利用倒置显微镜观察节肢动物卵的方法与流程

本申请涉及一种利用倒置显微镜观察节肢动物卵的方法。

背景技术

作为动物界中种类最多、数量最大的一个类群，节肢动物与人类的生命生产活动息息相关。胚胎发育是节肢动物生活史中极其重要的一个阶段，其胚胎发育过程、发育模式对于研究动物的进化有着重要的意义。目前对于小型节肢动物胚胎发育的观察，通常是将0.7％生理盐水或改良生理盐水置于载玻片上，然后将不同发育阶段的卵转移到载玻片上进行观察。

由于载玻片上生理盐水易蒸发、卵空间上无保护，加盖玻片时易引起卵破裂，所以上述方法观察的时间短，卵易受外力损伤。若要对卵的形态进行深入观察和研究，如：拍摄卵的高分辨率图像、进行卵的无损断面扫描重构三维结构或者观察卵细胞内荧光标记情况，就势必会用到微分干涉显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜等。而上述诸多显微镜在市面上主流多为倒置。因此使用常规制片方法难于进行观察研究。因此急需开发一种用于倒置显微镜观察节肢动物卵的方法。

技术实现要素：

为了克服在倒置显微镜下对小型节肢动物卵的发育进行观察、扫描、拍照以及在用显微镜观察过程中卵易被压坏、观察时间较短且无法观察其发育过程等问题。本申请提出了一种利用倒置显微镜观察节肢动物卵的方法，能够较长时间维持卵的活性，实现对卵发育过程中的较长时间的观察。

技术方案具体为：利用倒置显微镜观察节肢动物卵的方法，步骤如下：

(1)临时装片的搭建制作：采用搭建法，将20mm×20mm的盖玻片使用医用小砂轮切割成规格为20mm×5mm两枚小玻片2，后粘在一片干净的显微镜载玻片上，两枚小玻片的相隔18-22mm为宜；

(2)制备卵浮载剂：a，配置生理盐水溶液；b，将生理盐水、丙三醇按比例混合均匀，制成浮载剂4；c，将浮载剂用移液枪转移浮载剂4于显微镜载玻片3上；

(3)观察：将小型节肢动物卵5转移至浮载剂中，盖上盖玻片1进行观察。

其中，生理盐水的浓度为0.7％，生理盐水与丙三醇的混合比例为1：3。

本申请的有益效果：

1、可以实现使用倒置显微镜观察小型节肢动物的卵；

2、能够较长时间维持卵的活性，实现对卵发育过程中的较长时间的观察；

3、一个装片可以放置5-7枚卵样品，可以实现对不同卵的不同时期的显微观察和拍照，提升了处理各枚卵样品的效率；

4、相比传统的观察方法，使用本装置可以减小卵被压坏的风险；

5、本观察方法用于但不仅限于观察小型节肢动物的卵，还可用于其他组织如大型真菌子实体等样品的发育观察，使用范围宽泛；

6、本方法操作简便，构成材料易得，成本低廉，可复制性强。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的主要结构示意图；

图2是图1的俯视结构示意图；

图3是实际使用的示意图；

图4是现有传统方法步骤示意图，用0.7％的生理盐水作为浮载剂6；

图5为不同浮载剂对卵观察时间的影响，其中对照组中生理盐水与丙三醇的比例为100％：0；浮载剂a中生理盐水与丙三醇的比例为75％：25％；浮载剂b中生理盐水与丙三醇的比例为50％：50％；浮载剂c中生理盐水与丙三醇的比例为25％：75％；浮载剂d中生理盐水与丙三醇的比例为0：100％。

图6为48h后对照组和各试验组盖玻片的脱落情况，其中对照中生理盐水与丙三醇的比例为100％：0；浮载剂a中生理盐水与丙三醇的比例为75％：25％；浮载剂b中生理盐水与丙三醇的比例为50％：50％；浮载剂c中生理盐水与丙三醇的比例为25％：75％；浮载剂d中生理盐水与丙三醇的比例为0：100％。

图7为本发明实施例1制作后第3天的样品装片，在激光扫描共聚焦显微镜(clsm)20x物镜下，以激光扫描方式进行镜检观察的结果照片。在图5中，标尺为40μm。

图8为使用与实施例1同样的仪器和同样的条件，但采用常规方法制作的镜检观察的结果照片(作为图5的对照，比较不同样本装片制作方法在共聚焦显微镜下镜检观察的结果)。在图6中，标尺为40μm。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。应当说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，下述所用各成分的含量为重量百分比含量。

实施例1

利用倒置显微镜观察节肢动物卵的方法，图1至图3为该方法的配套装置。具体实施步骤如下：

(1)临时装片的搭建制作：取一片干净的20mm×20mm的盖玻片，用医用小砂轮切割成规格为20mm×5mm两枚小盖玻片，于一干净的载玻片上滴适量霍氏封固剂(hoyersmedium)，将小盖玻片粘贴在载玻片上，完成临时装片的搭建。两枚小盖玻片的距离相隔18-22mm为宜，小盖玻片中间为放置浮载剂的位置。搭建完毕的载玻片待干燥24-48h后即可使用；

(2)制备浮载剂：

a.准备氯化钠和丙三醇试剂，二者均为分析纯；

b.首先用氯化钠配制浓度为0.7％的生理盐水溶液；

c.取1份生理盐水、3份丙三醇于烧杯中均匀混合，制作完的浮载剂保存于白色试剂瓶中待用；

d.用移液枪取适量上述浮载剂，置于搭建好的显微镜载玻片上。

(3)观察：取小型节肢动物的卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片(20mm×20mm)，制成镜检玻片。将镜检玻片置于显微镜下进行观察。

试验例：

采用下面试验验证本发明的效果。首先制作搭建玻片。取一片干净的20mm×20mm的盖玻片，用医用小砂轮切割成规格为20mm×5mm两枚小盖玻片，于一干净的载玻片上滴适量霍氏封固剂(hoyersmedium)，将小盖玻片粘贴在载玻片上，完成临时装片的搭建。两枚小盖玻片的距离相隔18-22mm为宜，小盖玻片中间为放置浮载剂的位置。搭建完毕的载玻片待干燥24-48h后即可使用。

于光照培养箱内，选择形态规则、完整、新产出的跳虫的卵，在室温下进行对比试验。

对照组：配制0.7％的生理盐水，作为浮载剂制作常规玻片。取跳虫的新产卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片，制成试验玻片。

试验组a：取3份0.7％的生理盐水和1份丙三醇均匀混合后待用。用移液枪取适量浮载剂置于搭建玻片上，取跳虫的新产卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片，制成试验玻片。

试验组b：取等量的生理盐水和丙三醇均匀混合后待用。用移液枪取适量浮载剂置于搭建玻片上，取跳虫的新产卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片，制成试验玻片。

试验组c：取1份0.7％的生理盐水和3份丙三醇均匀混合后待用。用移液枪取适量浮载剂置于搭建玻片上，取跳虫的新产卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片，制成试验玻片。

试验组d：用移液枪取适量丙三醇作为浮载剂置于搭建玻片上，取跳虫的新产卵，清洗干净后小心转移至浮载剂中，排除气泡后轻轻盖上盖玻片，制成试验玻片。

将对照和试验玻片分别置于激光扫描共聚焦显微镜(clsm)下，以激光扫描方式进行镜检观察，并进行记录和拍照。观察结束后将玻片保存于室温条件下，分别于12h、24h、48h、72h后观察卵及玻片的情况，并与激光扫描共聚焦显微镜(clsm)下进行拍照记录。

对比试验结果如下：

用0.7％的生理盐水作为浮载剂的常规方法与试验组a、试验组b、试验组c和试验组d对卵的观察时间对比结果如图5所示。对照组与试验组a的卵持续的时间最短，12h后卵全部失水破裂。试验组d中12h后仅有53.33％的卵维持正常生理状态，其他发生了明显的失水变形皱缩现象，24h后仅有13.33％的卵正常，48h后全部皱缩。试验组b的卵24h内形态保持卵完好，形态保持不变，48h后33.33％的卵发生皱缩、破裂现象。试验组c的卵持续时间最长，48h后卵的形态仍然保持完好。

用0.7％的生理盐水作为浮载剂的常规方法与试验组a、试验组b、试验组c和试验组d在48h后盖玻片的脱落情况对比结果如图6所示。对照组与试验组a、试验组b的盖玻片48h后全部脱落，无法置于共聚焦显微镜下观察，试验组c和试验组d的盖玻片保持完好，无脱落现象，能够在共聚焦显微镜下正常观察。

总之，用常规方法制作的玻片12h后浮载剂蒸发，卵的形态发生改变，严重变形(图7)，并且盖玻片有脱落现象。用本申请的观察方法24h后卵的形态完整，盖玻片无脱落，72h后卵有部分卵能仍然保持正常形态(图8和表1)。和常规观察方法相比，本申请的观察方法效果更好，持续时间更长。

表1常规方法与本申请方法的观察结果比较

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。