本发明涉及一种黄化病诊断筛选方法，具体涉及一种烟草黄化病诊断筛选方法。
背景技术：
黄化病，是植物的一种病征。指茎叶的一部或全部退绿，而出现黄色、黄白色或黄绿色的现象，是植物的主要病变之一。这种病有的是由于线虫、细菌类、病毒、支原体（Mycoplasma）等病原体而引起的疾病；有的是由于养分的过分不足而引起的生理性疾病。其根据病原不同又可分为两种类型。1.生理性黄化病：该病病因较多，其中较为常见的是缺铁性黄化，多发生于北方地区栽培喜酸性花卉如杜鹃、栀子、八仙花、茉莉等时新叶发黄，严重时叶片变褐干枯。此外缺硫、缺氮以及光照过强、浇水过多、低温、干旱等也会引起叶片黄化。此类病害主要通过加强栽培管理、合理施肥等措施解决，一般不需用药。2.病理性黄化病:这是一类由类菌原体(一种介于细菌与病毒之间的微生物)引起的传染性病害，如翠菊黄化病、天人菊黄化病、菊花黄化病、飞燕草黄化病、柑橙桔柚树的黄化病等。
黄化病株主要生化特征：坏死叶片中固醇的含量显著下降，氨基酸代谢失常；黄化突变体的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量降低，其中叶绿素b 变化明显，黄化突变体的净光合速率和蒸腾速率总体小于其它品种，气孔导度值差异较小，总体降低，胞间CO2浓度日变化值均高于其它品种。发生黄化的植物往往生长发育迟缓，枝条丛生，叶小且颜色逐渐变淡至黄色或黄绿色，严重时可能引起整个植株的死亡，导致植物的经济效益降低，植物黄化的普遍程度在不断加大。
烟草在我国是重要的经济作物之一，种植烟草的主要目的是收获叶片，通过工业加工制成各种烟制品，满足消费者需求。因此，烟叶品质的差异，直接影响着成品烟制品的品质。为了选育出优质的种质，国家局已将基因组编辑工厂化育种确定为重要战略工程。然而，针对大量基因编辑素材，如何进行高通量的分析评价，已经成为当前基因编辑育种技术中的研究重点。对于基因编辑素材出现的病害，我们希望通过以差异性分析为基础，围绕素材病害特征为研究核心开发高通量的筛选方法。
烟草黄化病是烟草栽培区普遍存在的烟草病害之一，其种类众多，分布也比较广，给烟草生产造成了巨大的影响。然而，目前并不能提前诊断出烟草是否为黄化烟草，只能待其病变后通过肉眼才能被发现，不能够及时采用相应的防治方法，造成人力和物力的浪费，严重影响生产和烟草品质。
因此，针对烟草的黄化诊断筛选，急需一种可以快速、准确、在早期诊断黄化烟叶的方法，进一步采用相应的防治方法降低黄化病的危害。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种烟草黄化病判定方法。本发明目的通过下列技术方案予以实现：
一种烟草黄化病判定方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
选择烟草试材，采用无菌组织培养育苗，待烟苗达到10cm左右后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期、或旺长期或现蕾期时取样，取中部第8-12片烟叶中的一片或多片烟叶；
步骤（2）、样品的制备
将步骤（1）的烟叶去除叶脉取叶片，在液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，然后进行冷冻干燥；
步骤（3）、红外扫描
取样磨粉压片，然后进行红外测试；扫描时自动扣除H2O和CO2的干扰，得到原始光谱依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱；
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，进行判定，当满足下列条件时，即可判定该烟草试材为黄化烟草，判定条件如下：
A、在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.22-0.31；
D、在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处同时出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进一步地，步骤（1）中，选用的原料品种为红花大金元烟叶。
进一步地，步骤（2）中，冷冻干燥的条件是：放入-80℃冷冻干燥机中，干燥24 hr。
进一步地，步骤（3）中，取样磨粉压片具体为：取样品粉末约2 mg，加入光谱纯溴化钾约100 mg混合研磨均匀后放入压片模具，8 t压力下保持2 min。
5、根据权利要求1所述的烟草黄化病诊断筛选方法，其特征在于：步骤（3）中，扫描次数为32次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000～400cm-1；每个样品进行3次测试求平均值来消除误差。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）本发明操作时间短，仅需要2min就可以高通量快速诊断分析，可以用于基因编辑素材的早期病害诊断和病害分析等的高通量初级筛选。
（2）本发明诊断结果准确，无需再经过后续复杂分析，即可判断出会黄化的烟叶，且能够涵盖所有烟草黄化的类型。采用定量分析，对诊断出的黄化烟叶和正常烟叶中的总糖、蛋白质、硝酸盐进行测定，定量分析测试结果与本发明判断结果一致；采用主成分分析的马氏距离判别模型对诊断出的黄化烟叶和正常烟叶进行分析，两类烟叶存在明显的边界，且间隔较大，具有较好的区分效果，表明本发明方法可以明显的将黄化烟叶与正常烟叶的将其区分。
（3）本发明方法可以在早期诊断出烟草是否为黄化烟草，进而及时进行相应的治疗，第一时间消除烟草黄化的风险，减少生产损失，节约人力物力，提高烟草的品质，具有重要的经济价值。
附图说明
图1为样品1和样品2的FTIR图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品1，按常规的无菌组织培养育苗，培养条件为一天光照16hr，温度25-28℃，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入现蕾期取样，取中部第8片烟叶。
步骤（2）、样品的制备
烟叶取好后，去除叶脉取叶片，用液氮环境下将烟叶放入玛瑙研钵，冷冻研磨为细粉，放入-80℃冷冻干燥机中，干燥24 hr。
步骤（3）、红外扫描
取样品粉末约2mg，加入光谱纯溴化钾约100 mg混合研磨均匀后放入压片模具，8t压力下保持2min，然后进行红外测试。
扫描次数为32次，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000～400cm-1，扫描时自动扣除H2O 和 CO2的干扰，每个样品进行3次测试求平均值来消除误差。
本实施例中，原始光谱采用Perkin-Elmer公司的专业红外光谱软件（Spectrum 10）依次进行吸光度、自动基线校正、归一化处理得相应的标准化光谱。样品图如图1所示。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品1在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品1在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.34；
D、样品1在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均没有出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而判断试样1为正常烟叶。由图1可知，该正常烟叶光谱存在五个吸收谱带，每个吸收谱带的分析结果如下：
（1）羟基（O-H）和氨基（O-H）伸缩振动吸收带（3050cm-1—4000cm-1）
正常烟叶在3342cm-1附近有一个极强且宽的吸收峰, 主要为来自烟叶中的多糖、蛋白质的羟基（O-H）和氨基（O-H）伸缩振动。
（2）甲基和亚甲基伸缩振动吸收带（2800cm-1-3050cm-1）
在这个带的主要吸收峰有3个：2857 cm-1、2928 cm-1和2959 cm-1，其中2928 cm-1和2959 cm-1来自烟叶中的多糖、蛋白质的甲基和亚甲基的不对称伸缩振动，2857 cm-1归属为甲基和亚甲基的称伸缩振动。
（3）酰胺和羰基振动吸收带（1500 cm-1-1800cm-1）
在这个带的主要吸收峰有3个：1734 cm-1、1622 cm-1和1531 cm-1，其中肩峰1734 cm-1附近的峰归属为脂类羰基的振动吸收，1622 cm-1附近的吸收峰主要是酰胺I带吸收，归属为C=O的伸缩振动，肩峰1531 cm-1附近的吸收是酰胺Ⅱ的振动吸收峰。
（4）混合振动吸收带（1200 cm-1-1500cm-1）
在这个带主要为蛋白质、木质素、脂肪酸和多糖的混合振动吸收区。1397 cm-1附近的吸收峰归属为C-H剪式振动吸收；1318 cm-1附近的峰为蛋白质、纤维素、木质素等受氧、氮原子影响的甲基和亚甲基对称弯曲振动及-CH3剪式振动吸收；1257 cm-1附近的吸收峰为木质素中苯羟基中C-O键的伸缩振动。
（5）多糖物质的特征吸收带（700 cm-1-1200cm-1）
在这个带中的多重峰指认为糖苷类物质的-OH伸缩振动和碳氧键伸缩振动。1151 cm-1归属为纤维素(β-1.4)葡萄糖单元的振动吸收，1077 cm-1附近的吸收峰归属为碳水化合物的C-O伸缩振动峰，1051 cm-1归属为为碳水化合物O-H和C-OH的伸缩振动峰。
实施例2
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品2，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入现蕾期取样，取中部第9片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同，样品图如图1所示。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品2在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品2在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.22；
D、样品2在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
由图1可知，与实施例1做对比，相对于正常烟叶，黄化烟叶在糖物质的特征吸收带和羟基氨基伸缩振动吸收带的吸收峰明显降低，而在酰胺和羰基振动吸收带变化很少。这表明黄化烟叶中，糖类物质明显低于正常烟叶，而蛋白质类含量差异不明显。糖类物质的降低，这可能是由于烟叶黄化后不能进行正常的光合作用，因此影响了糖类等碳水化合物积累；而蛋白质含量基本不变，可能是由于该编辑位点对蛋白质代谢基本无影响。
同时，黄化烟叶在1384 cm-1和829 cm-1处出现明显的吸收峰，他们分别对应的是硝酸盐中N-O伸缩振动吸收峰，以及N-O变形振动吸收峰，表明黄化烟叶中出现了硝酸盐的富集。
烟叶中硝酸盐的富集可以作为该类型黄化病初级筛选标准，而1384 cm-1和829 cm-1附近处的峰可以作为烟叶黄化标志特征峰。
进而初步判断试样2为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样2为白化烟叶。其余与实施例1相同。
实施例3
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品3，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入成苗期取样，取中部第8-9片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品3在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品3在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.31；
D、样品3在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而初步判断试样3为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样3为淡黄绿烟叶。其余与实施例1相同。
实施例4
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品4，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期取样，取中部第8-10片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品4在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品4在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.24；
D、样品4在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而初步判断试样4为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样4为白黄烟叶。其余与实施例1相同。
实施例5
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品5，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入旺长期取样，取中部第8-12片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品5在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品5在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.27；
D、样品5在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而初步判断试样5为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样5为白绿烟叶。其余与实施例1相同。
实施例6
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品6，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入现蕾期取样，取中部第10-12片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品6在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品6在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.30；
D、样品6在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而初步判断试样6为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样6为斑叶。其余与实施例1相同。
实施例7
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品7，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入旺长期取样，取中部第11-12片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品7在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品7在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.35；
D、样品7在1382-1386 cm-1和827-832 cm-1处均未出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而判断试样7为正常烟叶。其余与实施例1相同。
实施例8
本实施例的烟草黄化病判定方法，包括如下步骤：
步骤（1）、样品的采集
以红花大金元烟叶为试材，标记样品8，按常规的无菌组织培养方法育苗，待烟苗达到10cm后，挑选长势和径高均一致的烟苗移栽到水培室，进入团颗期取样，取中部第8-10片烟叶。
步骤（2）-（3）与实施例1相同。
步骤（4）、结果分析判定
根据步骤（3）的标准化光谱，分析结果如表1所示，从表1可以看出：
A、样品8在1620-1624 cm-1和1527-1532 cm-1处分别出现酰胺I带和II带吸收峰；
B、样品8在1075-1079cm-1处出现多糖吸收I带吸收峰；
C、选用多糖吸收I带吸收峰的吸光度与酰胺I带的吸收峰的吸光度面积进行比较，即A糖I／A酰I，面积比为0.35；
D、样品8在1382-1386cm-1和827-832cm-1处均未出现明显硝酸盐的N-O收缩振动和变形振动吸收峰。
进而判断试样8为黄化烟叶，送研究所进一步分析，确定试样8为部分黄化烟叶。其余与实施例1相同。
表1 实施例1-8的分析检测结果
对实施例1、2的分析结果进行验证，采用YC/T159、YC/T249的测试方法对黄化烟叶与正常烟叶中总糖、蛋白质进行了测定，结果表明：黄化烟叶中总糖含量明显高于正常烟叶，其含量分别为6.52%、1.93%；蛋白质含量基本一致，分别为9.6%、10.3%。准确定量分析测试结果与采用FTIR对烟叶中相关化学成分变化分析结果一致。
采用YC/T 248的测试方法对黄化烟叶与正常烟叶中硝酸盐进行了测定，结果表明：黄化烟叶与正常烟叶中硝酸盐含量分别为0.05%、0.28%，黄化烟叶中硝酸盐含量明显升高，准确定量测试结果与采用FTIR对烟叶中相关化学成分变化分析结果一致。
可见，本发明方法能准确诊断烟草的黄化病情况，分析结果准确性高，检测周期短，通量高，具有推广应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。