本发明属于药物化学领域，具体涉及一种lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法。
背景技术：
结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，结核杆菌的中文学名为结核分枝杆菌(m.tuberculosis)。结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，脂质可防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。粘附在尘埃上保持传染性8-10天，在干燥痰内可存活6-8个月。结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。目前，结核病的治疗多采用利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素为第一线药物。利福平与异烟肼合用可以减少耐药性的产生。对严重感染，可以吡嗪酰胺与利福平及异烟肼合用，以减少耐药性的产生，增强疗效。
对氨基水杨酸化学名为4-氨基-2-羟基苯甲酸，熔点为135-145℃，是抗结核分枝杆菌的药物，对氨基水杨酸可以延缓结核分枝杆菌对异烟肼和链霉素耐药性的产生，其作用机制可能为抑制叶酸合成(但对抗叶酸化合物无增效作用)并/或抑制细胞壁分枝杆菌生长素的合成，使结核分枝杆菌的铁摄入减少，从而达到抑菌作用。对氨基水杨酸仅对分枝杆菌有效，单独应用时结核杆菌能迅速产生耐药性，因此本品必须与其他抗结核药合用。
对氨基水杨酸原料药的制备方法目前报道的主要有两种方法：一种是以苯乙酸为原料合成得到对氨基水杨酸；另一种是由间氨基酚经羟化而得到对氨基水杨酸。
文献journaloftheamericanchemicalsociety[1948，70(4)，1665–1666]中报道了用苯乙酸为原料，经6步反应得到对氨基水杨酸，方程式如下：
专利de50835报道了以间氨基酚为原料制备对氨基水杨酸，其反应方程如下：
值得一提的是，对氨基水杨酸是一个很不稳定的化合物，对光、热、氧气都比较敏感，在40℃以上时，对氨基水杨酸水溶液或其盐酸盐会脱去羧基降解成杂质间氨基苯酚，呈棕色溶液。
根据工艺路线分析，可能产生间氨基苯磺酸和间硝苯磺酸的工艺杂质，该杂质含有基因毒性警示结构，根据ich的要求，需要对该类杂质进行严格控制，限度为0.8ppm。采用常规的hplc-uv方法灵敏度无法满足检测要求，因此，迫切需要提供一种高灵敏度的方法来检测对氨水杨酸中基因毒性警示结构杂质。
目前并没有采用lc-msms检测间氨基苯磺酸和间硝苯磺酸的方法，因此提供一种简单、分离度好、灵敏度高的方法能更精准的确保对氨基水杨酸及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法。所述方法能同时检测对氨基水杨酸中间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸的含量，检测限度达到了0.4ng/ml。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
lc-msms(液相色谱串联质谱)法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法，所述方法中采用的色谱柱是以辛烷基硅烷键合硅胶为填料，采用醋酸水溶液(流动相a)和乙腈水溶液(流动相b)为流动相进行梯度洗脱，进入串联质谱检测器进行检测；所述相关杂质包括间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸。
进一步，所述醋酸水溶液中醋酸所占的体积百分比为0.1％。
进一步，所述乙腈水溶液中乙腈所占的体积百分比为90％。
进一步，所述梯度洗脱的条件设置如下：
流动相流速为0.3-0.5ml/min。
作为一种优选，所述梯度洗脱的条件设置如下：
流动相流速为0.4ml/min。
本发明的方法中通过流动相梯度的优化，流动相种类的筛选，色谱柱的选择，排除了对氨基水杨酸对间氨基苯磺酸和间硝苯磺酸的干扰，使得限度加入的回收率大于95％，并且检测限度达到了0.4ng/ml的极低浓度。
进一步，所述lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法，具体包括以下步骤：
1)配制内标溶液：取对甲基苯磺酸加溶剂溶解并稀释，得内标溶液；
2)配制供试品溶液：取供试样品，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺和内标溶液后再加溶剂溶解并稀释，得供试品溶液；
3)配制对照品溶液：分别取间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺和内标溶液后加溶剂溶解并稀释，得对照品溶液；
4)分别取对照品溶液与供试品溶液在液相色谱仪中进样，采用串联质谱检测器检测，记录色谱图，按内标法计算间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸的含量。
作为一种优选，上述方法中，进样体积为20μl。
进一步，所述溶剂为乙腈体积百分比为20％的乙腈水溶液。
进一步，步骤1)中内标溶液的浓度为1ng/ml；步骤2)中供试品溶液的浓度为1230μg/ml-1270μg/ml。
作为一种优选，步骤2)中供试品溶液的浓度为1250μg/ml。
流动相起始比例含有80％的水相，供试品溶液有机相比例过高，会有明显溶剂效应，干扰测定，所以在供试品溶液配制过程中，加入少量的n,n-二甲基乙酰胺增加了对氨基水杨酸的溶解性，下降了供试品溶液配制溶剂的有机相比例，极大减少了溶剂干扰的现象。
上述方法中，n,n-二甲基乙酰胺在供试品溶液或对照品溶液中的体积百分比为1％。
进一步，步骤4)中液相色谱仪的色谱柱的规格为250×4.6mm，5.0μm；所述色谱柱柱箱温度为25-35℃。
作为一种优选，所述色谱柱柱箱温度为30℃。
进一步，步骤4)中串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源(esi)，采用负离子mrm模式检测；离子源温度为550℃，喷雾电压为-3000v，雾化气(gas1)为15psi；气帘气(curtaingas)为12psi。
本发明的目的之二在于提供一种分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的试剂组合物，所述试剂组合物由流动相a、流动相b和n,n-二甲基乙酰胺组成；所述流动相a为醋酸水溶液，醋酸水溶液中醋酸所占的百分比为0.1％；所述流动相b为乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈所占的百分比为90％；所述相关杂质包括间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸。
在分离测定中n,n-二甲基乙酰胺在供试品溶液或对照品溶液中的体积百分比为1％。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法，该方法能同时检测对氨基水杨酸中间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸的含量且操作简单、分离度好、专属性强、灵敏度高，能精准的确保对氨基水杨酸及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
2)本发明方法中通过流动相种类的筛选、流动相梯度的优化、色谱柱的选择，排除了对氨基水杨酸对间氨基苯磺酸和间硝苯磺酸的干扰，使得限度加入的回收率大于95％，并且检测限度达到了0.4ng/ml的极低浓度。
3)在检测过程中，供试品溶液有机相比例过高，会有明显溶剂效应，干扰测定，所以在供试品溶液配制过程中，加入少量的n,n-二甲基乙酰胺增加了对氨基水杨酸的溶解性，下降了供试品溶液配制溶剂的有机相比例，极大减少了溶剂干扰的现象。
附图说明
图1为间硝基苯磺酸的二级质谱图。
图2为间氨基苯磺酸的二级质谱图。
图3为对甲基苯磺酸的二级质谱图。
图4为lod-1(0.5ng/ml)。
图5为lod-2。
图6为lod-3。
图7为空白溶剂色谱图。
图8为内标色谱图。
图9为对照品色谱图(1ng/ml)。
图10为供试品色谱图。
图11为供试品溶液加标准溶液色谱图(1ng/ml)。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
测定仪器：质谱：api3000，液相：lc-20a
液相色谱条件
色谱柱：安捷伦xdb-c8250×4.6mm，5μm；
流动相：0.1％醋酸水溶液(流动相a)，90％乙腈溶液(流动相b)；
流速：0.4ml/min。
串联质谱检测器的条件及参数：电喷雾离子源(esi)，采用负离子mrm模式检测；离子源温度为550℃，喷雾电压为-3000v，雾化气(gas1)为15psi；气帘气(curtaingas)为12psi；驻留时间：200msceresolutionq1:unit，resolutionq3:unit，化合物离子对见图1～图3。
实施例
lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法，
1、具体操作方法：
取供试样品12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺，精密量取内标溶液1.0ml(取对甲基苯磺酸适量，精密称定，用20％乙腈溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含10ng的溶液)置10ml量瓶中，用20％乙腈溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸对照品适量，精密称定，用20％乙腈溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含10ng的溶液，精密量取该溶液1.0ml，置10ml量瓶中，再精密量取内标溶液1.0ml，置同一个量瓶中，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺，用20％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱测定法(中国药典2015年版通则0512第一法)测定，用八烷基键合硅胶为固定相(250mm*4.6mm5μm)；以0.1％冰乙酸水溶液作为流动相a，以90％乙腈溶液作为流动相b，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为0.4ml/min。
梯度洗脱条件：
电喷雾离子源(esi)，采用负离子mrm模式检测，离子源温度为550℃，喷雾电压为-3000v，雾化气(gas1)为15；气帘气(curtaingas)为12，离子信息见下表。分别取对照品溶液与供试品溶液20μl进样，记录色谱图。供试品溶液中间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸分别与内标峰面积的比值不得大于对照品溶液中间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸与内标峰面积的比值(0.00008％)。
2、检测结果：
在检测中空白溶剂不干扰间硝基苯磺酸、间氨基苯磺酸和内标的测定；内标不干扰间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸的测定；对照品溶液进样重复性良好，见图7～图9。
3、检测限间硝基苯磺酸和间氨基苯磺酸的检测限为0.5ng/ml，相当于对氨基水杨酸的0.4ppm的杂质能被检出，信噪比大于3，见图4～图6。
4、标准加入试验对氨基水杨酸不干扰间氨基苯磺酸和间硝基本磺测定
精密称取样品12.5mg，置10ml量瓶中，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺，再分别精密量取专属性项下的内标贮备液(10ng/ml)和对照品贮备液(10ng/ml)1.0ml，置量瓶中，再加溶剂定量稀释至刻度，摇匀，作为加入试验溶液，取20μl进样，记录色谱图，见图11。
精密称取样品12.5mg，置10ml量瓶中，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺，精密量取专属性项下的内标贮备液1.0ml，置量瓶中，再加溶剂定量稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取20μl进样，记录色谱图，见图10。
精密量取专属性项下的内标贮备液和对照品贮备液1.0ml，置10ml量瓶中，加入0.1mln,n-二甲基乙酰胺，加溶剂溶解并定量稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，取20μl进样，记录色谱图，见图9。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。