本发明涉及一种高蔗糖含量花生新种质的创制方法，特别涉及一种突变体结合近红外光谱创制高蔗糖含量花生新种质的方法。
背景技术：
：花生是重要的油料作物和经济作物。花生可以油用、食用、留种及出口创汇。近几年花生生产发展迅猛，花生产业化进程加快，花生及其制品的市场需求量非常大，有着很大的发展潜力和良好的发展前景。目前国内外主要关注花生蛋白质、油份和脂肪酸等营养品质方面的研究，但与口味品质密切相关的种子蔗糖含量的研究甚少。花生甜味主要来源是花生中的蔗糖，且甜味是可以遗传的性状，特别是在蔗糖含量超过6％时口感会变好，因此，该性状已成为花生口味品质改良的重要目标。而目前我国主栽花生品种的蔗糖含量普遍较低，遗传基础狭窄，已成为我国花生出口的限制因素之一。甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，ems)是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变。在当前种质资源匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，采用ems诱发突变技术创造有用基因资源具有极其重要的意义。花生品质育种研究中涉及的育种材料数量多，品质测定方法是品质育种中的关键。尤其在低世代阶段，在品质性状测定方法上除了要求能简便快捷处理大量样品外，所采用的品质检测技术最好是非破坏性的，而且成本低廉。常规的化学方法已经无法满足上述要求，而利用近红外分析技术进行品质测定已成为目前的研究热点。现有花生籽仁中蔗糖含量测定采用间苯二酚法、3,5-二硝基水杨酸比色法、菲林试剂比色法等。这些方法存在费时、费力且具有一定的毒性和污染、不能进行快速的大规模的分析等不足。因此，需要找到一种快速和准确检测花生籽仁蔗糖含量的方法，为花生口味品质的评价提供依据。技术实现要素：本发明的目的是针对我国高蔗糖含量花生种质匮乏，遗传基础狭窄，测定方法繁琐等问题，利用ems诱变结合近红外光谱检测法创制高蔗糖含量花生新种质，为我国食用花生口味遗传改良提供材料基础。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高蔗糖含量花生新种质的创制方法，包括以下步骤：1)突变体材料创制；2)花生蔗糖含量快速检测方法的初步建立；3)收集蔗糖含量差异大的花生种质资源，进一步优化花生蔗糖含量快速检测方法；4)突变体材料筛选，创制高蔗糖含量花生新种质。步骤1)是利用ems处理豫花15号种子，进行突变体材料的创制。花生含糖量快速检测方法为：①对收集的样品经过充分晾晒后，使其水分降至3-6％，采用perten公司生产的da7200近红外光谱分析仪，取饱满的花生籽仁样品均匀装入样品杯中，摇匀，使表面平整，在波长为950-1650nm的范围内扫描样品，采集近红外光谱信息，生成光谱文件；②将步骤①的样品在50℃烘箱烘48h，去种皮，用研磨机磨碎后，称取2g样品于50ml离心管中，加20ml正己烷脱脂，在45℃、200rpm的摇床上提取2h，然后8000rpm离心3min，倒掉上清，重复2次，沉淀于通风橱风干；脱脂样品过80目筛后秤取50mg，共3份，分别倒入3支15ml离心管内加入4ml80％(v/v)乙醇，置于80℃水浴中不断搅拌40min，11000rpm离心5min，收集上清液，其残渣加4ml80％(v/v)乙醇重复提取1次，合并上清液，剩余带残渣的液体倒入2ml离心管中，13000rpm离心15min，合并上清液，然后用80％(v/v)乙醇定容至10ml，进行蔗糖含量的测定；③将测定的样品化学值输入到光谱文件中，用偏最小二乘回归法(pls)作为建立数学模型的化学计量学方法来建立蔗糖含量的近红外分析模型，利用“snv+de-trending/2，4，4，1/pls”的组合建立回归方程，找出交叉检验决定系数1-vr值最大的和交叉检验标准误secv值最小的，作为最佳定标模型。所建立的最佳定标模型为：本发明有益效果：1、本发明采用ems诱变的方法创造新的种质资源，特别是首次创制了高蔗糖含量花生种质，丰富了育种材料，为口味优良食用花生品种的选育奠定了材料基础；2、本发明收集的样品来源广、变异丰富，采用间苯二酚方法测定，测定结果分布范围为1.439％～10.612％，平均值为5.626％，蔗糖含量的变异系数较大，分布范围较宽，具有较好的代表性，可用于定标近红外光谱预测方程的优化；3、本发明是在发明人初步建模的基础上，对该方法进行了优化，使高通量快速品质检测成为可能，且结果更加可靠、理想，检测精度高、重复性好。大大缩短品质育种工作中的材料筛选时间，加快了育种进程，具有良好的推广价值；4、本发明实现了花生籽仁蔗糖含量的快速检测，克服了常规方法耗时长，破坏籽仁的缺点，实现了对整粒花生进行无损检测，节省了大量的人力、物力和财力，提高了工作效率，降低了有害气体的污染和对实验操作人员的伤害。附图说明以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为验证集蔗糖nir预测值与真实值之间的相关图。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。本发明实施诱变的花生品种为豫花15号，其是以“徐7506-57”为母本、“p12”为父本，采取人工杂交和系统选育方法育成的花生品种，含油量56.25％。实施例一种高蔗糖含量花生新种质的创制方法，包括以下步骤：(1)ems诱变处理材料以质量分数0.2％的ems溶液处理366粒豫花15号种子。处理方式为：用纯水浸泡种子4h使其吸胀，再用质量分数0.2％的ems溶液浸种5h，用流水冲洗1h，风干后及时播种。播种及性状调查：经质量分数0.2％的ems溶液诱变处理的豫花15号种子(m1)，2009年5月在河南省农业科学院原阳试验基地播种m1种子366粒，出苗321株，8月下旬收获，收获方式为：每个单株采2-3个果混合收获(m2)准备下一年播种，其余混收备份；2010年5月播种全部m2种子，对m2植株在整个生育期每周田间调查1次，观察叶形、叶色、株型等性状，筛选突变体，8月下旬单株收获并记录种子特性；与野生型对照相比有差异的材料在2011-2015年连续种植，并选择有稳定变异性状的单株收获。(2)花生蔗糖含量快速检测方法的初步建立选用72份国内外优质食用花生资源，采用近红外检测技术初步建立花生籽仁含糖量快速检测模型(秦利等，基于近红外光谱法的花生籽仁中蔗糖含量的测定[j]，中国油料作物学报：2016，38(5)：666-671)。(3)近红外测定花生籽仁蔗糖含量方法优化采用初步模型对育种后代材料及收集的优质食用花生材料2940份进行近红外蔗糖含量检测。样品经过充分晾晒后，水分达到5％左右，采用perten公司生产的da7200近红外光谱分析仪扫描样品，取饱满的花生籽仁样品均匀装入样品杯中，摇匀，使表面平整，在波长为950-1650nm的范围内，采集近红外光谱信息。每份样品重复三次，对光谱进行平均，生成平均光谱文件，完成对样品的近红外光谱采集(见表1)。表1蔗糖含量差异资源筛选表蔗糖含量个数>7.0％187>6.5％4082.0％<蔗糖含量<6.5％2519<2.0％13依据近红外初选结果，结合感官品质综合选择确定选取485份样品进行化学测定(485份样品包括蔗糖含量>6.5％样品242份，3％<蔗糖含量<6.5％的样品152份，1％<蔗糖含量<3％的样品91份)。485份样品分批在50℃烘箱烘48h，去种皮，用研磨机磨碎后，称取2g样品于50ml离心管中，加20ml正己烷脱脂，在45℃、200rpm的摇床上提取2h，然后8000rpm离心3min，倒掉上清，重复2次，沉淀于通风橱风干(通常过夜)。依照张志良的间苯二酚方法进行改良进行花生籽仁蔗糖含量的测定。称取脱脂样品50mg，共3份，分别倒入3支15ml离心管内加入4ml80％(v/v)乙醇，置于80℃水浴中不断搅拌40min，11000rpm离心5min，收集上清液，其残渣加4ml80％(v/v)乙醇重复提取1次，合并上清液，剩余带残渣的液体倒入2ml离心管中，13000rpm离心15min，合并上清液，然后用80％(v/v)乙醇定容至10ml，进行蔗糖含量的测定。经过重复验证最终确定定标样品数为393份。定标样品集见表2。表2定标样品集性状平均值/％最小值/％最大值/％标准差标准误差变异系数％蔗糖含量5.6261.43910.6122.40542.7565.626将测定的样品化学值输入到定标集的光谱文件中，用偏最小二乘回归法(pls)作为建立数学模型的化学计量学方法来建立蔗糖含量的近红外分析模型，通过variance及correlation(r)作为优选波长的依据，利用“标准正态变量转换(snv)+趋势变换法(de-trending)/2，4，4，1/pls”的组合建立回归方程。找出最大的1-vr(交叉检验决定系数)值和最小的secv(交叉检验标准误)值，作为最佳定标模型。所得模型结果如表3所示。校正结束后可以得到以下信息：校正决定系数(rsq)、校正标准误(sec)、交叉检验标准误(secv)、交叉检验决定系数(1-vr)这些是衡量近红外模型的主要参数。根据rsq、1-vr、sec和secv检验数据的精度和适合度。从表3可以看出rsq为0.929，说明建立的模型具有很高的精度。表3近红外建模结果(4)突变体材料筛选应用优化后的近红外快速测定花生籽仁蔗糖含量的方法，对处理后突变体材料进行筛选，创制高蔗糖含量花生新种质。2016年采用优化后的花生籽仁蔗糖含量近红外检测模型筛选结合田间综合表现，选取了79份表现良好的突变体种质进行田间进一步鉴定(表4)。2017年结合田间长势、产量表现及优化后的近红外模型检测，筛选出12份籽仁蔗糖含量超过7％的优异高糖新种质(表5)，经过口味评价小组测试，口感较好，为花生口味品质的遗传提供了材料基础。表4近红外测定突变体材料蔗糖含量品系名称蔗糖含量/％品系名称蔗糖含量/％品系名称蔗糖含量/％品系名称蔗糖含量/％y152-001d15.36y152-014d14.68y152-025d24.28y152-038d15.33y152-002d14.99y152-014d25.39y152-026d15.29y152-038d25.95y152-002d25.11y152-015d25.10y152-027d14.77y152-039d16.00y152-003d15.24y152-016d15.32y152-027d25.91y152-039d25.30y152-003d25.34y152-016d25.13y152-028d14.51y152-040d14.36y152-004d14.38y152-017d14.39y152-028d24.78y152-040d25.12y152-006d24.72y152-017d26.02y152-029d25.08y152-041d15.86y152-007d14.63y152-018d15.05y152-030d25.35y152-041d25.82y152-007d24.84y152-019d16.45y152-031d24.22y152-042d17.58y152-008d15.85y152-019d25.15y152-032d15.08y152-042d26.94y152-008d24.43y152-020d27.64y152-032d24.43y152-043d14.97y152-009d13.84y152-021d18.27y152-033d15.09y152-043d25.33y152-009d23.72y152-021d27.11y152-033d26.48y152-044d24.79y152-010d14.76y152-022d15.11y152-034d15.24y152-045d15.31y152-010d24.49y152-022d26.22y152-034d25.73y152-045d24.88y152-011d14.98y152-023d17.36y152-035d15.11y152-046d14.89y152-011d25.52y152-023d26.73y152-035d24.82y152-047d15.98y152-012d15.47y152-024d17.48y152-036d14.90y152-047d25.14y152-013d14.71y152-024d28.11y152-036d25.55y152-048d25.82y152-013d24.29y152-025d16.04y152-037d15.35表5高蔗糖含量花生种质2017种植号系谱蛋白质/％油份/％油酸/％油亚比蔗糖/％w5736y152-021-2-126.3344.7343.451.257.47w5745y152-023-1-727.2843.7141.971.177.44w5760y152-024-2-727.0244.5641.711.127.33w5746y152-023-1-826.7544.5239.661.057.28w5756y152-024-2-326.2044.5339.471.037.24w5729y152-021-1-425.3145.6236.250.897.18w5757y152-024-2-425.0045.8134.210.817.11w5734y152-021-1-925.1145.7735.420.867.07w5730y152-021-1-525.9245.7939.651.047.04w5731y152-021-1-626.1145.4938.590.997.04w5754y152-024-2-125.6545.3938.910.987.03w5749y152-024-1-226.6844.9537.760.977.02豫花15号ck21.2356.2536.360.854.41以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12