岭市“国家黑 土肥力与肥料效益长期定位监测基地”，为低产旱田土壤，所述旋转蒸发仪 的型号为N-N型旋转蒸发仪，日本TokyoRikakikaiCo.Ltd。
优选的，所述离心机的转速为100-300r/min，且离心机的底部出料口底端 活动连接有细孔滤网。
优选的，所述阳离子交换树脂可选用强酸性阳离子树脂或弱酸性阳离子 树脂。
优选的，所述拉曼光谱检测后还有其他后续步骤，这些后续步骤包括数 据储存、数据传送和打印比例清单中的一个或几个步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用含有不同13C浓度的甘氨 酸(1，2-13C-gly)进行了异构体测定和计算的准确性检验及衍生过程对氨基酸 异构体比例测定的影响。准确称取13C浓度分别约为20％、40％、80％atom 的甘氨酸标准样品分别经纯化、衍生或直接衍生后利用拉曼光谱检测。同时， 由于纯化、衍生等化学过程对高浓度异构体不会产生区分效应，因此前处理 过程不会改变样品原有的异构体浓度，同时，样品回收率的高低也并不影响 异构体比例的质谱测定准确性。可见利用以上方法测定土壤氨基酸化合物中 异构体的异构体富集比例是可靠的，将黑土样品利用U-13C-葡萄糖和NH4+ 培养3周后，进行土壤氨基酸化合物中异构体测定和13C异构体富集评价。 对于不同化合物来说，其含量越高，测定偏差越小。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实 施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
实施例1
一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的方法，包括步骤如下：
S1，采集土壤样品，有机碳含量为12.51g·kg-1，全氮1.52g·kg-1.将采集得 到的土壤样品过2mm筛，并将土壤湿度调节到田间持水量的60％，预培养1 周；
S2，称取10g土壤于小烧杯中，每周加入一次13C-葡萄糖和(NH4)2SO4 的混合溶液500μl，使加入的养分含量为每克土0.1mgN与1.0mgC，烧杯口覆 盖封口膜，于24℃下培养，分别在3周后将土壤风干，过0.25mm筛后进行 土壤氨基酸化合物中异构体测定，培养试验设1次重复，每周利用称量法补 充水分，使土壤湿度保持为田间持水量的60％；
S3，将土壤样品利用拉曼光谱检测，每次测定均以原土为对照，然后水 解：准确称取含有0.5g土壤样品置于水解瓶中，然后加入10ml的6mol·L-1HCl， 在105℃下水解12h；
S4，纯化：向水解物中加入200μl浓度为80μg·ml-1的正缬氨酸，振荡15s 后过滤，滤液利用旋转蒸发仪，蒸发至干，将残留物用4ml浓度为 0.05mol·L-1HCl溶解后，利用阳离子交换树脂进行纯化，树脂用0.1mol·L-1草 酸，pH1.6，淋洗5次以除去土壤中Fe3+、Al3+等金属离子，每次用量5ml；
S5，向树脂柱中先后加入5ml的0.01mol·L-1HCl和5ml去离子水，淋洗 液弃去，氨基酸利用25ml浓度为2.5mol·L-1的NH3·H2O分5次洗脱，而后 将各次洗脱液利用旋转蒸发仪蒸发至干，将干燥后的样品用4ml浓度为 0.1mol·L-1的HCl溶解，离心机15min，将上清液倒入5ml反应瓶中进行冷冻 干燥；
S6，衍生：向干燥后的样品中加入400μl浓度为4mol·L-1的HCl-异丙醇 溶液后，旋紧反应瓶瓶塞，在110℃下加热30min，冷却后，将上清液转移至 1ml反应瓶中，用N2将溶液吹干，再向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟 丙酸酐，在110℃下加热10min，冷却至室温后，用N2将过量试剂吹干，将 衍生物溶于150μl二氯甲烷，振荡并平衡30min后将上清液移至色谱内插管瓶 中即可进行拉曼光谱检测。
具体的，所述阳离子交换树脂为Dowex50WX8，100目，所述葡萄糖为 U-13C-glucose，13C99％atom。
具体的，所述土壤样品为黑土(10cm)，采自吉林省公主岭市“国家黑土肥 力与肥料效益长期定位监测基地”，为低产旱田土壤，所述旋转蒸发仪的型号 为N-N型旋转蒸发仪，日本TokyoRikakikaiCo.Ltd。
具体的，所述离心机的转速为100r/min，且离心机的底部出料口底端活 动连接有细孔滤网。
具体的，所述阳离子交换树脂可选用强酸性阳离子树脂或弱酸性阳离子 树脂。
具体的，所述拉曼光谱检测后还有其他后续步骤，这些后续步骤包括数 据储存、数据传送和打印比例清单中的一个或几个步骤。
实施例2
一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的方法，包括步骤如下：
S1，采集土壤样品，有机碳含量为12.51g·kg-1，全氮1.52g·kg-1。将采集 得到的土壤样品过2mm筛，并将土壤湿度调节到田间持水量的60％，预培养 10个工作日；
S2，称取10g土壤于小烧杯中，每周加入一次13C-葡萄糖和(NH4)2SO4 的混合溶液500μl，使加入的养分含量为每克土0.1mgN与1.0mgC，烧杯口覆 盖封口膜，于25℃下培养，分别在4周后将土壤风干，过0.25mm筛后进行 土壤氨基酸化合物中异构体测定，培养试验设2次重复，每周利用称量法补 充水分，使土壤湿度保持为田间持水量的60％；
S3，将土壤样品利用拉曼光谱检测，每次测定均以原土为对照，然后水 解：准确称取含有0.5g土壤样品置于水解瓶中，然后加入10ml的6mol·L-1HCl， 在105℃下水解12h；
S4，纯化：向水解物中加入200μl浓度为80μg·ml-1的正缬氨酸，振荡15s 后过滤，滤液利用旋转蒸发仪，蒸发至干，将残留物用4ml浓度为 0.05mol·L-1HCl溶解后，利用阳离子交换树脂进行纯化，树脂用0.1mol·L-1草 酸，pH1.7，淋洗5次以除去土壤中Fe3+、Al3+等金属离子，每次用量5ml；
S5，向树脂柱中先后加入5ml的0.01mol·L-1HCl和5ml去离子水，淋洗 液弃去，氨基酸利用25ml浓度为2.5mol·L-1的NH3·H2O分5次洗脱，而后 将各次洗脱液利用旋转蒸发仪蒸发至干，将干燥后的样品用4ml浓度为 0.1mol·L-1的HCl溶解，离心机15min，将上清液倒入5ml反应瓶中进行冷冻 干燥；
S6，衍生：向干燥后的样品中加入400μl浓度为4mol·L-1的HCl-异丙醇 溶液后，旋紧反应瓶瓶塞，在110℃下加热30min，冷却后，将上清液转移至 1ml反应瓶中，用N2将溶液吹干，再向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟 丙酸酐，在110℃下加热10min，冷却至室温后，用N2将过量试剂吹干，将 衍生物溶于150μl二氯甲烷，振荡并平衡30min后将上清液移至色谱内插管瓶 中即可进行拉曼光谱检测。
具体的，所述阳离子交换树脂为Dowex50WX8，150目，所述葡萄糖为 U-13C-glucose，13C99％atom。
具体的，所述土壤样品为黑土(15cm)，采自吉林省公主岭市“国家黑土肥 力与肥料效益长期定位监测基地”，为低产旱田土壤，所述旋转蒸发仪的型 号为N-N型旋转蒸发仪，日本TokyoRikakikaiCo.Ltd。
具体的，所述离心机的转速为200r/min，且离心机的底部出料口底端活 动连接有细孔滤网。
具体的，所述阳离子交换树脂可选用强酸性阳离子树脂或弱酸性阳离子 树脂。
具体的，所述拉曼光谱检测后还有其他后续步骤，这些后续步骤包括数 据储存、数据传送和打印比例清单中的一个或几个步骤。
实施例3
一种拉曼光谱检测土壤氨基酸化合物中异构体的方法，包括步骤如下：
S1，采集土壤样品，有机碳含量为12.51g·kg-1，全氮1.52g·kg-1.将采集得 到的土壤样品过2mm筛，并将土壤湿度调节到田间持水量的60％，预培养2 周；
S2，称取10g土壤于小烧杯中，每周加入一次13C-葡萄糖和(NH4)2SO4 的混合溶液500μl，使加入的养分含量为每克土0.1mgN与1.0mgC，烧杯口覆 盖封口膜，于26℃下培养，分别在6周后将土壤风干，过0.25mm筛后进行 土壤氨基酸化合物中异构体测定，培养试验设3次重复，每周利用称量法补 充水分，使土壤湿度保持为田间持水量的60％；
S3，将土壤样品利用拉曼光谱检测，每次测定均以原土为对照，然后水 解：准确称取含有0.5g土壤样品置于水解瓶中，然后加入10ml的6mol·L-1HCl， 在105℃下水解12h；
S4，纯化：向水解物中加入200μl浓度为80μg·ml-1的正缬氨酸，振荡15s 后过滤，滤液利用旋转蒸发仪，蒸发至干，将残留物用4ml浓度为 0.05mol·L-1HCl溶解后，利用阳离子交换树脂进行纯化，树脂用0.1mol·L-1草 酸，pH1.8，淋洗5次以除去土壤中Fe3+、Al3+等金属离子，每次用量5ml；
S5，向树脂柱中先后加入5ml的0.01mol·L-1HCl和5ml去离子水，淋洗 液弃去，氨基酸利用25ml浓度为2.5mol·L-1的NH3·H2O分5次洗脱，而后将 各次洗脱液利用旋转蒸发仪蒸发至干，将干燥后的样品用4ml浓度为 0.1mol·L-1的HCl溶解，离心机15min，将上清液倒入5ml反应瓶中进行冷冻 干燥；
S6，衍生：向干燥后的样品中加入400μl浓度为4mol·L-1的HCl-异丙醇 溶液后，旋紧反应瓶瓶塞，在110℃下加热30min，冷却后，将上清液转移至 1ml反应瓶中，用N2将溶液吹干，再向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟 丙酸酐，在110℃下加热10min，冷却至室温后，用N2将过量试剂吹干，将 衍生物溶于150μl二氯甲烷，振荡并平衡30min后将上清液移至色谱内插管瓶 中即可进行拉曼光谱检测。
具体的，所述阳离子交换树脂为Dowex50WX8，200目，所述葡萄糖为 U-13C-glucose，13C99％atom。
具体的，所述土壤样品为黑土(20cm)，采自吉林省公主岭市“国家黑土肥 力与肥料效益长期定位监测基地”，为低产旱田土壤，所述旋转蒸发仪的型 号为N-N型旋转蒸发仪，日本TokyoRikakikaiCo.Ltd。
具体的，所述离心机的转速为300r/min，且离心机的底部出料口底端活 动连接有细孔滤网。
具体的，所述阳离子交换树脂可选用强酸性阳离子树脂或弱酸性阳离子 树脂。
具体的，所述拉曼光谱检测后还有其他后续步骤，这些后续步骤包括数 据储存、数据传送和打印比例清单中的一个或几个步骤。
对于本发明而言，工作原理为：利用含有不同13C浓度的甘氨酸(1， 2-13C-gly)进行了异构体测定和计算的准确性检验及衍生过程对氨基酸异构 体比例测定的影响，准确称取13C浓度分别约为20％、40％、80％atom的甘 氨酸标准样品分别经纯化、衍生或直接衍生后利用拉曼光谱检测。同时，由 于纯化、衍生等化学过程对高浓度异构体不会产生区分效应，因此前处理过 程不会改变样品原有的异构体浓度，同时，样品回收率的高低也并不影响异 构体比例的质谱测定准确性，可见利用以上方法测定土壤氨基酸化合物中异 构体的异构体富集比例是可靠的，将黑土样品利用U-13C-葡萄糖和NH4+培养 3周后，进行土壤氨基酸化合物中异构体测定和13C异构体富集评价。对于 不同化合物来说，其含量越高，测定偏差越小。
类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个 或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时 被一起分组到单个实施例或者对其的描述中.然而，并不应将该公开的方法解 释成反映如下：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载 的特征更多特征.更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，发明方面 在于少于前面公开的单个实施例的所有特征.因此，遵循具体实施方式的权利 要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发 明的单独实施例。