本发明涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种基于au@ag核壳纳米粒子修饰电极用于检测甲胎蛋白的生物传感器。
背景技术
甲胎蛋白是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，成人由肝细胞产生，含量极低。血清中甲胎蛋白水平与肝癌、胚胎性肿瘤及部分肝外肿瘤相关，甲胎蛋白在肿瘤细胞中的表达具有高效性和特异性的特点，其含量与病情的严重程度密切相关。因此血清中甲胎蛋白含量不仅可作为原发性肝癌和畸胎瘤的早期诊断指标之一，也可作为疗效观察和愈后判断的指标。
目前甲胎蛋白的检测方法主要有荧光分析法、化学发光分析法、酶联免疫法、色谱分析法、酶标电泳法及放射免疫法等。然而大多数已报道的技术仍然具操作繁复，价格昂贵，无法实时检测等诸多问题。因此，发展快速灵敏的分析方法去定量检测甲胎蛋白对其相关肿瘤的早期发现、早期诊断，早期治疗、疗效观察以及愈后监控具有重大意义。电化学生物传感器具有检出限低、灵敏度高、操作简单、成本低廉等优点。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请提供了一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器及其制备方法。本发明首次利用具有可调电化学活性的au@ag核壳纳米粒子设计制备了一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器，该传感器操作便捷且具有极高的灵敏度。
本发明的技术方案如下：
一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器，所述传感器的制备方法包括如下步骤：
(1)au@ag核壳纳米粒子的制备；
(2)甲胎蛋白适配体修饰au@ag核壳纳米粒子；
(3)制备对氨基苯磺酸修饰裸玻碳电极；
(4)制备电化学生物传感器。
所述au@ag核壳纳米粒子的制备方法为：在室温下，将金纳米粒子溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮溶液与抗坏血酸溶液按比例混合，之后再加入硝酸银溶液，避光反应3h，离心水洗，制得au@ag核壳纳米粒子，之后定容形成au@ag核壳纳米粒子水溶液备用。所述金纳米离子的粒径为17.8±1.8nm；所述金纳米粒子溶液的粒子浓度为1×10-8mol/l；所述磷酸盐缓冲液的ph为7.4；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为0.5～5％，体积用量为400～4000μl；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2mol/l，体积用量为500～2000μl；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为1～5mmol/l，体积用量为0.1～10ml。
所述甲胎蛋白适配体修饰au@ag核壳纳米粒子的方法为：将步骤(1)制得的au@ag核壳纳米粒子溶液与甲胎蛋白适配体溶液同时加入tbe缓冲液中，振荡混匀后静置12h，之后离心、水洗收集沉淀后再定容备用。所述au@cu2o核壳纳米粒子溶液的浓度为1×10-8～10×10-8mol/l，体积用量为25～250μl；所述癌胚抗原适配体溶液的浓度为0.1～5μmol/l，体积用量为1～20μl；所述tbe缓冲液的浓度为0.05～0.5mol/l，体积用量为0.1～1ml；所述离心转速为6500r/min。
所述制备对氨基苯磺酸修饰的玻碳电极的方法为：首先用三氧化二铝抛光粉对裸玻碳电极进行抛光处理，用乙醇和超纯水超声清洗1分钟，干净后氮气吹干备用；然后在干净的玻碳电极表面电镀对氨基苯磺酸；最后将电极浸入五氯化磷溶液中活化30分钟，之后取出清洗干净备用。所述三氧化二铝抛光粉的粒径为1.0、0.5或0.3μm；所述电镀对氨基苯磺酸的体系为三电极体系，其参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；所述电镀对氨基苯磺酸的方法为循环伏安法，其扫描范围为-0.5～0.5v，扫描速度为100mv/s，扫描时间为30分钟；所述对氨基苯磺酸溶液的摩尔浓度为5～50mmol/l，体积用量为1～4ml；所述五氯化磷溶液的摩尔浓度为10～100mmol/l，体积用量为1～4ml。
所述制备电化学生物传感器的方法为：在步骤(3)所述的对氨基苯磺酸修饰的玻碳电极表面滴涂上与甲胎蛋白适配体互补的单链dna溶液，待室温下反应30～180分钟后用水冲洗干净后再在电极表面滴涂步骤(2)制得的适配体修饰的au@ag核壳纳米粒子溶液，同样反应20～120分钟后用水冲洗掉多余的反应物后备用；最后以修饰好的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂上不同浓度的甲胎蛋白溶液，根据所得的au@ag核壳纳米粒子的电化学氧化电流值与甲胎蛋白浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。所述与甲胎蛋白适配体互补的单链dna溶液的浓度为2～10μmol/l，体积用量为2～10μl；所述适配体修饰的au@ag核壳纳米粒子溶液的浓度为5×10-9～1×10-8mol/l，体积用量为2～10μl；所述用检测甲胎蛋白的体系为三电极体系，其参比电极为ag/agcl电极，对电极为铂丝电极；所述检测甲胎蛋白的方法为差分脉冲伏安法，其扫描范围为-0.2～0.6v；扫描速度为4mv/s；所述差分脉冲伏安法的电解质溶液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的ph为7.4；所述磷酸盐缓冲液的体积为2ml。
本发明有益的技术效果在于：
本发明可以通过对au@ag核壳纳米粒子的壳层厚度进行调控来系统调节其电化学响应信号的强弱；
本发明通过dna链间的碱基互补配对作用可以将au@ag核壳纳米粒子稳定地定量修饰到电极表面，由此可得到稳定且准确的电化学信号；
本发明au@ag核壳纳米粒子表面的甲胎蛋白适配体对甲胎蛋白具有特定的亲和性，因此该电化学生物传感器对甲胎蛋白的识别快速准确，具有很好的特异性。
附图说明
图1是本发明实施例1制得au@ag核壳纳米粒子的透射电镜图。
图2是本发明实施例1制得的电化学生物传感器对甲胎蛋白测定的工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器，所述传感器的制备方法包括如下步骤：
(1)au@ag核壳纳米粒子的制备：取粒径为17.8±1.8nm的金纳米粒子，取20ml在8000r/min条件下离心10分钟后浓缩10倍重溶于2ml超纯水中。取4ml，ph＝7.4的磷酸盐缓冲液和2ml浓度为1％(wt％)的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，之后向其中加入2ml金纳米粒子溶液和1ml浓度为0.1mol/l的抗坏血酸溶液，最后加入6.4ml浓度为3mmol/l的硝酸银溶液，均匀振荡条件下反应3小时后得到au@ag核壳纳米粒子，离心水洗后定容为1ml备用。所得au@ag核壳纳米粒子的透射电镜图如图1所示，由图1可以看出合成的au@ag核壳纳米粒子具有明显的核壳结构，其粒径为48.7±3.4nm，相应的壳层厚度约为15.5±2.6nm。
(2)甲胎蛋白适配体修饰au@ag核壳纳米粒子：向100μl浓度为0.5mol/l的tbe缓冲液中加入50μl制备好的au@ag核壳纳米粒子溶液和20μl浓度为200nmol/l的甲胎蛋白适配体溶液，振荡混匀后静置12小时，之后通过离心水洗后重新用超纯水定容为50μl备用。
(3)对氨基苯磺酸修饰裸玻碳电极：首先将裸玻碳电极分别用1.0，0.5和0.3μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用乙醇和超纯水分别超声清洗1分钟后用氮气吹干。然后将处理好的具有光滑镜面的裸玻碳电极用作工作电极，饱和甘汞电极用作参比电极，铂丝电极用作对电极，在浓度为20mmol/l的对氨基苯磺酸溶液中进行循环伏安曲线扫描，扫描范围为-0.5～0.5v，扫描速度为100mv/s，扫描30分钟结束后用超纯水冲洗干净已镀上对氨基苯磺酸的玻碳电极，最后将其浸入2ml浓度为40mmol/l的五氯化磷溶液中活化30分钟后取出清洗干净备用。
(4)电化学生物传感器的构建：首先在步骤(3)所述的对氨基苯磺酸修饰的玻碳电极表面滴涂上5μl浓度为10μmol/l与甲胎蛋白适配体互补的单链dna溶液，待反应2小时后用水冲洗干净后再在电极表面滴涂上5μl如步骤(2)所述的适配体修饰的au@ag核壳纳米粒子溶液，同样反应2小时后用水冲洗掉多余的反应物后备用。然后在玻碳电极表面滴涂上5μl不同浓度的甲胎蛋白溶液反应2h后用超纯水冲洗干净电极，以修饰好的玻碳电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极扫描差分脉冲伏安曲线，其扫描范围为-0.2～0.6v；扫描速度为4mv/s，电解质溶液为2ml，ph＝7.4的磷酸盐缓冲液。根据所得的au@ag核壳纳米粒子的电化学氧化电流值与甲胎蛋白浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。工作曲线如图2所示，由图2可知该方法的检测范围为1～100pg/ml。
(5)电化学生物传感器的实际应用：该电化学传感器的准确度通过测量无锡第四医院肝癌患者血液中甲胎蛋白的浓度来验证：首先将2ml肝癌患者的血液以400g的转速离心5分钟后得到1ml血清，用pbs溶液稀释至2ml备用；通过化学发光免疫分析仪测量得到其中afp的浓度，将其稀释到20pg/ml，取5μl制备好的稀释血清试样滴加到au@ag核壳纳米粒子修饰的电极上，参考步骤(4)进行电化学检测，平行测定3组，测得其中甲胎蛋白的含量为20.6pg/ml,误差为3％，检测结果比较准确。
实施例2
参照实施例1步骤，制备一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器，将其应用于临床试验：
首先将2ml肝癌患者的血液以400g的转速离心5分钟后得到1ml血清，用pbs溶液稀释至2ml备用；然后通过化学发光免疫分析仪测量得到其中afp的准确浓度，将其稀释到45pg/ml，取5μl制备好的稀释血清试样滴加到au@ag核壳纳米粒子修饰的电极上，参考步骤(4)进行电化学检测，平行测定3组，测得其中甲胎蛋白的含量为44.2pg/ml，误差为1.8％，检测结果比较准确。
实施例3
参照实施例1步骤，制备一种检测甲胎蛋白的电化学生物传感器，将其应用于临床试验：
首先将2ml肝癌患者的血液以400g的转速离心5分钟后得到1ml血清，用pbs溶液稀释至2ml备用。然后通过化学发光免疫分析仪测量得到其中afp的准确浓度，将其稀释到75pg/ml，取5μl制备好的稀释血清试样滴加到au@ag核壳纳米粒子修饰的电极上，参考步骤(4)进行电化学检测，平行测定3组，测得其中甲胎蛋白的含量为72.8pg/ml，误差为2.9％，检测结果比较准确。