本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法被适用于快速高效地检测生物样本中不对称二甲基精氨酸的含量。
背景技术:
不对称二甲基精氨酸(asymmetricaldimethylarginine,adma)是一种天然氨基酸,广泛地存在于组织和细胞中,它以s腺苷甲硫氨酸为甲基供体,由甲基化蛋白转移酶(proteinargininemethyltransferase,prmt)催化蛋白或多肽中的精氨酸残基,使得这些精氨酸残基甲基化形成甲基化蛋白,然后在蛋白水解酶的作用下从甲基化蛋白水解而来。它可以以原形通过肾脏被排泄,而大部分是通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶被代谢。
不对称二甲基精氨酸adma被认为是内源性一氧化氮(no)合成酶(nitricoxidesynthase,nos)的抑制剂,大量的动物和临床研究显示不对称二甲基精氨酸adma能竞争性抑制nos的产生,进而降低no合成浓度,从而影响血管内皮功能。换言之,由于不对称二甲基精氨酸adma能抑制一氧化氮酶的合成及由此而产生的生物学效应,血浆不对称二甲基精氨酸adma的浓度是内皮功能不全和心血管疾病的危险因子。越来越多的研究显示不对称二甲基精氨酸adma含量的升高与心血管疾病发生和发展密切相关,是一种新的心血管病危险因素。举例来说,高胆固醇血症年轻患者体内不对称二甲基精氨酸adma含量升高与内皮依赖的血管舒张反应和尿硝酸盐排泄减少相关。
目前,临床上针对不对称二甲基精氨酸adma的测定方法主要有高压液相色谱法、酶联免疫法和免疫比浊测定法等,但是高压液相色谱法存在灵敏度不足的问题,酶联免疫法和免疫比浊测定法均需要配置特定的试剂盒,且存在操作复杂,通量低,成本较高的问题。
总而言之,现有临床上尚未有得到被普遍认可的针对不对称二甲基精氨酸adma的检测方法。因此,开发一种新的能普遍应用于临床上快速测定不对称二甲基精氨酸adma含量的方法有着重要意义。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法应用高通量液相色谱串联质谱法快速高效地检测生物样本中不对称二甲基精氨酸的含量。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中应用所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法检测不对称二甲基精氨酸时,检测样品的前准备步骤简单易操作,并且可操作性高。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法对不对称二甲基精氨酸进行衍生化前处理,从而提高所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法的检测灵敏度和检测特异性,并且其衍生化处理步骤简单易操作。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法可定性且定量地检测不对称二甲基精氨酸,即通过不对称二甲基精氨酸高效检测方法不仅可以高效快速地检测到不对称二甲基精氨酸的存在,并且可检测到不对称二甲基精氨酸的含量。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中应用所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法定量检测不对称二甲基精氨酸含量时,定量样本量好,且定量效果好。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法具有衍生前处理步骤简单,成本低廉,操作简便等优势。
本发明的目的在于提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法检测时间短,通量高,检测灵敏度高,特异性好。
为达上述目的,本发明的主要技术解决手段是提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,被适用于检测样本中不对称二甲基精氨酸的含量,其特征在于,所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法包括以下步骤:
s1:获取不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线:
其中所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的不对称二甲基精氨酸与已知浓度的标记不对称二甲基精氨酸的实际比值之间的关系;
s2:检测品的制备:混匀所述样本以及内标工作液,离心静置后吸取上清液,利用氮气吹干所述上清液得到第一中间物,并加入衍生剂,恒温条件下反应静置一段时间得到第一溶液,随后用氮气吹干所述第一溶液中的残留衍生剂,得到第二中间物,用复溶剂复溶所述第二中间物得到检测品;
s3:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸利用超高压液相色谱以及相应的流动相,在分析柱上从所述检测品中分离不对称二甲基精氨酸;
s4:串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸:通过串联质谱针对性检测不对称二甲基精氨酸,获取检测值,其中所述检测值被反应为不对称二甲基精氨酸与标记不对称二甲基精氨酸的比值;以及
s5:获取所述不对称二甲基精氨酸的含量:将所述检测值代入所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线,计算得到所述样本中所述不对称二甲基精氨酸的含量。
在一些实施例中,所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s11:不对称二甲基精氨酸标准溶液的制备:将不对称二甲基精氨酸标准品用甲醇稀释到若干个不同浓度,以获取不同浓度的不对称二甲基精氨酸标准溶液备用;
s12:上清液的制备:以一定比例充分混匀所述不对称二甲基精氨酸标准溶液和已知浓度的内标工作液,离心得到上清液;
s13:标准检测品的制备:利用氮气吹干所述上清液得到第一中间物,并加入衍生剂,恒温条件下反应静置一段时间得到第一溶液;随后用氮气吹干所述第一溶液中的残留衍生剂,得到第二中间物,用复溶剂复溶所述第二中间物得到标准检测品;
s14:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸:
利用超高压液相色谱以及相应的流动相,在分析柱上从所述标准检测品中分离不对称二甲基精氨酸;
s15:串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸:通过串联质谱针对性检测不对称二甲基精氨酸,获取测试值;以及根据所述测试值以及已知浓度不对称二甲基精氨酸标准溶液和内标工作液浓度值的比值获取所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线。
在一些实施例中,其中所述步骤s2中检测品的制备的反应条件一致于所述步骤s13以及所述步骤s12中标准检测品的制备;所述步骤s3当中高通量液相色谱分离所述不对称二甲基精氨酸的反应条件也一致于s14中高通量液相色谱分离所述不对称二甲基精氨酸的反应条件;所述步骤s4当中串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸的反应条件液要一致于所述步骤s15中串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸的反应条件。
在一些实施例中,所述标记不对称二甲基精氨酸被实施为氘代不对称二甲基精氨酸,所述内标工作液被实施为所述标记不对称二甲基精氨酸溶于甲醇形成的溶液。
在一些实施例中,其中所述衍生剂被实施为盐酸正丁醇溶液,所述复溶剂被实施为乙腈-水溶液。
在一些实施例中,其中所述高通量液相色谱的分离条件控制如下:分析柱为hsst3;色谱柱柱温:40℃;进样量:10μl;流速:0.50ml/min;流动相组成:a相为10mm乙酸铵0.1%甲酸-水溶液,b相为0.1%甲酸-乙腈溶液。
在一些实施例中,其中所述质谱检测条件为电喷雾针电压:3.0kv,去溶剂气流速:800l/h,去溶剂气温度:400℃,锥孔气流速:50l/h,检测为正离子模式,多重反应监控。
在一些实施例中,所述不对称二甲基精氨酸标准溶液的浓度4.83umol/l~0.076μmol/l。
在一些实施例中,其中所述内标工作液的浓度为0.5umol/l,所述衍生剂的浓度为3mol/l,所述复溶剂中乙腈的浓度为1%。
在一些实施例中,其中所述离心条件控制为:离心力为12000g,离心温度为4℃,离心时间为10min。
在一些实施例中,其中所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线可被实施为反映测试值和不同浓度的不对称二甲基精氨酸与已知浓度的标记不对称二甲基精氨酸的实际比值之间的函数关系的定量校正方程。
附图说明
图1是本发明的一实施例的不对称二甲基精氨酸高效检测方法的检测步骤示意图。
图2到图5是根据本发明的所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法中指定标准曲线的具体实施方式示意图。
图6是根据本发明的所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法的色谱洗脱出峰的绝对保留时间示意图。
图7是根据本发明的所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法的不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是,在本发明的揭露中,术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系,其仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是,术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”,即在一个实施例中,一个元件的数量可以为一个,而在另外的实施例中,该元件的数量可以为多个,术语“一”不能理解为对数量的限制。
不对称二甲基精氨酸(asymmetricaldimethylarginine,adma)是一种天然氨基酸,广泛地存在于组织和细胞中,由于不对称二甲基精氨酸adma能抑制一氧化氮酶的合成及由此而产生的生物学效应,血浆中不对称二甲基精氨酸adma的浓度是内皮功能不全和心血管疾病的危险因子。越来越多的研究显示不对称二甲基精氨酸adma含量的升高与心血管疾病发生和发展密切相关,是一种新的心血管病危险因素。目前,临床上针对不对称二甲基精氨酸adma的测定方法主要有高压液相色谱法、酶联免疫法和免疫比浊测定法等,但是高压液相色谱法存在灵敏度不足的问题,酶联免疫法和免疫比浊测定法均需要配置特定的试剂盒,且存在操作复杂,通量低,成本较高的问题。
为了解决现有技术中检测不对称二甲基精氨酸adma的缺陷,本发明提供一不对称二甲基精氨酸高效检测方法,其中所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法对不对称二甲基精氨酸adma进行衍生化前处理,并且应用高通量液相色谱串联质谱法快速高效地检测生物样本中不对称二甲基精氨酸的含量,其衍生化处理步骤简单易操作,具有较高的检测灵敏度和检测特异性。
本发明提供的所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法可直接快速地定量定性地检测不对称二甲基精氨酸,其主要原理是先以已知浓度的不对称二甲基精氨酸adma以及其他辅助试剂以一定的方法获得一不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线,随后以相同方法检测检测样品得到一检测值,将所述检测值代入到所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线内,以计算获取所述不对称二甲基精氨adma的含量。
具体而言,所述不对称二甲基精氨酸高效检测方法被适用于检测生物样本内不对称二甲基精氨酸adma的含量,包括以下步骤:
s1:获取不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线:
其中所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的不对称二甲基精氨酸adma与已知浓度的标记不对称二甲基精氨酸adma的实际比值之间的关系;
s2:检测品的制备:混匀样本以及内标工作液,离心静置后吸取上清液;利用氮气吹干所述上清液得到第一中间物,并加入衍生剂,恒温条件下反应静置一段时间得到第一溶液,随后用氮气吹干所述第一溶液中的残留衍生剂,得到第二中间物,用复溶剂复溶所述第二中间物得到检测品;
s3:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸利用超高压液相色谱以及相应的流动相,在分析柱上从所述检测品中分离不对称二甲基精氨酸adma;
s4:串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸:通过串联质谱针对性检测不对称二甲基精氨酸adma,获取检测值,其中所述检测值被反应为不对称二甲基精氨酸与标记不对称二甲基精氨酸的比值;以及
s5:获取所述不对称二甲基精氨酸的含量:将所述检测值代入所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线,计算得到所述样本中所述不对称二甲基精氨酸adma的含量。
值得特别注意的是,在一些实施例中,可通过各种手段直接获取不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线,在另一些实施例中,所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线需要使用人员自行制备。但在直接获取不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线的实施例中,值得一提的是,所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线的制备条件应相同于所述样本在检测时的检测条件。
以下将结合图2到图7详细解释所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线的制备过程,所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线被实施为测试值和不同浓度的不对称二甲基精氨酸与已知浓度的标记不对称二甲基精氨酸的实际比值之间的关系。
如图2所示,所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s11:不对称二甲基精氨酸标准溶液的制备:将不对称二甲基精氨酸标准品用甲醇稀释到若干个不同浓度,以获取不同浓度的不对称二甲基精氨酸标准溶液备用;
在本发明的具体实施例中,所述不对称二甲基精氨酸标准溶液的浓度被控制在4.83umol/l~0.076μmol/l之间。换言之,在不对称二甲基精氨酸标准溶液的制备时,所述不对称二甲基精氨酸标准溶液的浓度被控制在4.83umol/l~0.076μmol/l。但熟悉该项技术的人应该明白,所述不对称二甲基精氨酸标准溶液的浓度范围仅仅作为举例,而不作为限制。
如图2所示,一具体实施例以操作过程图的形式被详细展示。所述不对称二甲基精氨酸标准品用甲醇稀释到不同浓度,比如“4.83umol/l,3.83umol/l,2umol/l,1.5umol/l,0.076umol/l”等,不同浓度的不对称二甲基精氨酸标准溶液被置于不同的ep反应管内,静置以备用。为了避免不必要的因素对实验产生干扰,不同反应管优选在相同反应条件下进行反应。
在准备好不同浓度的所述不对称二甲基精氨酸标准溶液后,所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s12:上清液的制备:以一定比例充分混匀所述不对称二甲基精氨酸标准溶液和已知浓度的内标工作液,离心得到上清液。
具体而言,所述s12的步骤被实施为往不同浓度的不对称二甲基精氨酸标准溶液中添加标记不对称二甲基精氨酸,随后可以已知含量的标记不对称二甲基精氨酸为基础计算比例值。值得注意的是,在本发明的实施例中,所述工作内标液被实施为不对称二甲基精氨酸-d6(adma-d6)和甲醇的混合液,所述工作内标液的浓度在本发明的实施例中被控制在0.5umol/l。
在本发明的一实施例中,所述离心条件控制为:离心力为12000g,离心温度为4℃,离心时间为10min。
所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s13:标准检测品的制备:
利用氮气吹干所述上清液得到第一中间物,并加入衍生剂,恒温条件下反应静置一段时间得到第一溶液;随后用氮气吹干所述第一溶液中的残留衍生剂,得到第二中间物,用复溶剂复溶所述第二中间物得到标准检测品。
值得一提的是,本发明的所述步骤s12和所述步骤s13适用于每一浓度的不对称二甲基精氨酸标准品溶液的后续处理。换言之,所述步骤s12中,分别以一定比例混合不同浓度的所述不对称二甲基精氨酸标准溶液和已知浓度的内标工作液,得到含有不同浓度不对称二甲基精氨酸的上清液。所述步骤s13中,衍生以及复溶处理所述含有不同浓度不对称二甲基精氨酸的上清液,得到含有不同浓度不对称二甲基精氨酸的标准检测品。
在本发明的一具体实施例中,所述衍生剂被实施为盐酸正丁醇溶液,所述衍生剂的浓度可被控制在3mol/l。所述复溶剂被实施为乙腈-水溶液,所述复溶剂中乙腈的浓度可被控制在1%。熟悉该项技术的人应该明白,所述衍生剂以及所述复溶剂的选择和浓度是根据实际情况被调整的,或者说,所述衍生剂以及所述复溶剂的浓度适配于所述上清液的浓度,当所述不对称二甲基精氨酸标准溶液的浓度发生变动后,所述衍生剂以及所述复溶剂的浓度可随之发生变化。
所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s14:高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸:
利用超高压液相色谱以及相应的流动相,在分析柱上从所述标准检测品中分离不对称二甲基精氨酸。
具体而言,在一具体实施例中,所述步骤s14中高通量液相色谱分离条件为:
色谱柱:acquityuplchsst3column,
采用梯度洗脱方式,见表1:
表1
所述步骤s1进一步包括以下步骤:
s15:串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸。
通过串联质谱针对性检测不对称二甲基精氨酸,获取测试值;以及
根据所述测试值以及已知标准品和内标浓度值的比值获取所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线。
值得注意的是,在获取所述不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线之后,可进一步获取定量校正方程,所述定量校正方程反映测试值和不同浓度的不对称二甲基精氨酸与已知浓度的标记不对称二甲基精氨酸的实际比值之间的函数关系。
另外,所述:串联质谱利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测不对称二甲基精氨酸,最终根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限,从而得到所述测试值,比对所述测试值和已知标准品和内标浓度值,从而获取标准曲线图并得到定量校正方程。
在本发明的一具体实施例中,在所述步骤s15当中,所述质谱检测条件为电喷雾针电压:3.0kv,去溶剂气流速:800l/h,去溶剂气温度:400℃,锥孔气流速:50l/h,检测为正离子模式,多重反应监控,质谱多重反应监控参数如表2所示:
表2
值得注意的是,为了保证实验数据的准确性,所述步骤s2当中,所述步骤s2检测品的制备的反应条件要一致于所述s12以及s13中标准样品的制备。
相同地,所述步骤s3当中高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸的反应条件也要一致于s14中高通量液相色谱分离不对称二甲基精氨酸的反应条件。
所述步骤s4当中串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸的反应条件液要一致于所述步骤s15中串联质谱检测所述不对称二甲基精氨酸的反应条件。以上反应条件,在此不再赘诉。
本发明提供一具体实施例,在该具体实施例中,
不对称二甲基精氨酸标准品(asymmetricdimethylargininedihydrochloride)以及标记不对称二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine-d6dihydrochloride)分别采购于sigma和torontoresearchchemicals公司。不对称二甲基精氨酸标准品用甲醇进行溶解,然后分装保存在-80℃,需要配制不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线时,用甲醇将上述不对称二甲基精氨酸标准品稀释至4.83-0.076um,氘代标记不对称二甲基精氨酸使用甲醇稀释至0.5umol/l作为内标工作液。
(1)标准品制备:分别取6个不同浓度的不对称二甲基精氨酸标准溶液9.6ul到干净的1.5mlep管中,再分别加入150ul内标工作液,使用旋涡混合器充分混合不对称二甲基精氨酸标准溶液以及内标工作液后,12000g条件下离心10min后取上清液70ul于96孔板,随后通氮气吹去多余的溶剂,加入衍生剂60ul,于60℃恒温反应30min,再次通氮气吹去残余的衍生剂,加入100ul复溶剂复溶,用于液相色谱串联质谱上样分析;
(2)液相色谱分离:利用超高压液相色谱以及相应的流动相,在分析柱上对样品中不对称二甲基精氨酸进行色谱洗脱分离,通过控制洗脱条件,分离出不对称二甲基精氨酸;
色谱柱:acquityuplchsst3column,
(3)质谱检测并制标准曲线:液相色谱上分离出的不对称二甲基精氨酸进入到三重四级杆质谱进行检测,利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测不对称二甲基精氨酸的含量,并获取不对称二甲基精氨酸定量标准矫正曲线;
色谱上分离后的不对称二甲基精氨酸进入到watersxevotqd质谱进行检测,利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式,设置特异性地检测不对称二甲基精氨酸;不对称二甲基精氨酸的保留时间为3.8min。如图6所示,样品通过超高压液相色谱分离后,不对称二甲基精氨酸在特定的洗脱时间出峰,并且被质谱选择反应监控模式检测到。
质谱为watersxevotqdivd(waters,milford,ma);质谱检测条件如下:电喷雾针电压:3.0kv,去溶剂气流速:800l/h,去溶剂气温度:400℃,锥孔气流速:50l/h,检测为负离子模式,多重反应监控,每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等如表2所示。值得注意的是,针对不同类型仪器,碰撞能量、锥孔电压值有所不同,需要独立优化,本发明仅仅举了一个例子作为说明解释,但不作为限制。
多重反应监控通过两次筛选,即第一个四级杆进行特定母离子筛选,第二个四级杆进行母离子碎裂产生子离子,第三个四级杆进行特定子离子筛选,具有非常好的检测特异性。可以通过选择反应监控检测到的离子流,以及对应的保留时间,来确定不对称二甲基精氨酸的检测,再利用添加已知量的氘代不对称二甲基精氨酸内标进行定量。
另外,在质谱检测过程中检测限定义为信噪比>3,定量限定义为信噪比>10,保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间,所有检测物质的相关系数r2均>0.99,每种不对称二甲基精氨酸的保留时间,检出限,定量限,线性范围以及定量校正方程分别如图中所示;通过三日的精密度测试,包括低、中、高三个浓度,日内日间精密度rsd均小于15%,表明检测结果准确,可重复。
不对称二甲基精氨酸的保留时间、检测限、定量限、线性范围、线性方程、相关系数如下:
(4)生物样本中不对称二甲基精氨酸的检测:取血液样本9.6ul(干血片3孔)到干净的1.5mlep管中,再分别加入150ul内标工作液,使用旋涡混合器充分混合后,12000g条件下离心10min后取上清液70ul于96孔板,随后通氮气吹去多余的溶剂,加入衍生剂60ul,于60℃恒温反应30min,再次通氮气吹去残余的衍生剂,加入100ul复溶剂复溶,用于液相色谱串联质谱上样分析;
液相色谱串联质谱分析同步骤(2)和(3),质谱检测得到不对称二甲基精氨酸与标记不对称二甲基精氨酸的比值,将比值代入到定量校正方程,计算得到生物样本中不对称二甲基精氨酸的含量。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。